методом мас-спектрометрії в режимі електроспрей іонізації вивчені продукти екстракції кореня аралії маньчжурської у середовищі субкритичного води. Наявність і концентрація аралозидов А, В і С, в отриманих екстрактах визначені методами по-тенціометріческого титрування і високоефективної рідинної хроматографії із застосуванням ВЕРХ / МС. З використанням розроблених методик ідентифікації хроматографічних піків процес екстракції аралозидов з кореня аралії маньчжурської у середовищі субкритичного води вивчений і оптимізований.

Анотація наукової статті з хімічних наук, автор наукової роботи - Борисенко Сергій Миколайович, Руднєв Михайло Іванович, Борисенко Роман Миколайович, Тихомирова Карина Сергіївна, Борисенко Микола Іванович


Aralia Manchurian root products of extraction in subcritical water medium have been investigated by electrospray ionization mass spectrometry. Both potenciometric titration and high performance liquid chromatography were applied to detect the concentration of aralosides A, B, C in the extract. Using developed methods of chromatographic peaks identification, aralosids extraction process from Aralia Manchurian root in subcritical water medium has been studied and optimized.


Область наук:

  • хімічні науки

  • Рік видавництва: 2009


    Журнал: Известия вищих навчальних закладів. Північно-Кавказький регіон. Природні науки


    Наукова стаття на тему 'Мас-спектроскопія екстрактів кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води'

    Текст наукової роботи на тему «Мас-спектроскопія екстрактів кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води»

    ?УДК 542.61.35 + 547.918

    Мас-спектрометрії ЕКСТРАКТІВ КОРЕНЯ аралії маньчжурської

    В СЕРЕДОВИЩІ субкритичного ВОДИ

    © 2009 р С.Н. Борісенко1, М.І. Руднев1, Р.Н. Борісенко1, К.С. Тіхомірова1, Н.І. Борісенко2, Е.В. Ветрова1, Е.В. Максіменко2, Д.В. Зімаков3

    1Научно-дослідний інститут

    фізичної та органічної хімії Південного федерального університету, пр. Страйки 194/2, Ростов н / Д, 344090,'е11 @ 1рос. sfedu.ru

    2Еколого-аналітичний центр Південного федерального університету, пр. Страйки 194/2 Ростов н / Д, 344090

    3Южний науковий центр РАН вул. Чехова, 41, Ростов н / Д, 344006

    1The Institute of Physical and Organic Chemistry of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/2, Rostov-on-Don, 344090, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    2Ecoanalytical Center of Southern Federal University Stachki Ave, 194/2, Rostov-on-Don, 344090

    3Southern Scientific Center of RAS, Chehov St., 41, Rostov-on-Don, 344006

    Методом мас-спектрометрії в режимі електроспрей іонізації вивчені продукти екстракції кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води .. Наявність і концентрація аралозидов А, В і С, в отриманих екстрактах визначені методами по-тенціометріческого титрування і високоефективної рідинної хроматографії з застосуванням ВЕРХ / МС. З використанням розроблених методик ідентифікації хроматографічних піків процес екстракції аралозидов з кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води вивчений і оптимізований.

    Ключові слова: високоефективна рідинна хроматографія, мас-спектрометрія, субкритичного вода, тритерпенові глікозиди, аралія маньчжурська, аралозіди.

    Aralia Manchurian root products of extraction in subcritical water medium have been investigated by electrospray ionization mass spectrometry. Both potenciometric titration and high performance liquid chromatography were applied to detect the concentration of aralosides A, B, C in the extract. Using developed methods of chromatographic peaks identification, aralosids extraction process from Aralia Manchurian root in subcritical water medium has been studied and optimized.

    Keywords: high-performance liquid chromatography, mass spectrometry, subcritical water, triterpenoid glycoside, aralia mandshurica, araloside.

    Вступ

    Тритерпенові глікозиди залишаються класичними об'єктами дослідження завдяки широкому спектру їх біологічної активності і розвитку методів виділення і аналізу продуктів рослинного походження. Типовим прикладом таких глікозидів служать біологічно активні речовини з коренів аралії маньчжурської Aralia mandshurica Rupr. et Maxim. -аралозіди А, В і С (I) (рис. 1), що представляють собою глікозиди олеанолової кислоти [1]. Суміші цих Арало-зідов є діючими речовинами настоянки аралії і таблеток «Сапарал», що застосовуються в якості тонізуючого і імуномодулюючої кошти, і близьких по лікувальній дії до препаратів з женьшенем [2]. Вихідним продуктом для лікарських засобів з аралії є концентрат «Сапарал» (ФС 42-1924-82) - аморфний порошок кремового кольору без запаху з вмістом суміші аралозидов А, В і С (I) не менше 80%. Класична схема екстракції включає застосування в якості екстрагентів і реагентів метанолу, етилацетату, н-бутанолу, активованого вугілля, соляної кислоти і гідроксиду амонію [3], що при-

    водить до необхідності регенерації і утилізації значної кількості розчинників і адсорбентів.

    Мал. 1. Структурна формула аралозидов А (Я! = Ь-арабиноза, = Н), В (Я! = Ь-арабиноза, Я2 = Ь-арабиноза) і С (Я.! = Б-галактоза, Я2 = Б-ксилоза)

    Відомо, що вода в області критичної точки може виступати в якості реагенту, розчинника і каталізатора [4], в тому числі в субкритичного області температур (100 - 374 оС) і тисків менш 220-105 Па [5]. Поєднання властивостей води як найбільш еконо-

    мически доступного і екологічно чистого розчинника відкриває шлях до розвитку нової методики отримання аралозидов з кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води. Розробка відповідної методики отримання аралозидов - одна з основних цілей даної роботи. При цьому найважливішою її частиною є розробка ефективних методик встановлення якісного і кількісного складу отриманих в середовищі субкритичного води сумішей з використанням високоефективної рідинної хроматографії з МС детектированием.

    експериментальна частина

    150 ^ 4 мм, ізократіческій режим елюювання 0,01 N сірчана кислота / ацетонітрил в співвідношенні 65:35 при температурі 40 ° С і швидкості потоку 0,8 мл / хв, час хроматографирования 10 хв.

    Якість вихідних коренів аралії маньчжурської відповідало вимогам ГФХ XI, т. 2, стаття 65 «Коріння аралії маньчжурської».

    Як стандарт суміші аралозидов використаний концентрат препарату «Сапарал» (ФС 42-1924-82) виробництва ЗАТ «Віфітех» із загальним вмістом аралозидов 80,2% в перерахунку на сухий препарат.

    Результати та їх обговорення

    Екстракція аралозидов з коренів аралії в середовищі субкритичного води проведена в статичному режимі. У герметичний реактор з нержавіючої сталі ємністю 10 см3 поміщали наважку сухого середньо подрібненого кореня аралії і додавали вибраний обсяг води; герметично закритий реактор витримували в термостат при температурі 140 ± 2 ° С 1 ч. Потім реактор охолоджували, осад разом із залишками коренів фільтрували на паперовому фільтрі (синя стрічка); водний фільтрат пропускали через хромато графічну колонку (h = 20 см, 0 = 1 см) c оксидом алюмінію для хроматографії; фракцію аралозидов відокремлювали від смол і баластних речовин Елюювання третьому сумішшю ацетонітрил / вода в співвідношенні 35:65. Після розпарювання із застосуванням роторного випарника (температура розпарювання не більше 40 оС) отримано сипучий порошок коричневого кольору без запаху. Зміст аралозидов в отриманому екстракті визначено методом потенціометричного титрування та склало 12,42 ± 0,27% від суми аралозидов, вологість - 7,2% після висушування при температурі 102 ± 2 ° С до постійної ваги.

    Наявність і концентрація аралозидов А, В і С в отриманих екстрактах визначені методом потенції-метричного титрування відповідно до вимог ГФХ XI, т. 2, ст. 65 «Коріння аралії маньчжурської», а також методом високоефективної рідинної хроматографії з застосуванням ВЕРХ / МС комплексу «Thermo Finnigan MSQ Surveyour», колонка ODS Cj8 5 мкм 150 ^ 2,1 мм, градиентное елюювання ацетонитрил-вода від 5 до 95 об. % При температурі 40 ° С і швидкості потоку 0,4 мл / хв; іонізація електроспреем при напрузі на конусі - 70 В; тривалість хроматограми - 25 хв. Молекулярна маса і фрагментація аралозидов досліджені з застосуванням тандемного МС'-спектрометра «Thermo Fin-nigan LCQ Deca XP Max» з іонізацією електроспреем при позитивній полярності [6]; використаний пряме введення екстракту проби зі швидкістю 5 мкл / хв; напруга на конусі оптимізовано для кожного з'єднання; спектри МС / МС і МС / МС / МС отримували із застосуванням іонної пастки і нормалізованої енергії зіткнень, що забезпечує відтворюваність результатів для різних МС-спектро-метрів; величини заряду іонів визначали з використанням функції ZoomScan.

    Паралельно з ВЕРХ / МС комплексом використаний рідинний хроматограф «Thermo Separation Products» з УФ-детектором з детектуванням при довжині хвилі 206 нм, колонка Cromasil Q8 5 мкм

    Класичний екстракт аралозидов отриманий за методикою [7] екстракцією метанолом. На рис. 2а представлена ​​хроматограмма рутинного (метанольного) екстракту з кореня аралії (з УФ-детектором з детектуванням при довжині хвилі 206 нм, колонка Croma-sil Q8 5 мкм 150 ^ 4 мм).

    Мал. 2. Хроматограми екстрактів з кореня аралії: а - рутинний СН3ОН-екстракт по методиці [7]; б - екстракт субкритичного водою в статичному режимі. Аралозиди представлені піками з часом утримування 4,8 ^ 4,9,

    5,78 ^ 5,79 і 6,48 хв (ізократіческій режим, з УФ-детектором з детектуванням при довжині хвилі 206 нм, колонка Cromasil С18 5 мкм 150x4 мм)

    Екстракція аралозидов з коренів аралії проведена субкритичного водою в статичному режимі. На рис. 2б представлена ​​хроматограмма отриманого в середовищі субкритичного води екстракту з кореня аралії при тих же умовах хроматографування.

    Спектр інфрачервоного поглинання суспензії екстракту в вазеліновій олії містить широкі смуги поглинання в області 1660-1620 см-1, характерною для солей карбонових кислот, і області 3400-3200 см-1, характерною для асоційованих гідроксильних груп вуглеводних фрагментів; смуга поглинання складноефірного карбонила при атомі С-28 в структурі I (рис. 1) розташована при 1732 см-1 і має слабку інтенсивність, що підтверджує переважання баластних речовин в отриманому екстракті [8].

    Спектр електронного поглинання розчину екстракту у воді при рН 7 має два максимуми поглинання: гострий і інтенсивний при 206 нм і більш широкий в районі від 250 до 340 нм; крива поглинання відповідає наявності неспряженість подвійного зв'язку при атомах С-12 і карбонільної групи при С-28 в структурі I [9] (рис. 1).

    Ідентифікація аралозидов, отриманих екстракцією в умовах субкритичного води, виконана із застосуванням спектроскопії ЯМР 1Н. Для отримання з метою їх подальшої ідентифікації індивідуальних речовин екстракт розділений на фракції з застосуванням полупрепаратівной ВЕРХ-колонки «Cromasil 018» 5 мкм 150x4,2 мм (хроматограму см. На рис. 2б). У кожній з 3 отриманих фракцій зафіксовано наявність в спектрі ЯМР 1Н, 7 синглетів інтенсивністю по 3Н кожен при з 0,84, 0,89, 0,96, 0,98, 0,99, 1,10 і 1,21, що відповідає 7 метильних груп: Ме-26, Ме-24, Ме-30, Ме-29, Ме-23, Ме-25 і Ме-27 структури I. Присутність р-глюкозного фрагмента при карбонільної групі С-28 агликона I доведено аномерного сигналом при з 5,42 (1Н, d, J = 7,5 Гц).

    З [10] відомо, що деякі тритерпенові сапоніни можуть бути термічно нестійкими. Так, наприклад, соєвий сапонін pg кількісно перетворюється в сапоніни I і V при нагріванні в розчині при температурі вище 80 ° С протягом 5 год або в кислих або лужних розчинах при кімнатній температурі. Подвійні зв'язку деяких стеринів порівняно легко піддаються хімічним перетворенням, наприклад, холестерин у ссавців перетворюється в Дігідрохолестерін, який у вигляді цис-конформера (копростанол) виводиться з організму [11].

    Оскільки в процесі екстракції в середовищі субкритичного води аралозіди піддаються впливу високих температур і тисків, існує можливість супроводу даного процесу ізомеризації або окислювально-відновними реакціями агликона. Нами вивчена можливість ізомеризації фрагмента Олеа-ноловой кислоти в виділених аралозіди структури I в середовищі субкритичного води. Отримано, що стереохіміче-скі інформативні константи спін-спінової взаємодії фрагментів ^ Н ^ СН ^^

    ПнаНа = 13,5 ГЦ, J

    18CH-19CHaxHeq І

    JHeqHeq = 3,8 Гц),

    5CH-6CHaxHeq підтверджують орієнтацію при атомах С-3 і С-18, а також транс-конфігурацію кілець А і В, що узгоджується з [12, 13] і відкидає припущення про можливу ізомеризації фрагмента олеанолової кислоти.

    Наявність в екстракті аралозидов А, В і С з характерними молекулярними масами (926, 1058 та тисячі вісімдесят-вісім) доведено з використанням рідинної хроматографії з мас-спектральним детектором. Так як кожен аралозіди містить фрагмент глюкуронової кислоти, і виділення аралозидов проведено у формі солей амонію, то хроматограмма екстракту аралозидов містить 3 характерних ізохронних групи піків однозарядних катіонів: М + H +, M + NH4 + і M + Na +, тобто [М + 1] +, [М + 18] + і [М + 23] +. З'єднання з катіонами, що мають m / z = 927, 944 і 949, ідентифіковані як аралозіди А (MW = 926) з m / z = = 1059; 1076 і 1081 - як аралозіди В (MW = 1058), з m / z = 1089; 1106 і 1111 - як аралозіди С (MW = 1088) (рис. 3). Відносний вміст аралозидов А, В і С визначено методом нормування і склало А: В: С = 57: 27: 16.

    У цій же хроматограмме виявлений незначний (до 4% від суми аралозидов А, В і С) пік Арало-зида з молекулярної масою 1118, що відповідає брутто-формулою С54Н86О24 і відрізняється від Арало-зида З додаванням СН2О-фрагмента в R2 структури I. Імовірно , це може бути 4-й аралозіди, вперше виявлений в 1998 г. [14] в коренях аралії близького виду Aralia dasyphylla. Вичерпна ідентифікація цього з'єднання в екстракті з коріння аралії маньчжурської вимагає продовження досліджень.

    З використанням розроблених методик ідентифікації хроматографічних піків процес екстракції аралозидов з кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води був вивчений і оптимізований. На ефективність запропонованого процесу отримання суміші аралозидов впливають добавки в воду аміаку, температура процесу, тривалість екстракції і співвідношення сировина: екстрагент. На рис. 2б представлена ​​типова хроматограмма екстракту аралозидов з кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води, отримана в статичному режимі з оптимізованими параметрами.

    З таблиці і рис. 2б слід, що екстракція субкритичного водою в статичному режимі дозволяє отримати в 1,9 рази більше аралозидов А, В і С, ніж традиційний метод екстракції метанолом.

    Порівняння методів екстракції аралозидов з кореня аралії маньчжурської (n = 6)

    Метод екстракції Екстрагент Час, хв Температура, оС Вихід аралозидов з 1 г сировини Ефективність вилучення **

    мг / г *% *

    Традиційний Метанол 180 65 23,6 ± 2,6 2,4 1

    Субкритичного вода Вода 60 140 30,1 ± 4,5 2,9 1,3

    Субкритичного вода + аміак 1% -й водний розчин аміаку 60 140 43,4 ± 3,4 4,4 1,9

    З: №і1 tnjmcraf * ului..Ж-1 UM

    платами ws л рм

    J6-I lfl-a PJiW ІТ: Ml AV: 1 KL l.MB F: -РДЧ- З ESI niora >№7T] JI »ІПЧММС RH ПЧ | тЛ01ЖЦ

    UXh

    Iw]

    I Hb

    11ЯЛ

    11ПГЛ

    IHM

    1ЮЦ

    t№!

    J »i.T

    -1-1-1-Г-

    11 in .Ii

    11ШЛ 11114 I, I 111JT 111ТЛ

    I 1 I I I 'I I I II I I

    11Z12

    113м)

    10H

    l№

    ttm

    14HS

    1HO

    11 »

    111G

    HIB

    11 »

    ЧИ

    mH

    MfcMhJtUi-'l-iM ilSM-lMf KT iMfrlPJ »HW i M.-JJOSi F: [M» + tE5i ™ mi5Hrraj (B ІЧКЬГОРШгтніІННЗГОІП

    1 «:

    I I

    1 №

    1№4

    | 1В4І

    «« 3

    1 (1 ».J

    I. 1ІІ iflHi ім'я. iflw-i

    || || I 11 || I 11 I I I --1 | I I ч 4 I. I 11 I I '., ... ............ I >||

    Ч-Т 1 «0

    1057.3

    l№iJQ

    miiKirj "11І-, над

    | || | 11І1 ii il Ii i i || 1Д ^ *! | || i ||||| |||||| | | || || | || ||| | | ||

    над

    1D№

    Kfl

    1ГНС

    11 »

    111D

    11 »

    11H

    11 «

    HU

    «TeUlltH 11 -07-2 * 13» FT В Л AT. 1 №І.ИИ P (C.U) + еВДда ^ і dtJIHbDU Flirra [ІІЩ-ІІЩ

    1І>Е! н i

    | 4fr

    ! »

    8ltl tim Slfr.1 * т-i-i-i- | -i-i-i-i- | -i-i-i-r *

    SIC

    rao

    Щ5

    I їм

    V-'i "-" Г SLHI

    B-JC.J «ал

    M3i

    ОД1

    NiF

    :

    -1-i-i-i --- i- ВД5 MD

    mil

    iii-

    "J" ЕМД ІМ «ГД

    "F- * їм

    B4G

    Sso

    SS5

    BW

    а

    б

    в

    Мал. 3. Мас-спектри аралозидов А, В і С, екстрагованих з кореня аралії маньчжурської в умовах субкритичного води: а - аралозіди А з часом утримування 9,45 хв; б - аралозіди В з часом утримування 11,00 хв; в - аралозіди З з часом утримування 8,81 хв. (Градієнтний режим). Для кожного аралозіди характерні катіони [М + Н] +, [М + МН4] + і [М + Иа] +

    Цей результат можна пояснити тим, що в субкритичних умовах відбувається як більш ефективне проникнення розчинника в глиб міцели, так і часткове руйнування клітин рослини, що сприяє вилученню аралозидов. Додавання невеликої кількості аміаку дозволило перевести суміш різних солей аралозидов в водорастворимую амонійну сіль. При цьому слід зазначити, що і чиста вода без домішки аміаку в субкритичних умовах дозволяє витягти більшу кількість аралозидов в порівнянні з традиційним методом. Важливо також, що в субкритичних умовах процес екстракції аралозидов йде в 3 рази швидше, до того ж з використанням екологічно безпечного розчинника - води. В силу усього вищевикладеного можна говорити про переваги Кекст ракции Арало-зідов в субкритичного умовах в порівнянні з традиційними методами.

    1. Методом мас-спектрометрії в режимі електроспрей іонізації вивчені продукти екстракції кореня аралії маньчжурської в середовищі субкритичного води.

    2. Наявність і концентрація аралозидов А, В і С в отриманих екстрактах визначені методом високоефективної рідинної хроматографії з застосуванням ВЕРХ / МС з іонізацією електроспреем.

    3. Показано, що екстракція аралозидов А, В і С в середовищі субкритичного води відбувається без істотної ізомеризації агликона.

    4. Ефективність екстракції субкритичного водою в статичному режимі порівнянна по ефективності з традиційним методом, а при використанні добавки аміаку перевершує традиційний метод в 1,9 рази.

    Робота виконана в науково-освітньому Еко-лого-аналітичному центрі Півдня Росії ПФУ за фінансової підтримки Фонду СКОБ і Міністерства освіти РФ по російсько-американською програмою «Фундаментальні дослідження і вища освіта» і програмою «Розвиток наукового потенціалу вищої школи» Рососвіти РФ (проекти РНП 2.2.2.2.3915, ВР3С04, ВР4М04).

    література

    1. Ботаніко-фармакологічний словник / під ред. Блінової К.Ф. і Г.П. Яковлєва М., 1990. 166 с.

    2. Машковский М.Д. Лікарські засоби. М., 1985. Т. 1. 141 с.

    3. Мініна С.А., Каухова І.Є. Хімія і технологія фітопрепаратів. М., 2004. С. 460-464.

    4. Галкін А.А., Лунін В.В. Вода в суб-і сверхкритическом станах - універсальне середовище для здійснення хімічних реакцій // Успіхи хімії. 2005. № 1. С. 24-40.

    5. Walton R. Subcritical solvothermal synthesis of condensed inorganic materials // Chem. Soc. Rev. 2002. Vol. 31. P. 230-238.

    6. Список прийнятих скорочень російських і англійських термінів // Мас-спектрометрія. 2004. Т. 1, № 1. С. 77-78.

    7. Мальчуковскій Л.Б., Лібізов Н.І. Визначення три-терпенових сапонінів в порошку і таблетках «Сапарал» // Фармація. 1971. № 2. C. 68-71.

    Надійшла до редакції

    8. Сміт А. Прикладна ІК-спектроскопія. Основи, техніка, аналітичне застосування. М., 1982. С. 217-222, 300-318.

    9. Сільверстейн Р., Басслер Г., морив Т. спектрометричного ідентифікація органічних сполук. М., 1977. С. 422-427.

    10. Quantification of the group B soyasaponins by highperformance liquid chromatography / J. Hu [et al.] // J. Agric. Food Chem. 2002. Vol. 50. P. 2587-2594.

    11. Пилипович Ю.Б. Основи біохімії. М., 1999. 380 c.

    12. High-Resolution 'H and 13C NMR of Glycyrrhizic Acid and Its Esters / A. Baltina [et al.] // Chem. of Natural Compounds. 2005. Vol. 41, № 4. P. 432-435.

    13. Constituents of Chenopodium pallidicaule (Canihua) Seeds: Isolation and Characterization of New Triterpene Saponins / L. Rastrelli [et al.] // J. Agric. Food. Chem., 1996. Vol. 44. P. 3528-3533.

    14. A Cytotoxic Triterpene Saponin from the Root Bark of Aralia dasyphylla / Kai Xiao [et al.] // J. Nat. Prod. 1999. Vol. 62. P. 1030-1032.

    2 березня 2009 р.


    Ключові слова: високоефективна рідинна хроматографія /Мас-спектрометрії /субкритичного вода /тритерпенові глікозиди /аралія маньчжурська /аралозіди /High-performance liquid chromatography /Mass spectrometry /Subcritical water /Triterpenoid glycoside /Aralia mandshurica /araloside

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити