Рід Rhizomucor відносять до сімейства Mucoraceae, порядку Mucorales, підвідділу Mucoromycotina. Мікроміцети з сімейства Mucoraceae можуть бути етіологічно значимими при алергічних захворюваннях, тому що вельми поширені в навколишньому середовищі. Для житлових приміщень, уражених пліснявими мікроміцетами, характерна висока концентрація спор мікроскопічних грибів факторів ризику мікогенной алергії. В останні роки відзначають зростання захворюваності органів дихання, обумовленої пліснявими грибами, в тому числі і зігоміцети. Клінічними проявами мікогенной алергії при цьому, як правило, є алергічний риніт і бронхіальна астма. У зв'язку з цим розробка стандартних аллергодіагностіческіх тест-систем і створення банку штамів мікроміцетів продуцентів специфічних, активних і стабільних алергенів є актуальною проблемою. З цією метою проведено генетико-селекційні дослідження по вивченню природної мінливості популяцій селекціонованих штамів (СШ) Rhizomucor pusillus в багатоступінчастої селекції в порівнянні з вихідним штамом (ІШ), виділеним від хворого, за двома маркерами морфології колоній і активності проростання суперечка. Популяція селекціонованих і вихідного штамів була гомогенна по маркеру макроморфологіі колоній (МК) і складалася з основного I типу. за маркера активності проростання суперечка (ПС) відзначено перевагу популяцій СШ в порівнянні з ІШ. Так, в популяції ІШ на всіх щаблях селекції превалює кількість низькоактивних клонів по ПС. У СШ з кожною сходинкою кількість низькоактивних клонів зменшується. При цьому кількість клонів у СШ з високою активністю значно збільшується. Селекціоновані ряд стабільних типових по морфології колоній штамів з активністю проростання суперечка від 71 до 75%, що перевищують ІШ на 40-44%. Із застосуванням генетико-селекційних методик інтенсифіковані і стандартіфіціровани штами Rhizomucor pusillus. При природному многоступенчатом відборі селекціоновано штами з генетичною однорідністю клонів в популяції по маркеру МК і підвищений потенціал життєздатності спор при збільшенні маркера інтенсивності ПС в порівнянні з ІШ. Селекціоновані штами специфічні, високоактивні, стабільні і рентабельні. У перспективі штами можуть бути використані при створенні технології отримання тест-систем для мікоаллергодіагностікі.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Журавльова Ніна Петрівна, Еліна Н.П., Васильєва Н.В., Фролова О.В., Соловйова Г.І.


MARKERS OF VARIABILITY OF RHIZOMUCOR PUSILLUS STRAINS - PRODUCENT OF MYCOALLERGENS

Rhizomucor belongs to Mucoraceae family, order Mucorales, subdivision Mucoromycotina. Micromycetes of Mucoraceae family may be etiologically significant in allergic diseases, since they are widespread in environment. The living spaces, affected by molds, are characterized by high concentrations of microfungal spore, risk factors for fungal allergy. In recent years growth of the respiratory diseases caused by molds including Zygomycetes is observed. Clinical manifestations of fungal allergy are allergic rhinitis and bronchial asthma. In this regard, the development of standard test systems for allergodiagnostics and the creation of the bank of micromycetes strains producents of specific, active and stable allergens are an actual problem. We have carried out genetic-selection studies of the natural variability of selected strains populations (SS) Rhizomucor pusillus in a multi-step selection in comparison with the initial strain (IS), isolated from a patient, on two markers: the morphology of the colonies and the activity of spore germination. Population of selected and initial strains was homogeneous for macromorphology of the colonies (MC) and consisted of the main I type. Advantage of the SS population as compared with IS on the marker of the activity of spore germination was revealed. Thus, the amount of low-active clones on SG prevails in population of IS at all steps of selection. With each step of selection at SS the amount of low active clones decreases, while the amount of clones with high activity increases significantly. A number of stable strains which typical on morphology of the colonies with the activity of spore germination from 71 to 75% exceeding IS for 40 44% had been selected. Rhizomucor pusillus strains have been intensified and standardized with application of genetic-selection methods. At natural multi-step selection strains with genetic uniformity of clones in population on marker MC have been selected. At increase in a marker of intensity of SG in comparison with IS the potential of spores viability was also raised The selected strains are specific, highly active, stable and profitable. In perspective: the strains can be used in the development of test systems for mycoallergodiagnostics.


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2016


    Журнал

    Проблеми медичної мікології


    Наукова стаття на тему 'МАРКЕРИ ПРИРОДНОГО МІНЛИВІСТЬ ШТАМІВ RHIZOMUCORPUSILLUS - МІКОАЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТОВ'

    Текст наукової роботи на тему «МАРКЕРИ ПРИРОДНОГО МІНЛИВІСТЬ ШТАМІВ RHIZOMUCORPUSILLUS - МІКОАЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТОВ»

    ?УДК 582.281.21: 616-056.3

    МАРКЕРИ ПРИРОДНОГО МІНЛИВІСТЬ ШТАМІВ RHIZOMUCOR PUSILLUS - МІКОАЛЛЕРГО-ПРОДУЦЕНТІВ

    Журавльова Н.П. (В.н.с.) *, Еліна Н.П. (Професор кафедри), Васильєва Н.В. (Директор інституту, зав. Кафедрою), Фролова О.В. (Зав. Лаб.), Соловйова Г.І. (В.н.с.), Чілін Г.А. (Зав. Лаб.)

    НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина Північнозахідного державного медичного університету ім. І.І. Мечникова, Санкт-Петербург, Росія

    © Колектив авторів, 2016

    Рід Rhizomucor відносять до сімейства Mucoraceae, порядку Mucorales, підвідділу Mucoromycotina. Мікроміцети з сімейства Mucoraceae можуть бути етіологічно значимими при алергічних захворюваннях, тому що вельми поширені в навколишньому середовищі. Для житлових приміщень, уражених пліснявими мікроміцетами, характерна висока концентрація спор мікроскопічних грибів-фактор ризику мікогенной алергії. В останні роки відзначають зростання захворюваності органів дихання, обумовленої пліснявими грибами, в тому числі і зігоміцети. Клінічними проявами мікогенной алергії при цьому, як правило, є алергічний риніт і бронхіальна астма.

    У зв'язку з цим розробка стандартних аллергодіагностіче-ських тест-систем і створення банку штамів мікроміцетів - продуцентів специфічних, активних і стабільних алергенів є актуальною проблемою.

    З цією метою проведено генетико-селекційні дослідження по вивченню природної мінливості популяцій селекціонованих штамів (СШ) Rhizomucor pusillus в багатоступінчастої селекції в порівнянні з вихідним штамом (ІШ), виділеним від хворого, за двома маркерами - морфології колоній і активності проростання суперечка. Популяція селекціонованих і вихідного штамів була гомогенна по маркеру макроморфологіі колоній (МК) і складалася з основного -1 типу. За маркера активності проростання суперечка (ПС) відзначено перевагу популяцій СШ в порівнянні з ІШ. Так, в популяції ІШ на всіх щаблях селекції превалює кількість низькоактивних клонів по ПС. У СШ з кожною сходинкою кількість низькоактивних клонів зменшується. При цьому кількість клонів у СШ з високою активністю значно збільшується. Селекціоновані ряд стабільних типових по морфології колоній штамів з активністю проростання суперечка від 71 до 75%, що перевищують ІШ на 40-44%.

    Із застосуванням генетико-селекційних методик інтенсифіковані і стандартіфіціровани штами Rhizomucor pusillus. При природному многоступенчатом відборі селекціоновано штами з генетичною однорідністю клонів в популяції по маркеру МК і підвищений потенціал життєздатності спор при збільшенні маркера інтенсивності ПС в порівнянні з ІШ.

    Селекціоновані штами специфічні, високоактивні, стабільні і рентабельні. У перспективі штами можуть бути використані при створенні технології отримання тест-систем для мікоаллергодіагностікі.

    Ключові слова: активність проростання суперечка, морфологія колоній, аллергопродуценти, Rhizomucor pusillus, селекція, спонтанна мінливість

    Контактна особа: Журавльова Ніна Петрівна, тел .: (812) 303-51-40

    MARKERS OF VARIABILITY OF RHIZOMUCOR PUSILLUS STRAINS - PRODUCENT OF MYCOALLERGENS

    Zhuravleva N.P. (Leading scientific collaborator), Yelinov N.P. (Professor of the chair), Vasilyeva N.V. (Director of institute), Frolova E.V., (head of the laboratory), Solovjova G.I. (Leading scientific collaborator), Chilina G.A. (Head of the laboratory)

    Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I.Mechnikov, St.Petersburg, Russia

    © Collective of authors, 2016

    Rhizomucor belongs to Mucoraceae family, order Mucorales, subdivision Mucoromycotina. Micromycetes of Mucoraceae family may be etiologically significant in allergic diseases, since they are widespread in environment. The living spaces, affected by molds, are characterized by high concentrations of microfungal spore, - risk factors for fungal allergy. In recent years growth of the respiratory diseases caused by molds including Zygomycetes is observed. Clinical manifestations of fungal allergy are allergic rhinitis and bronchial asthma.

    In this regard, the development of standard test systems for allergodiagnostics and the creation of the bank of micromycetes strains -producents of specific, active and stable allergens are an actual problem.

    We have carried out genetic-selection studies of the natural variability of selected strains populations (SS) Rhizomucor pusillus in a multi-step selection in comparison with the initial strain (IS), isolated from a patient, on two markers: the morphology of the colonies and the activity of spore germination. Population of selected and initial strains was homogeneous for macromorphology of the colonies (MC) and consisted of the main - I type. Advantage of the SS population as compared with IS on the marker of the activity of spore germination was revealed. Thus, the amount of low-active clones on SG prevails in population of IS at all steps of selection. With each step of selection at SS the amount of low active clones decreases, while the amount of clones with high activity increases significantly.

    A number of stable strains which typical on morphology of the colonies with the activity of spore germination from 71 to 75% exceeding IS for 40 -44% had been selected.

    Rhizomucor pusillus strains have been intensified and standardized with application of genetic-selection methods. At natural multi-step selection strains with genetic uniformity of clones in population on marker MC have been selected. At increase in a marker of intensity of SG in comparison with IS the potential of spores viability was also raised

    The selected strains are specific, highly active, stable and profitable. In perspective: the strains can be used in the development of test systems for mycoallergodiagnostics.

    Key words: activity of spore germination, allergoproducents, morphology of the colonies, Rhizomucor pusillus, selection, spontaneous variability

    ВСТУП

    Цілеспрямоване дослідження мінливості грибів за певним маркера забезпечує можливість отримання чистих культур з властивостями стабільних і рентабельних штамів мікроміцетів - продуцентів різних цільових продуктів, зокрема мікоаллергенов. Створення мікоаллергодіагно-стических препаратів з селекціонованих штамів є гострою необхідністю в медичній практиці, так як справжня частота мікогенной алергії у хворих не може бути встановлена ​​до тих пір, поки серед алергенів немає стандартних препаратів [1; Dziadzio L.K., Bush R.K. // Curr. Allergy and Asthma Reports. - 2001].

    Раніше співробітниками НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина вивчена мінливість таких пологів грибів, як Aspergillus, Alternaria, Cladosporium,

    |

    Fusarium, Penicillium, які є аллергопродуцента-ми [2-5]. При цьому показано, що штами, виділені від хворих, мають широкий діапазон мінливості за такими маркерами, як морфологія колоній і активність проростання суперечка. Нами селекціоновано найбільш активні штами за цими ознаками і стабільні в ряді генерацій. На прикладі селекціонованих штамів перерахованих вище мікроміцетів показано, що отримані з фільтратів культураль-них рідин алергенні препарати мають високу специфічність, достатньою активністю і стандартностью. Результати були чіткими при обстеженні хворих на атопічний захворюваннями в клініках Санкт-Петербурга і Росії, тобто показано явну перевагу селекціонованих штамів для створення аллергодіагностіческіх препаратів [Соболєв О.В. та ін .// Int. J. on Immunoreabilitation. - 1999. -№14; Журавльова Н.П. та ін. // Патент на винахід № 2172342. - 2000; Журавльова Н.П. та ін .// Патент на винахід № 2213772 - 2001].

    Останнім часом виявлено ряд мікроміцетів, які є контоменантами повітря житлових приміщень в Санкт-Петербурзі, таких, як Aspergillus spp., Alternaria spp., Cladosporium spp., Fusarium spp., Mucor spp., Penicillium spp., Rhizopus spp. [6]. Для житлових приміщень з ознаками цвілеві поразки була характерна висока концентрація спор мікроміцетів. Частота мікогенной алергії у жителів приміщень, уражених мікроміцетами, становила 58,1%. Частота сенсибілізації до Mucor spp. - 20,9%, до Rhizopus spp. - 34,0%. При цьому основними клінічними формами мікогенной алергії були бронхіальна астма (38,0%) і алергічний риніт (34,0%) [6]. В одній з робіт цих же авторів показано вплив концентрації мікроміцетів в повітрі житлових приміщень на перебіг бронхіальної астми (БА). Відзначено, що підвищення концентрації пліснявих мікроміцетів є фактором ризику розвитку важкої БА. Найбільш поширеними грибковими алергенами були Aspergillus, Alternaria, Penicillium, а також Mucor (від 15,6 до 33,7%) [7, 8].

    У завдання нашого дослідження входило вивчення природної мінливості клонів в популяції вихідного і селекціонованих штамів Rhizomucor pusillus за двома маркерами - морфології колоній і інтенсивності проростання суперечка.

    Мета експерименту - в процесі ступеневої селекції мікроміцетів R. pusillus відібрати клони, типові по маркерами МК і активності ПС, для поповнення банку чистих стабільних по цінним властивостям рентабельних штамів - продуцентів алергенів для можливого використання їх у вітчизняній аллер-годіагностіке.

    МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

    Об'єкти дослідження - 3 штами R. pusillus: вихідний РКПГБ - F158 / 3848, виділений раніше від хворого з тромбу легеневої артерії; селекціоновані - при вивченні спонтанної мінливості популяції штамів: № 158/3848/13, № 158/3848/13/63.

    Властивості клонів з моноспорового розсівання популяцій штамів досліджували із застосуванням генети-ко-се лекційних методів [Захаров І.А., Квітко К.В. Генетика мікроорганізмів - Л., 1967]. природну

    мінливість МК грибів вивчали на агаризованому середовищі Сабуро з 4% глюкози після вирощування при 28 оС протягом 7 діб. Оцінювали, в середньому, по 500 клонів кожного штаму.

    Спонтанну мінливість властивості інтенсивності ПС досліджували на рідкому середовищі Сабуро з 4% глюкози і додаванням органічного азоту. Гриби інкубували при 27 ° С при постійному струшуванні пробірок на шуттель-апараті протягом 17 годин. З популяції кожного штаму переглянули по 100 колоній. Кількість ПС підраховували у відсотках до загальної кількості спор в 10 полях зору мікроскопа. З метою відбору активних клонів по ПС провели статистичну обробку результатів, використовуючи спосіб сум [Плохинський Н.А. Біометрія - Новосибірськ, 1970]. СШ перевіряли при пересеве в ряді генерацій на стабільність цих властивостей.

    РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

    При вивченні спонтанної мінливості властивостей МК ІШ і СШ встановлено, що популяції ІШ і СШ гомогенні за макроморфологіі колоній.

    Колонії на середовищі Сабуро світло-сірого кольору, ва-тообразние, повітряний міцелій висотою 0,5-1см, зворотна сторона колоній безбарвна. Мікроскопічна картина представлена ​​спорангіоносцамі шириною 6-8 мкм; гладкі, безбарвні, спорангії з Апофіз, бурі, діаметром 44-50 мкм, колонка шаровидно-грушоподібної, буро-сіра розміром 2430 х 18-20 мкм. Спори округлі, діаметром 4-5 мкм, бурі.

    Природну мінливість маркера інтенсивності ПС оцінювали за критеріями варіабельності клонів в популяціях ІШ і СШ (табл.).

    Таблиця

    Природна мінливість клонів в популяції селекціонованих і вихідного штамів & РІВШ по маркеру ПС при багатоступінчастої селекції

    Сходинки селекції № штамів Розмах мінливості,% Середня арифметична, х,% Коефіцієнт мінливості, cv,% Квадратичне відхилення о,% Частота варіантів,%

    плюс мінус

    I ІШ РКП1Т-158 0 - 100 30,6 ± 1,8 60,9 18,6 4 ± 1,9 0

    II СШ 158-3 0 - 100 37,4 ± 1,8 47,9 17,9 2 ± 1,4 0

    III СШ 158-13-63 0 -100 40,0 ± 1,6 39,7 15,9 1 ± 1,7 0

    Як видно з таблиці і малюнка, популяції ІШ і СШ I, II, і III етапів мають однаковий розмах мінливості по маркерами інтенсивності ПС від 0 до 100%.

    Мал. Природна мінливість активності проростання суперечка в популяціях вихідного і селекціонованих штамів Rhizomucorpusillus при багатоступінчастої селекції. По осі абсцис - активність проростання суперечка,%. По осі ординат - кількість варіантів з пророслими

    спорами,%. а) вихідний штам - РКПГР-158 - I етап селекції. б) селекціоновані штам - 158/13 - II етап селекції. в) селекціоновані штам - 158/13/63 -III етап селекції

    Але з кожним етапом селекції відзначали відмінності по ряду критеріїв мінливості. Так, з малюнка і таблиці видно, що в популяції ІШ превалює кількість клонів з низькою активністю ПС; в інтервалі від 0 до 20% активність ПС у ІШ - 33%, а у ЗОШ с кожним етапом селекції кількість низькоактивних клонів значно зменшується на 18,6% (II етап) і на 25,7% (III етап). Відзначимо, що на кожному етапі селекції зростає відсоток клонів з інтенсивним проростанням спор. Модальний клас цього маркера на всіх етапах однаковий і знаходиться в інтервалі від 21 до 40%. У СШ кількість клонів з високою активністю значно вище ІС. Так, на II етапі на 2,4%, а на III - на 7,4% більше. А в межах від 40 до 60% інтенсивність ПС зростає поступово від 21% (I етап) до 27,7% (II етап) і до 37,7% (III етап) (табл., Рис.). Далі в межах високоактивних класів від 61 до 80%, активність ПС практично однакова - 6%

    (I етап), 10,3% (II) і до 7,2% (III); в межах 80-100% -активність ПС однакова.

    Однак в процесі статистичної обробки результатів експерименту на основі критеріїв мінливості: середньої арифметичної (х) маркера, коефіцієнта варіації (cv), квадратичного відхилення (а) виділені кілька високоактивних штамів. В результаті відбору у СШ х поступово зростав - на 6,8% на II етапі і на 9,4% - на III в порівнянні з населенням ІШ.

    Для більш точного визначення різноманітності досліджуваної ознаки визначали щодо середнє відхилення, виражене в% cv. В даному експерименті cv на II етапі селекції знижувалося на 13%, на III - на 21,2% в порівнянні з населенням ІШ. Незначно, але також показана тенденція зниження а в популяціях СШ від 18,6 до 15,9%. Зниження коефіцієнта варіації (cv) і зниження відхилення від середньої арифметичної варіаційного ряду (а) за активністю ПС відображають поступову стабілізацію СШ по досліджуваного маркера. В результаті на останньому етапі селекції відібрано штами з активністю від 71 до 75%, що перевищує середню арифметичну ІШ на 40 і 44%.

    Так, в результаті дослідження показано значимість багатоступінчастої селекції клонів в популяції R. pusillus по маркерами типовості МК і високої активності ПС. Нами на третьому щаблі селекції відібрано клони, типові по МК і високоактивні по ПС від 71 до 75% на 17 годин вирощування в глибинних умовах зростання, що перевищило середню активність ІШ в 4,3 рази. Крім того, СШ були стабільні по селекціоновані властивостями в декількох генераціях і специфічні.

    Раніше нами показано, що штами з інтенсивним ПС дають можливість нарощування більшого обсягу біомаси міцелію як джерела активних алергенних речовин [8; Захаров І.А., Квітко К.В. Генетика мікроорганізмів - Л., 1967]. У перспективі СШ можуть бути використані для напрацювання стандартних, специфічних і активних алергенних вітчизняних препаратів.

    Селекціоновані штами R. pusillus депоновані в банку чистих культур мікроміцетів в НДІ медичної мікології ім. П.Н. Кашкина СЗГМУ ім. І.І. Мечникова.

    ВИСНОВОК

    В результаті багатоступінчастої селекції R. pusillus вивчена спонтанна мінливість популяції вихідного і селекціонованих штамів. Виявлено потенціал цих штамів за інтенсивністю проростання суперечка і виділені 3 селекціонованих штаму з активністю ПС від 71 до 75%, що перевищує вихідний штам на 40-44%. Популяції СШ гомогенні по морфології колоній, стабільні за активністю ПС в ряді генерацій. У перспективі СШ можуть бути використані при створенні вітчизняних тест-систем для мікоаллергодіагностікі.

    цитованої літератури

    1. Митрофанов B.C., Козлова Я.І. Цвілі в будинку (огляд) // Проблеми медичної мікології. - 2004. - Т. 6, №2. - С. 10-18.

    2. Журавльова Н.П., Васильєва Н.В., Соловйова Г.І. Спонтанна мінливість популяцій селекціонованих штамів мікроміцетів Cladosporium herbarum (Pers) Link - продуцентів алергенів // Проблеми медичної мікології. -2007. - Т. 9, №2. - С. 56-57.

    3. Журавльова Н.П., Васильєва Н.В., Чілін Г.А., Соловйова Г.І. Селекція штамів Penicillium notatum Weste - продуцентів алергенів // Проблеми медичної мікології. - 2011. - Т. 13, №2. - С. 77-78.

    4. Журавльова Н.П., Еліна Н.П., Васильєва Н.В. та ін. Маркери спонтанної і індукованої мінливості штамів мікоаллергопродуцентов Fusarium javanicum var. radicicola // Проблеми медичної мікології. - 2014. - Т. 16, №1. - С. 46-49.

    5. Журавльова Н.П., Еліна Н.П., Васильєва Н.В. та ін. Явище інтенсифікації штамів мікроміцетів Fusarium javanicum var. radicicola // Збірник «Наукові відкриття-2015». Вид. Російської академії природничих наук, 2016. - С. 10-12.

    6. Козлова Я.І., ААК О.В., Чілін Г.А. Роль мікроміцетів - контамінантів житлових приміщень у формуванні мико-генної алергії // Проблеми медичної мікології. - 2007. - Т. 9, №2. - С. 64-65.

    7. Козлова Я.І., ААК О.В., Чілін Г.А. Особливості бронхіальної астми у жителів приміщень, уражених мікроміце-тами // Проблеми медичної мікології. - 2008. - Т. 10, №2. - С. 51-52

    8. Козлова Я.І., Соболєв А.В., ААК О.В. та ін. мікогенной алергія у пацієнтів з атопічним захворюваннями в Санкт-Петербурзі // Проблеми медичної мікології. - 2014. - Т. 16, №2. - С. 87-88.

    Надійшла до редакції журналу 21.04.2016

    Рецензент: А.А. Степанова


    Ключові слова: АКТИВНІСТЬ проростання спор /ACTIVITY OF SPORE GERMINATION /МОРФОЛОГІЯ КОЛОНІЙ /MORPHOLOGY OF THE COLONIES /АЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТИ /RHIZOMUCOR PUSILLUS /СЕЛЕКЦІЯ /SELECTION /спонтанно МІНЛИВІСТЬ /SPONTANEOUS VARIABILITY /ALLERGOPRODUCENTS

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити