В даний час має місце зростання мікозів і мікоаллергозов, обумовлених мікроміцетами-патогенами, включаючи гриби роду Fusarium. При фузаріозом необхідна і суттєво значима розробка стандартних аллергодіагностіческіх тест-систем, що тягне за собою створення банку штамів грибів продуцентів специфічних, активних і стабільних алергенів. Нами розроблений спосіб поєднаної дії на штами F. javanicum var. radicicola (Fusarium j.v.r.) природної та індукованої селекції з диференціальної термообробкою. При цьому вивчені морфобіологічні маркери мінливості популяцій Fusarium j.v.r. і доведений результативний відбір типових клонів по морфології колоній і поступового зростання активності проростання суперечка (ПС) на кожному етапі багатоступеневої селекції гриба. При цьому показано, що на III-му етапі відбору, в результаті дії індукованої селекції, в популяції селекціоновані штаму (СШ) активність ПС зросла в результаті розширення діапазону відбору активних клонів до 100% (проти попереднього природного відбору до 80%). Із застосуванням штаму РКПГ 69/9/6/34, активного по маркеру ПС, на IV етапі багатоступеневої селекції зросли всі критерії мінливості в результаті поєднаної дії на штами Fusarium j.v.r. природної та індукованої селекцій. З популяції СШ на IV етапі відібрано 11 штамів з активністю ПС від 85 до 90%, що перевищують середню активність вихідного штаму (ІШ) на 61,5%. Селекціоновані штами специфічні, високоактивні, стабільні в ряді генерацій і рентабельні для використання в стандартних тест-системах в мікоаллергодіагностіке. Селекціоновані штами Fusarium j.v.r. депоновані в банку чистих культур грибів продуцентів алергенів в НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Журавльова Ніна Петрівна, Еліна Н.П., Васильєва Н.В., Фролова О.В., Соловйова Г.І.


MARKERS AT SPONTANEOUS AND INDUCED VARIABILITY OF STRAINS - MYCOALLERGO-PRODUCENTS FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA

In present time take place a growth of the pathogenic and allergic diseases caused by micromycetes-pathogens including spesies of Fusarium genus. At fusarioses a development of standard test systems for allergodiagnostics is necessary and essentially significance, that involve the creation of the bank of fungal strains producents of specific, active and stable allergens. We have developed the method of combinated actionof natural and induced selection with differential thermotreatment in Fusarium javanicum var. radicicola (Fusarium j.v.r.). Under this morphobiological markers of Fusarium j.v.r. population's variability have been studied and proved efficient selection of typical clones on morphology of colony and a gradual increase of spore germination (SG) activity at each step of a multistep fungal selection. It was shown, that on 3-ed step of the induced selection, as a result of action of differential thermal processing, activity of SG in populations of the selected strains increased significantly since induced selection considerably expanded the range of selection of active clones till 100 %. 11 strains from 4 th stage of multisteps selection had activity of SG from 85% to 90%, exceeds average activity of initial strain on 61,5%. The selected strains are specific, highly active, stable on the selected markers in a number of generations and profitable for the use in standard test systems in mycoallergodiagnostic. The selected strains of Fusarium j.v.r. are deposited in the Bank of pure fungal cultures producents of allergens in Kashkin Research Institute of Medical Mycology.


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2014


    Журнал

    Проблеми медичної мікології


    Наукова стаття на тему 'МАРКЕРИ СПОНТАННОЇ та індукованої МІНЛИВІСТЬ ШТАМІВ - МІКОАЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТОВ FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA '

    Текст наукової роботи на тему «МАРКЕРИ СПОНТАННОЇ та індукованої МІНЛИВІСТЬ ШТАМІВ - МІКОАЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТОВ FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA »

    ?УДК 616-002.828: 161-056.3

    МАРКЕРИ СПОНТАННОЇ та індукованої МІНЛИВІСТЬ ШТАМІВ - МИКО-АЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТОВ FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA

    журавлева Н.П. (В.н.с.) *, Еліна Н.П. (Професор кафедри), Васильєва Н.В. (Директор інституту, зав. Кафедрою), фролова Є.В. (Зав. Лаб.), Соловйова Г.І. (В.н.с.)

    НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина, Північно-Західний державний медичний університет ім. І.І. Мечникова, Санкт-Петербург, Росія

    © Колектив авторів, 2014

    В даний час має місце зростання мікозів і мікоал-лергозов, обумовлених мікроміцетами-патогенами, включаючи гриби роду Fusarium. При фузаріозом необхідна і суттєво значима розробка стандартних аллергодіагностіческіх тест-систем, що тягне за собою створення банку штамів грибів - продуцентів специфічних, активних і стабільних алергенів.

    Нами розроблений спосіб поєднаної дії на штами F. javanicum var. radicicola (Fusarium j.v.r.) природної та індукованої селекції з диференціальної термообробкою. При цьому вивчені морфобіологічні маркери мінливості популяцій Fusarium j.v.r. і доведений результативний відбір типових клонів по морфології колоній і поступового зростання активності проростання суперечка (ПС) на кожному етапі багатоступеневої селекції гриба.

    При цьому показано, що на III-му етапі відбору, в результаті дії індукованої селекції, в популяції селекціоновані штаму (СШ) активність ПС зросла в результаті розширення діапазону відбору активних клонів до 100% (проти попереднього природного відбору до 80%). Із застосуванням штаму РКПГ 69/9/6/34, активного по маркеру ПС, на IVетапе багатоступінчастої селекції зросли всі критерії мінливості в результаті поєднаної дії на штами Fusarium j.v.r. природної та індукованої селекцій.

    З популяції СШ на IV етапі відібрано 11 штамів з активністю ПС від 85 до 90%, що перевищують середню активність вихідного штаму (ІШ) на 61,5%.

    Селекціоновані штами специфічні, високоактивні, стабільні в ряді генерацій і рентабельні для використання в стандартних тест-системах в мікоаллергодіагностіке.

    Селекціоновані штами Fusarium j.v.r. депоновані в банку чистих культур грибів - продуцентів алергенів в НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина.

    Ключові слова: активність проростання суперечка, аллергопро-дуцент, спонтанна і індукована селекція, типовість морфології колоній, Fusarium javanicum var. Radicicola

    Контактна особа: Журавльова Ніна Петрівна, Тел .: (812) 303-51-40

    MARKERS AT SPONTANEOUS AND INDUCED VARIABILITY OF STRAINS -MYCOALLERGO-PRODUCENTS FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA

    Zhuravleva N.P. (Leading scientific collaborator), Yelinov N.P. (Professor of the chair), vasilyeva N.v. (Director of the institute, head of the chair), Frolova E.V. (Head of the laboratory), solovjova G.I. (Leading scientific collaborator)

    Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I.Mechnikov, St. Petersburg, Russia

    © Collective of authors, 2014

    In present time take place a growth of the pathogenic and allergic diseases caused by micromycetes-pathogens including spesies of Fusarium genus. At fusarioses a development of standard test systems for allergodiagnostics is necessary and essentially significance, that involve the creation of the bank offungalstrains -producents of specific, active and stable allergens.

    We have developed the method of combinated actionof natural and induced selection with differential thermotreatment in Fusarium javanicum var. radicicola (Fusarium j.v.r.). Under this morphobiological markers of Fusarium j.v.r. population's variability have been studied and proved efficient selection of typical clones on morphology of colony and a gradual increase of spore germination (SG) activity at each step of a multistep fungal selection.

    It was shown, that on 3-ed step of the induced selection, as a result of action of differential thermal processing, activity of SG in populations of the selected strains increased significantly since induced selection considerably expanded the range of selection of active clones till 100 %. 11 strains from 4th stage of multisteps selection had activity of SG from 85% to 90%, exceeds average activity of initial strain on 61,5%.

    The selected strains are specific, highly active, stable on the selected markers in a number of generations and profitable for the use in standard test systems in mycoallergodiagnostic.

    The selected strains of Fusarium j.v.r. are deposited in the Bank of pure fungal cultures - producents of allergens in Kashkin Research Institute of Medical Mycology.

    Key words: activity of spore germination, allergoproducents, Fusarium javanicum var. radicicola, spontaneous and induced selection, typicalness of colonies 'morphology

    Вступ

    Микотические інфекції нерідко ускладнюють імунодефіцитні стани хворого. Найбільш часто етіологічними факторами при цьому є цвілеві гриби, зокрема, мікроміцети роду Fusarium. Нині патогенна роль цих мікро-міцетов підтверджена на практиці. Так, у пацієнта при дисемінований інфекції були виділені Fusarium oxysporum, F. verticillioides, F. sporotrichoides [1], у хворих на астму ідентифікований алерген з

    |

    F. solani [2], який також був виявлений при поліпозі носа [3]. У пацієнта з злоякісної гематології спостерігали інвазивний фузаріоз [4, 5]. З 65 хворих у 44,4% був встановлений микотический кератит, обумовлений інфекцією Fusarium spp. [69]. Відомі захворювання у пацієнтів з іммуносу-прес, в разі інвазивної і дисемінований інфекції Fusarium spp., Онихомикозами, параніхі-озами, кератомікозамі [10-12].

    Актуальність імунологічної діагностики таких мікозів очевидна, але при цьому необхідно створення банку для збереження культур грибів -продуцентов алергенів, що складаються зі стандартних по маркерами морфології колоній і активності проростання суперечка, що, очевидно, буде рентабельно при нарощуванні стандартної біомаси міцелію при створенні тест-систем для мікоаллергодіагностікі.

    Мета - порівняти діапазон мінливості клонів по маркерами макроморфологіі (МК) і проростання спор (ПС) в популяціях штамів, обраних при спонтанної і індукованої селекції; відібрати з популяції варіанти, найбільш перспективні для науково-практичного використання.

    матеріали і методи1

    Об'єкти дослідження - 4 штаму Fusarium j.v.r .. Генеалогія їх різна: вихідний штам ВКПГ - 69, виділений з ураженої грибом кисті пацієнта; селекціоновані штами, виділені в різному діапазоні мінливості популяції штамів - 69/9 - при вивченні спонтанної мінливості ІШ 69; СШ-69/9/6 - при спонтанної мінливості популяції штаму СШ 69/9; СШ-69/9/6/34 - після індукованої мінливості штаму СШ-69/9/6 в результаті впливу диференціальної термообробки (ДТО).

    Вивчали клони з моноспорового розсівання, вище-представлених популяцій штамів по маркерами МК і ПС в 4-х ступенях селекцій. При многоступенчатом відборі розробили спосіб поєднаної дії на ІШ і СШ Fusarium j.v.r. природної та індукованої селекції з ДТО.

    Мінливість клонів по маркеру МК досліджували на агаризованому середовищі Сабуро з 4% глюкози після вирощування при 28 оС протягом 7 діб. Оцінювали, в середньому, по 500 колоній кожного штаму.

    Природну мінливість активності ПС вивчали після вирощування клонів в рідкому середовищі Сабуро з 4% глюкози і додаванням органічного азоту після струшування пробірок з мікроміце-те на шуттель-апараті протягом 10 год. 30 хвилин. при 27 ° С. З популяції кожного штаму оцінювали, в середньому, по 100 клонів. Кількість ПС підраховували у відсотках до загальної кількості спор в 10 полях зору мікроскопа МБІ-15. З метою відбору активних клонів по ПС провели статистичну обробку результатів за методом сум, викладеному Плохинський І.М. в кн .: «Біометрія».

    Індуковану мінливість активності ПС

    клонів в популяції вивчали після диференціальної термообробки штаму 69/9/6 за розробленою нами методикою, представленою раніше [13].

    результати і обговорення

    На I ступені селекції вивчали природну мінливість популяції вихідного штаму. Популяція ІШ №69 по маркеру макроморфологіі колоній була представлена ​​двома типами: I тип становив 55,8%, а II тип - 44,2%. I тип віднесли до типових колоній досліджуваного мікроміцетів. Розмір колонії

    - від 10 до 20 мм в діаметрі, центр радіально-склад-чатий, край широкий, плоский. Колонія бархатисто-повстяна, повітряний міцелій рожево-фіолетового кольору в центрі, по краю білий; реверзум фіолетовий. II тип - колонія невеликого розміру

    - 8 мм в діаметрі, плоска, центр оксамитовий, край повстяний, повітряний міцелій білого кольору; ре-верзум також білий.

    При мікроскопії нитки міцелію септірованние, макроконідіі з 3 перегородками - 32 х 2 мкм, з 2 перегородками - 20 х 2 мкм; з одного перегородкою - 18 х 2 мкм; мікроконідії - 8 х 2 мкм. Однак колонії II типу були фенотипическими, тому що на наступних щаблях селекції відсоток МК II типу поступово знижувався. Так, на II ступені селекції він становив 2%, а на наступних щаблях - III (індукованої селекції) і IV (природною селекції) популяція складалася з гомогенних клонів МК - I типу, стабільність яких зберігається при перевірці в 7 генераціях протягом 3-х років.

    Як при природній, так і при індукованої селекції досліджували мінливість клонів в популяціях селекціонованих штамів по маркеру активності ПС в порівнянні з населенням вихідного штаму.

    Таблиця

    мінливість при багатоступінчастої природної та індукованої селекції клонів в популяціях селекціонованих і вихідного штамів Fusarium j.v.r., по маркеру Пс

    Мал. Природна і індукована мінливість активності проростання суперечка в популяціях вихідного і селекціонованих штамів Fusarium j.v.r. при багатоступінчастої селекції. По осі абсцис - активність проростання суперечка,%. По осі ординат - кількість варіантів з пророслими спорами,%.

    а) вихідний штам РКПГ-69 - I етап селекції (природна

    мінливість).

    б) селекціоновані штам - РКПГ-69/9 - II етап селек-

    ції (природна мінливість). в) селекціоновані штам - РКПГ-69/9/6 - III етап селекції (індукована мінливість). г) селекціоновані штам - РКПГ-69/9/6/34 - IV етап селекції (природна мінливість)

    Сходинки селекції № штамів Розмах мінливості,% Середня арифметична, х,% Коефіцієнт мінливості, CV,% Квадратичне відхилення, про,% Частота варіантів,%

    плюс мінус

    I РКПГ-69 0-80 26 ± 1,76 69,2 ± 18,0 6 ± 2,26 0

    II РКПГ-69/9 0-80 37 ± 1,73 39,2 ± 14,6 3 ± 2,41 0

    III РКПГ-69/9/6 0-100 36 ± 3,40 66,6 ± 24,0 9 ± 1,69 0

    IV РКПГ-69/9/6/34 0-100 71.6 ± 1,42 19,7 ± 14,2 83 ± 3,75 0

    I, II, IV ступеня - природна селекція

    III ступінь - індукована селекція

    З малюнка і таблиці видно, що розмах мінливості цього маркера збільшився тільки на III ступені селекції, тобто після індукованої селекції. Так, на I і II ступенях природного відбору клонів розмах мінливості був від 0 до 80%, а після індукованої селекції збільшився на 20% і на III і IV ступенях становив від 0 до 100%. При цьому всі критерії мінливості зросли лише на IV ступені в популяції штаму, відібраного на III ступені (після ДТО) - № 69/9/6/34 (рис., Табл.). Модальний клас на IV ступені помітно зсунувся в бік більш високої активності ПС - від 60 до 80% з великою кількістю активних клонів (до 56%) в порівнянні з вихідним штамом, де модальний клас (з кількістю клонів 45,7%) був зі значно низькою активністю ПС (від 0 до 20%).

    На IV ступеня селекції зросла середня арифметична активність ПС на 46%, що становило 71,6%, а у вихідного штаму на I ступені відбору -26,0% (табл.). Коефіцієнт мінливості в популяції останнього штаму природно зменшився на 49,5% (IV ст.). У популяції штаму IV ст. значно зросла частота «плюс» - варіантів, (в 13,8 рази), що виходять за межі х ± 2ст (середньої арифметичної ± 2 квадратичних відхилення від середньої арифметичної вихідного штаму I ст.), що склало 83%. Частота «мінус» -варіанті не змінилася (0%) (рис., Табл.).

    На IV ступеня селекції був узятий СШ, отриманий після індукованої селекції, що розширило потенційні можливості популяції при подальшому природний добір клонів з маркером активності ПС. В результаті з популяції СШ було відібрано значну кількість активних штамів - 11 варіантів від 85-90%. Штами стабільні по враховуються маркерами в ряді генерацій протягом 3-х років.

    висновок

    При багатоступінчастої селекції вивчено з-подружжя дію спонтанної і індукованої мінливості популяцій вихідного і селекціонованих штамів. Показано, що на IV ступені природної селекції в популяції штаму, ви-

    поділеного після індукованої селекції (ДТО), розширився діапазон всіх критеріїв мінливості, що створило можливість селекционировать велика кількість типових МК і активних по маркеру ПС. Виділено 11 штамів з активністю проростання суперечка 85-90%, що перевищують середню арифметичну вихідного штаму на 61,5%. Штами стабільні за відібраними маркерами - типовості морфології колоній і активності проростання суперечка при перевірці в 7 генераціях протягом 3-х років.

    Селекціоновані штами специфічні, активні, стабільні і рентабельні, що є не-

    обхідних умовою в напрацюванні мікоаллергодіаг-ностіческіх тест-систем. Раніше нами показано, що штами - продуценти алергенів з інтенсивним ПС дають можливість нарощувати великий обсяг біомаси міцелію як джерела активних алергенів, що збільшує можливість створювати рентабельні штами - продуценти алергенів [14].

    Штами депоновані в банку культур мікро-міцетов - продуцентів алергенів і зберігаються в колекції грибів НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина і, при необхідності, можуть бути використані в створенні вітчизняних тест-систем.

    цитована література

    1. Linares-Linares M.Y., Jutierrez Trivino C., et al. A comparative study of CLSI M38-A2 and E-test methods for antifungal susceptibility testing of Fusarium spp. isolated from humans, animals and plants // Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Bogota, Colombia; Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl. 4.- P. 753.

    2. Khosravi A.P., Fatahinia M., Shokri H., Yadegari M.H. Allergens from Fusarium solani identified by immunoblotting in asthma patients in Iran // Arh. Hig. Rada. Toksikol. - 2012 - Vol. 63, №1.- P.1-6.

    3. Munoz-Del-Castillo F., Jurado-Ramos A., et al. Fungal sensitization in nasal polyposis // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol.

    - 2009. - Vol. 19, №1. - P. 6-12.

    4. Raad I.I., Hachem R.Y., et al. Posaconazole as salvage treatment for invasive fusariosis in patients with underlying hematologic malignancy and other conditions // Clin. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 42, №10. - P. 1398-1403.

    5. Fanci R., Pini G., et al. Refractory disseminated fusariosis by Fusarium verticillioides in a patient with acute myeloid leukaemia relapsed after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a case report and literature review // Rev. Jberoam. Micol. - 2013. - Vol. 30, №1. - P. 51-53.

    6. Fata S., Fata S., Derakhshan A., et al. Mycotic keratitis in Mashhad, Iran // Mashhau University of Medical Sciences, Mycology Mashhad, Iran. Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl. 4. - P. 497.

    7. Gomez-Acosta F.A., Pazza - Giralch C.M., et al. Keratinolitic activity of Fusarium spp. isolated from humans, animals and plants // Pontifica Universidad J.averiana, Colombia Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl. 4.- P. 223

    8. Troke P., Obenga G., Gaujoux T., et al. The efficacy of voriconazole in 24 ocular Fusarium infections // Infection. - 2013.

    - Vol. 41. - P. 15-20.

    9. Sid-keungEdmond Ma, Kellie So, et al. Multi -country outbreak of fungal keratitis associated with a brand of contact lens solution: the Hong Kong experience // Int. J. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 13. - P. 443-448.

    10. Brasch J., Wohlfei E. Recalcitzant purulent paronychia and onychomycosis caused by Fusarium oxysporum // University Hospitals, Departament of Dermatology, Kiel, Germany. Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl.4. - P. 550.

    11. Inano S., Kimura M., et al. Combination therapy of voriconazole and terbinafine for disseminated fusariosis: case report and literature review // J. Infect. Chemother. - 2013. - Apr.6.

    12. Kaur R., Maheshwari M. Hyperkeratotic warty skin lesion of foot caused by Fusarium oxysporum // Indian J. Dermatol. -2013.- Vol. 58, №2. - P. 159.

    13. Журавльова Н.П., Блінов Н.П., Васильєва Н.В. Особливості взаємовідносин вірусу і мікроміцетів - господаря Fusarium javanicum var. radicicola W.R. при різних температурах // Проблеми медичної мікології. - 2004.

    - Т.6, №4. - С. 27-32.

    14. Журавльова Н.П., Зуєва Б.В., Блінов Н.П., та ін. Спосіб вирощування селекціоновані штаму Penicillium notatum №1043 / 2 для отримання алергену для діагностики мікогенной сенсибілізації і алергії // Патент на винахід №2213772. - 2001. - С. 12.

    Надійшла до редакції журналу 25.02.2014 Рецензент: А.А. Степанова


    Ключові слова: АКТИВНІСТЬ проростання спор /АЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТ /Спонтанно і ІНДУКОВАНА СЕЛЕКЦІЯ /Типовий МОРФОЛОГІЇ КОЛОНІЙ /FUSARIUM JAVANI-CUM VAR. RADICICOLA /ACTIVITY OF SPORE GERMINATION /ALLERGOPRODUCENTS /SPONTANEOUS AND INDUCED SELECTION /TYPICALNESS OF COLONIES '' MORPHOLOGY

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити