квантові точки це відносно новий клас флуорофорів з унікальними фізико-хімічними властивостями, які дозволяють істотно розширити можливості сучасних методів флуоресцентної візуалізації і оптичної діагностики. В огляді розглянуті перспективи застосування квантових точок для молекулярної діагностики пухлин від визначення онкомаркерів на мікропланшетах до неінвазивної візуалізації новоутворень in vivo, окреслено проблеми, які необхідно вирішити для впровадження квантових точок в клінічну практику, і намічені інноваційні підходи в онкології, здійсненні із застосуванням квантових точок.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Здобнова Т. А., Лебеденко Є. М., Дєєв С. М.


Область наук:

  • Біотехнології в медицині

  • Рік видавництва: 2011


    Журнал: Acta Naturae (російськомовна версія)


    Наукова стаття на тему 'Квантові точки для молекулярної діагностики пухлин'

    Текст наукової роботи на тему «Квантові точки для молекулярної діагностики пухлин»

    ?УДК 535.37: 577.336 / 616-006

    Квантові точки для молекулярної діагностики пухлин

    Т. А. Здобнова *, Є. М. Лебеденко, С. М. Дєєв

    Установа Російської академії наук Інститут біоорганічної хімії ім. академіків М.М. Шемякіна і Ю. А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, вул. Миклухо-Маклая, 16/10 * Е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. Надійшла до редакції 15.10.2010 р.

    РЕФЕРАТ Квантові точки - це відносно новий клас флуорофорів з унікальними фізико-хімічні властивості, які дозволяють істотно розширити можливості сучасних методів флуоресцентної візуалізації і оптичної діагностики. В огляді розглянуті перспективи застосування квантових точок для молекулярної діагностики пухлин від визначення онкомаркерів на мікропланшетах до неінвазивної візуалізації новоутворень in vivo, окреслено проблеми, які необхідно вирішити для впровадження квантових точок в клінічну практику, і намічені інноваційні підходи в онкології, здійсненні із застосуванням квантових точок.

    КЛЮЧОВІ СЛОВА квантові точки, флуоресцентна візуалізація, багатобарвне мічення, наночастинки. СПИСОК СКОРОЧЕНЬ АФК - активні форми кисню; ІГХ - иммуногистохимический аналіз; ІФА -іммуноферментний аналіз; КТ - квантові точки; МУК - меркаптоуксусная кислота; ПЕГ - поліетилен-ленгліколь; РЕМ - ретикулоендотеліальна система; AFP - альфафетопротеин; EGF - епідермальний фактор росту; EGFR - рецептор епідермального фактора росту; HER2 / neu - людський епідермальний рецептор 2 / neu; IGF1R - рецептор інсулін-подібного фактору росту типу 1; PSCA - простатичний антиген стовбурових клітин; PSMA - простатоспецифічний мембранний антиген; scFv - одноланцюговий варіабельний фрагмент антитіла.

    ВСТУП

    В сучасних біомедичних дослідженнях велика увага приділяється пошуку нових шляхів неінвазивного отримання зображень внутрішньої структури біологічних об'єктів. Завдяки появі приладів з високим просторовим дозволом все більшого поширення набувають оптичні методи вивчення, одним з найбільш наочних і інформативних серед яких є флуоресцентна діагностика вогнищ патології безпосередньо в організмі.

    Значна частина розроблюваних методів спрямована на отримання зображення новоутворень, тканин і органів, дослідження молекулярної структури пухлинних клітин шляхом реєстрації аутофлуоресценціі, а також за допомогою специфічного фарбування спостережуваних об'єктів флуоресцентними контрастують агентами. Такі методи можуть дозволити не тільки виявити місце локалізації пухлини в організмі, але і оцінити рівень експресії різних білків і активність окремих клітин і процесів, які впливають на поведінку пухлини і її відповідь на дію терапевтичних агентів.

    До контрастує агентам, використовуваним в сучасних методах флуоресцентної діагностики, пред'являються особливі вимоги. Флуорофор повинні мати такі властивості: невеликі розміри (1-10 нм); достатню яскравість і високий квантовий вихід; збудження і флуоресценцію в спектральному діапазоні, відповідному найкращому проникненню в біологічні тканини; хімічну стійкість і фотостабільність, біосумісність (стійкість в біологічних середовищах, відсутність токсичності). Крім того, для біологічних досліджень часто необхідна кон'югація цих флуорофорів з різними направляючими молекулами для їх доставки до певних мішенях (білків, компартментам, клітинам). Кон'югати повинні володіти специфічністю і стабільністю взаємодії з мішенню, а також низьким рівнем неспецифічного зв'язування.

    Флуоресцентні напівпровідникові нанокристали, так звані квантові точки (КТ, англ. Quantum dots), - відносно новий клас флуорофорів, що володіють своєрідними оптичними і фізико-хімічні властивості, не харак-

    Терни для інших флуоресцентних барвників. Традиційно для діагностики широко використовуються два основні класи флуорофорів: органічні барвники і флуоресцентні білки [1]. За час, що минув з початку використання цих флуорофо-рів в біології та медицині, вони зазнали значної еволюції, і до теперішнього часу створено цілий ряд органічних барвників з невеликою молекулярною масою, а також флуоресцентних білків з високою яскравістю, хорошим квантовим виходом, випромінюючих в усіх областях спектра від синього до ближнього інфрачервоного (ІК) [2, 3]. Однак деякі властивості цих флуорофорів, особливо широкий спектр флуоресценції і низька стійкість до фотовицветанію, до сих пір обмежують їх ефективність в таких видах досліджень, як, наприклад, довгострокова візуалізація і одночасна детекція безлічі сигналів без використання додаткового комплексу інструментів і способів обробки [4].

    КТ мають цілу низку фізико-хімічних особливостей, які дають ширші можливості в порівнянні з традиційно використовуваними флуоресцентними мітками і роблять їх особливо привабливими для використання в найрізноманітніших біологічних експериментах [5, 6].

    Цей огляд присвячений розгляду можливостей застосування КТ для вивчення молекулярних механізмів процесів, що відбуваються в пухлинних клітинах, а також для діагностики пухлин як in vitro, так і in vivo.

    1. ОСОБЛИВОСТІ КТ, ЩОБ ЗАБЕЗПЕЧИТИ ПЕРЕВАГИ ПРИ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ В БІОМЕДИЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

    Квантові точки - це майже сферичні нанокристали розміром 1-10 нм, що складаються з невеликої кількості атомів (500-10 000) напівпровідникових матеріалів II-VI (наприклад, CdSe, CdTe, CdS і ZnSe) або III-V (наприклад, InP і InAs ) груп Періодичної таблиці Д.І. Менделєєва. Термін «точка» характеризує головним чином надзвичайно малі розміри цих об'єктів, а прикметник «квантовий» відображає той факт, що їх поведінка і властивості в значній мірі описуються класичною, а квантовою механікою. Зменшення розміру часток речовини до розміру, меншого, ніж борівський радіус екситона (наприклад, для сферичних частинок CdSe це діаметр менше 6 нм), призводить до того, що властивості речовини починають визначатися не тільки і не стільки його хімічним складом, скільки розміром. Завдяки цьому напівпровідникові нанокристали володіють унікальними оптичними характеристиками і фізико-хімічними

    властивостями, що вигідно відрізняють їх від інших флуорофорів, традиційно використовуваних в біологічних дослідженнях [7].

    КТ мають високий коефіцієнт молярної екстинкції (в 10-100 разів більше, ніж у органічних барвників) і високим квантовим виходом (до 90%), що забезпечує виняткову яскравість цих флуорофорів. Для КТ характерний широкий спектр поглинання, значний стоксів зсув, вузький і симетричний (без «хвоста» в червоній області) спектр флуоресценції (ширина піку ~ 25-40 нм). При цьому довжина хвилі флуоресценції «налаштовується» експериментатором шляхом зміни розміру ядра, що дозволяє створювати з одних і тих же матеріалів, за одними і тими ж методиками широкий набір різних КТ, флуоресціюючих в області спектра від УФ до ГИК (400-2000 нм) ( рис. 1). Крім того, широкий спектр збудження, характерний для цих наночастинок (КТ можуть бути порушені світлом на будь-якій довжині хвилі, меншою, ніж довжина хвилі їх флуоресценції), дозволяє порушувати суміш різних КТ на одній довжині хвилі, сильно віддаленої (>100 нм) від довжин хвиль їх флуоресценції [9]. Такі властивості КТ значно підвищують можливості методів багатоколірного мічення і одночасної ідентифікації різних біологічних об'єктів в порівнянні з іншими барвниками [6].

    Висока стійкість до фотовицветанію (в 1001000 разів вище, ніж у органічних флуорофорів) і виняткова стійкість до фото- та хімічної деградації [7, 10], характерні для флуоресцентних напівпровідникових нанокристалів, дозволяють використовувати їх в тривалих експериментах по візуалізації процесів, що відбуваються в клітині в реальному часі, таких, як ендоцитоз [11] або переміщення окремих рецепторних молекул на поверхні живої клітини [12], а також для забарвлення зразків, що вимагають тривалого зберігання [13].

    Більш докладний опис фізико-хімічних властивостей КТ, важливих для біологічного застосування, а також порівняння використання КТ та інших Флу-орофоров в біомедичних дослідженнях можна знайти в оглядах [4-6].

    Фізико-хімічні та оптичні властивості, а також особливості КТ безпосередньо залежать від способу їх синтезу. Ця велика область, яка не є предметом даного огляду, продовжує активно розвиватися, розширюючи ряд КТ, які можна застосувати в біомедичних дослідженнях, і покращуючи їх властивості (див. Огляди [4, 5]).

    В даний час в біології використовують два типи водорозчинних монодисперсних КТ: так звані біоінертні нанокристали і нанокристали, кон'юговані з різними биологиче-

    оптичне кодування

    мічення клітин

    FRET Візуалізація in vivo

    -----------> до----------->

    Фотоелектрохімія

    мікробіологічні мітки <--------------->

    УФ<250

    400

    Видимий спектр Х, нм

    700

    ІК > 2 500

    CdS

    ZnSe

    сплави CdSe / Te CdHgTe

    <-----------> <

    ГЛТсь

    CdTe

    PbSe / Te

    ZnS

    CdSe

    PbS

    Мал. 1. Залежність спектра флуоресценції КТ від матеріалу ядра. Над шкалою довжин хвиль показані діапазони спектра, що використовуються в різних біологічних дослідженнях. Під шкалою показані діапазони використання матеріалів ядра. Адаптовано з [8] (Medintz I.L., Uyeda H.T., Goldman E.R., Mattoussi H. Nat. Mater. 2005 4: 435-446) з дозволу Macmillan Publishers Ltd .: [Nature Materials], copyright (2005).

    ськими молекулами для додання їм певної специфічності.

    Біоінертні КТ знаходять застосування як неспецифічні контрастують агенти для фарбування клітин за рахунок ендоцитозу, для контрастування кровоносних судин і лімфатичних вузлів, а також при вивченні біораспределенія, токсичності і пасивної доставки наночастинок в пухлини тварин in vivo. В якості таких частинок часто використовують звичайні водорозчинні КТ, модифіковані гідрофільними тіолами [14] і вкриті оболонкою з кремнію [15] або з амфіфільних полімерів [16]. Для зменшення неспецифічного зв'язування такі частинки звичайно покривають шаром інертних молекул; виробники комерційних КТ для цих цілей зазвичай використовують поліетіленглі-коль (ПЕГ).

    2. Націлювання КТ НА пухлинні клітини

    При використанні КТ як флуорофорів для візуалізації пухлин часто необхідно їх зв'язування з різними направляючими молекулами, що забезпечують селективну доставку КТ до пухлинних клітин і їх компонентів. Специфічність мічення забезпечується вибором мішені, оптимально підходить для кожного конкретного випадку і відповідної направляючої молекули.

    В якості специфічних мішеней для діагностики пухлин найчастіше використовують рецепторну частина сигнальних білків, гіперекспрессіруют на мембрані пухлинних клітин. Рівень експресії таких клітинних молекулярних онкомаркерів, які визначаються безпосередньо в пухлинної тканини, характеризує молекулярний профіль кожної конкретної пухлини і використовується для визначення імунного статусу пухлини і індивідуалізації лікарського лікування [17].

    В якості направляючого модуля, що забезпечує селективну доставку КТ до пухлинних клітин і їх компонентів, в залежності від цілей і об'єктів досліджень використовують антитіла та їх фрагменти; ліганди специфічних рецепторів, які локалізуються на поверхні пухлинних клітин; невеликі специфічно взаємодіють з онкомаркерів молекули, такі, як пептиди і апта-заходи.

    2.1 Напрямні агенти

    Молекули імуноглобулінів (Ig) давно відомі і широко використовуються як ефективні направляючі модулі для специфічної доставки діагностичних і терапевтичних агентів як in vitro на рівні клітин і тканин, так і на рівні цілого організму in vivo. Уже в одній з перших робіт

    по застосуванню КТ для біологічних досліджень були показані можливість отримання комплексів КТ з молекулами IgG, здатність комплексів, що утворюються зв'язуватися зі специфічними антіві-довимі поліклональних антитіл і формувати преципітати в розчині [14]. Пізніше подібні комплекси були використані для мічення певних молекул, що знаходяться в різних Компарія-тментах клітини - на поверхні мембрани, в цитоплазмі і ядрі [16].

    Незважаючи на велике поширення повнорозмірних антитіл в діагностичних системах in vitro, застосування їх в якості направляючих агентів in vivo, як правило, вимагає виключення їх ефектор-них функцій і кардинальної модифікації физикохимических властивостей [18]. Найбільш повно цим вимогам відповідають міні-антитіла формату scFv [19, 20]. Ці невеликі фрагменти антитіл не містять константного домену, що не впливає на їх направляючі властивості, але знижує ймовірність виникнення побічних ефектів, викликаних взаємодією константних доменів з рецепторами клітин імунної системи і білками системи комплементу [21]. Міні-антитіла до поверхневих онкомаркерів активно використовують в якості направляючих модулів для флуоресцентної візуалізації пухлинних клітин і доставки до них терапевтичних агентів [22-24].

    У лабораторії Nie була показана можливість використання КТ, оснащених напрямними міні-антитілами формату scFv, для візуалізації пухлин, в тому числі in vivo. Після внутрішньовенного введення кон'югатів КТ з анти-EGFR-антитілом людини формату scFv в організм миші з прищепленої пухлиною підшлункової залози людини спостерігалося накопичення і ефективна інтерналізація кон'югатів клітинами пухлини [25].

    Основним недоліком антитіл формату scFv в якості направляючих агентів є їх моновалентна, так як моновалентна зв'язування з антигеном на поверхні клітин не забезпечує тривалого утримування антитіла і призводить до його швидкої дисоціації [26, 27]. У той же час велика площа поверхні, характерна для КТ, забезпечує можливість приєднання до кожної такої наночастки декількох молекул scFv і дозволяє створювати своєрідні мультівалентние конструкції з покращеними властивостями [28].

    Для специфічного впізнавання деяких білків з метою візуалізації клітин і їх компонентів в якості направляючих молекул використовують пептиди [29]. Застосування цього підходу до створення спеціалізованих КТ було вперше показано для коротких генно-інженерних пептидів, специфічно дізнаюся-

    щих интегрин, в роботах на нейробластомі людини [30]. Пізніше було доведено, що цей підхід можна використовувати і для специфічного мічення клітин ендотелію легких, ендотелію мозку і карциноми молочної залози людини як in vitro, так і в живих клітинах [31]. Аргініл-гліцил-аспарагінова кислота (RGD-пептид), дізнавшись интегрин, зарекомендувала себе хорошим альтернативним напрямних агентом для КТ, флуоресціюючих в ІК-діапазоні, при візуалізації різних пухлин в організмі миші in vivo [32].

    Ще одним перспективним напрямних агентом для доставки КТ до пухлинних клітин є аптамери - спеціально сконструйовані олігонуклеотиди, здатні впізнавати деякі білки і компоненти клітини і з високою специфічністю зв'язуватися з ними. Різні кон'югати на основі Аптамерів успішно використовуються для іміджінг і розпізнавання клітин, детекції біомаркерів і т. Д. [33]. Кон'югати КТ з аптамерами, специфічним до пухлинного маркера PSMA, вибірково фарбували фіксовані і живі клітини пухлини простати лінії LNCaP і ті ж клітини в модельному середовищі генового матриксу [34]. Було показано, що використання Аптамерів в якості направляючого агента для візуалізації клітин пухлини простати за допомогою КТ так само ефективно, як використання кон'югатів КТ з анти-PSMA-антитілами, але значно дешевше [35]. Кон'югати КТ з аптамерами можна використовувати паралельно з іншими напрямними агентами, такими, як пептиди, для одночасної візуалізації декількох онкомаркерів [36]. Крім того, отримання біотінілірованние ап-Тамер, які можуть зв'язуватися з будь-якими КТ, кон'югованими з стрептавідином, забезпечує створення універсальних реагентів для двухстадийной доставки КТ до пухлинних клітин [33].

    2.2 Методи приєднання напрямних агентів до КТ

    На сьогоднішній день застосовують два основних підходи до приєднання напрямних молекул до КТ: безпосереднє зв'язування (як правило, ковалентное) білкових молекул з активними групами на поверхні КТ і приєднання за допомогою адап-торів (рис. 2).

    Білкові молекули зазвичай приєднують безпосередньо до напівпровідникової частини нанокристалів (через SH-групу або метал-афінної координацією гистидинового залишків з атомами цинку оболонки нанокристалів) або до її гідрофільному покриттю (кон'югацією з карбоксильних, амін-ним і тіоловим групам з використанням спеціальних каталізаторів; через електростатичне

    Мал. 2. Схема будови сучасної квантової точки для біомедичних досліджень. 1 - флуоресцентне ядро ​​(зазвичай, CdSe або CdTe); 2 - захисна оболонка (зазвичай, ZnS); 3 - полімерне покриття, що забезпечує водорастворимость КТ і можливість приєднання біологічно активних молекул; 4 - молекули ПЕГ, 5 - напрямні молекули, приєднані безпосередньо і через системи адаптерів біотин-стрептавидин (6) або барназа-барстар (7).

    взаємодія). Докладно ці методи описані в оглядах [5, 37].

    Площа поверхні нанокристалів досить велика і доступна для зв'язування на ній декількох біологічних молекул. Від 2 до 5 білкових молекул і більше 50 невеликих молекул (олігонуклеотидів або пептидів) можуть бути пов'язані з однією наночасткою діаметром 4 нм [38]. Слід зазначити, що реакційна здатність деяких типів біологічних молекул після прямої кон'югації з нанокристалами може істотно змінюватися. Зокрема, антитіла при кон'югації хоча і зберігають свою специфічність, але їх афінність помітно зменшується [39]. Крім того, пряма кон'югація КТ з антитілами вимагає перевірки активності антитіла в кожному новому кон'югаті.

    Більш перспективним підходом до зв'язування КТ з антитілами представляється використання так званих самозбирається адаптерів - невеликих «липких» молекул, з високою ефективністю і специфічністю зв'язуються один з одним, але не утворюють гомодимер. Освіта комплексів з цими невеликими молекулами не впливає суттєво на афінність антитіл і, крім того, дає можливість простого отримання різноманітних поєднань антитіл різної специфічності з КТ, флуоресціюючими в різному діапазоні, без яких-

    яких додаткових модифікацій. Як адапторних молекул для зв'язування КТ з антитілами використовують гетеродімерізаціонние модулі, розроблені раніше для створення генно-інженерних біспеціфіческіх і мультівалентних антитіл, а також для двухстадийной доставки терапевтичних агентів до пухлини.

    Найбільш відомою і широко використовуваною серед таких модулів з високою аффинностью зв'язування (Ка ​​~ 10-14 - 10-15 М) є стрептавидин-біотіновая система [40]. До КТ ковалентно або через електростатичні взаємодії приєднують стрептавидин, що дозволяє їм зв'язуватися з біотінілірованние напрямними агентами. Вперше КТ, кон'юговані з стрептавідином, були використані для візуалізації пухлинного маркера НЕІ2 / пеї на поверхні клітин пухлини молочної залози людини SKBR-3 через біотин-ліровать антилюдські вторинні антитіла і гуманізувати анти-НЕГ2 / пеї-антитіла [16]. Аналогічну триступеневу систему використовували для зв'язування КТ з фрагментами антитіл, специфічних до гліциновий рецептор на мембрані нейронів, що дозволило спостерігати за рухом окремих рецепторів в живих нейронах [41]. Триступенева система на основі аффинной пари біотин-стрептавидин (первинні антитіла; біоти-

    А

    а а '

    |

    W

    Мал. 3. Неспецифічне і специфічну взаємодію КТ з пухлинними клітинами. Схема (зліва) і результати (праворуч) флуоресцентної мікроскопії клітин лінії SKOV-3 після їх інкубації з КТ (А), кон'югатами КТ з барстаром (Б), з димером протипухлинних антитіл з барназой, а потім з кон'югатами КТ з барстаром (б) . Дано фотографії клітин у видимому світлі (а, б, в) і їх флуоресцентні зображення (а ', б', в '). Позначення см. На рис. 2.

    нілірованние вторинні антитіла; квантові точки, кон'юговані з стрептавідином) дозволяє використовувати один раз кон'юговані з стрептавідином квантові точки для візуалізації безлічі різних мішеней без будь-якої додаткової модифікації, оскільки специфічність мічення визначається відповідними первинними і біотінілірованние вторинними антитілами.

    Число ступенів в процесі мічення можна скоротити до двох, використовуючи первинні антитіла, які зв'язуються з КТ через біотин-стрептавідіновий місток [11]. Цей підхід використовується не тільки для антитіл, але і для інших напрямних агентів. Так КТ, кон'юговані з интегрин-який дізнається пептидом через біотин-стрептавідіновий модуль, були успішно використані для мічення ау-субодиниці интегрина в клітинах нейробластоми людини SK-N-SH [27].

    Завдяки своїй універсальності стрептавидин-біотіновая система отримала широке поширення для деяких типів імунодіагностичних

    досліджень з використанням КТ. В даний час КТ, кон'юговані з стрептавідином, і біотінілірованние антитіла комерційно доступні (див., Наприклад, www.invitrogen.com). У той же час застосування цієї системи для створення спрямованих флуорофорів для візуалізації пухлин в організмі людини in vivo обмежена присутністю великої кількості ендогенного біотину, який може конкурувати з біотінілірованние-ними компонентами, знижуючи ефективність мечі-ня.

    Нами запропоновано для отримання кон'югатів КТ з антитілами використовувати Адапторная модуль барназа-барстар, добре зарекомендував себе при отриманні гетеродімерних міні-антитіл і їх флуоресцентних похідних [26, 42, 43]. Цей адап-битий модуль заснований на властивості рибонуклеази барнази з Bacillus amyloliquefaciens утворювати дуже міцний комплекс (Kd ~ 10-14 М) зі своїм природним білковим інгібітором барстаром [26].

    Завдяки тому, що область зв'язування барнази і барстара не включає їх N- і С-кінцеві ділянки, кожен з цих білків можна легко об'єднати генно-інженерними методами в одну поліпептид-ву ланцюг з scFv-фрагментами антитіл. При цьому зберігається ефективність зв'язування компонентів модуля. Невеликі розміри барнази і барстара (110 і 89 а.о. відповідно), стабільність, хороша розчинність і стійкість до протеазам дозволяють напрацьовувати сконструйовані химерні білки в достатній кількості в бактеріальних продуцента. Крім того, барназа в складі рекомбінантних білків відіграє роль внутримолекулярного шаперона, забезпечуючи правильне згортання складних неприродних білків, що особливо важливо при створенні конструкцій з направляючими антитілами [44].

    Невеликі розміри і надзвичайна стабільність в широкому діапазоні умов дозволяють легко кон'югованих як барназу, так і барстар з активними групами на поверхні КТ. Було виявлено також, що кон'югація КТ з барстаром значно зменшує неспецифічне зв'язування КТ з мембраною клітини. Так, флуоресцентні нанокристали, які зазвичай неспецифически налипають на клітини аденокарциноми яєчника людини SKOV-3 і проникають всередину (рис. 3, А), після кон'югації з барста-ром стають практично нейтральними по відношенню до цих клітин (рис. 3, Б). У той же час барстар на поверхні КТ дає можливість за допомогою адапторной системи барназа-барстар додатково оснастити їх направляють антитілами і забезпечити ефективне і специфічне мічення ракових клітин (рис. 3, В).

    Б

    В

    Мал. 4. Мультифункціональні нанокомплексів на основі КТ, магнітних частинок і протипухлинних мініантітел, зібрані за допомогою адапторной системи барназа-барстар. Схема будови нанокомплексів (зліва) і доказ мультифункціональності (праворуч). Пухлинні клітини SKOV-3, мічені нанокомплексів, вишиковуються уздовж намагніченою дроту у формі букв MF (А). Наведено фотографії у видимому світлі (Б - збільшення 100х і Г - окремі клітини) і флуоресцентні зображення (В - збільшення 100х і Д - окремі клітини). QD - квантові точки, MP - магнітні частинки. Адаптовано з [28] (Nikitin MP, Zdobnova TA, Lukash SV, Stremovskiy OA, Deyev SM Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010 107: 5827-5832) з дозволу National Academy of Sciences of the United States of America: [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], copyright (2010) .

    Важлива перевага модуля барназа-барстар -точне співвідношення 1: 1 компонентів в комплексі і повна відсутність їх самоагрегаціі, а також висока афінність взаємодії, що перевершує значення всіх інших дімерізаціонних систем, за винятком стрептавидин-біотіновой. На відміну від стрептавидин-біотіновой системи, використання системи барназа-барстар засноване на генно-інженерних технологіях і не потребує ніяких ковалентних модифікацій антитіл.

    Адапторная система барназа-барстар була успішно використана нами для створення флуоресцентних комплексів для візуалізації пухлинних клітин, гіперекспрессіруют онкомаркер НЕІ2 / пеї, на основі антитіл 4D5scFv і КТ двох типів: 1) модифікованих меркаптоуксусной кислотою; 2) покритих полімерною оболонкою [45, 46]. В обох випадках спостерігали ефективне і виборче фарбування мембран після інкубації клітин аденокарциноми молочної залози і аденокарциноми яєчника людини з отриманим флуоресцентним комплексом.

    Більш того, було показано, що КТ, оснащені за допомогою адаптерів напрямними антитілами, можуть бути приєднані до молекул або наночастицам іншої природи і, таким чином, являють собою компоненти «молекулярного кін-

    структора »[43]. Реалізуючи ідею такого конструктора, ми створили на основі Адапторная модуля барназа-барстар самозбирається мультимодальні конструкції з використанням КТ і магнітних частинок. Отримані флуоресцентно-магнітні наночастинки оснащені гуманізувати міні-антитілами до онкомаркеру НЕІ2 / пеї і здатні ефективно і вибірково мітити відповідні пухлинні клітини [28]. В результаті флуоресцентно-мічені пухлинні клітини набувають властивість магнітоу-правляемості (рис. 4).

    2.3 Проблема неспецифічного зв'язування КТ

    Суттєвою перешкодою для виборчого мічення біологічних об'єктів за допомогою флуоресцентних міток на основі КТ є їх тенденція до «налипання», тобто неспецифическому зв'язування з мембраною клітини, білками і складовими позаклітинного матриксу, а також їх неконтрольоване проникнення всередину клітин. Наприклад, показано, що частинки з сильним негативним або позитивним зарядом, що містять на поверхні карбоксильні або аміногрупи відповідно, мають високий рівень неспецифічного зв'язування з клітинами і тканинами [47, 48]. Причиною такого неспецифічного зв'язування може бути електростатичне взаємодія між зарядженими

    групами на поверхні КТ і зарядженими ділянками білків та інших молекул на поверхні клітин.

    Іншою причиною неспецифічного зв'язування КТ з поверхнею клітин може бути гідрофобна взаємодія між ліпідами клітинної мембрани і молекулами стабілізатора (наприклад, три-н-октілфосфіна або олеат-аніону), що залишається на поверхні КТ після їх синтезу, через неповне покриття ядра наночастинки лигандом, забезпечує гідрофільність, або ж через нестабільне зв'язування цього ліганда. Так, показано, що КТ, в яких використані цистеїн, МУК, дигідроліпоєва і інші меркаптокарбоновие кислоти, які відомі своїм динамічним і нестабільної зв'язком Zn-S, проявляють найбільш високий рівень неспецифічного зв'язування [47].

    Встановлено, що рівень неспецифічного зв'язування сильно залежить від типу клітин [47, 49], що може пояснюватися різним вмістом заряджених і гідрофобних областей на мембрані тих чи інших клітин.

    Для зменшення неспецифічного зв'язування КТ додатково покривають шаром інертних молекул. Одним з таких речовин, широко використовуваним в даний час, є ПЕГ - нетоксичний гідрофільний полімер, який зазвичай застосовується для збільшення биосовместимости ліків [48]. Модифіковані ПЕГ квантові точки мають поверхневий заряд, близький до нейтрального, і колоїдно стабільні в різних експериментальних умовах. Крім того, ПЕГ знижує здатність КТ взаємодіяти з поверхнею клітин або з білками позаклітинного матриксу, тобто призводить до пасивування поверхні КТ [50].

    Слід зазначити, що, незважаючи на успішне застосування КТ, покритих ПЕГ, для експериментів як in vitro, так і in vivo, для деяких цілей такої модифікації виявляється недостатньо. Крім того, покриті ПЕГ частинки мають значно більшим гідродинамічним діаметром, що ускладнює їх доступ до біологічних мішенях [51].

    Щоб мінімізувати неспецифічне зв'язування КТ, не збільшуючи їх розміру, був запропонований метод покриття нанокристалів нейтральної гідроксильної оболонкою [52]. Гідродинамічний діаметр отриманих нанокристалів становить 1314 нм, що на 50% менше розміру нанокристалів, модифікованих ПЕГ. При використанні отриманих комплексів для візуалізації клітин HeLa спостерігалося зменшення рівня неспецифічного зв'язування в 140 разів у порівнянні з нанокристалами з карбоксильними групами на поверхні і в 20 разів у порівнянні з біотінілірованние КТ.

    Для спрямованої доставки таких нанокристалів необхідно оснащувати їх націлюють молекулами, що веде до часткової втрати матеріалу і зменшення виходу кінцевого продукту. У той же час цілком реально зменшити неспецифічне налипання КТ на мембрану клітини і одночасно забезпечити специфічне зв'язування наночастинки з певними рецепторами, експресується на поверхні пухлинної клітини. Було відзначено, що деякі невеликі нейтральні молекули, такі, як пептиди або маленькі білки, здатні зменшувати неспецифічне зв'язування КТ [52]. Нами було показано, що цим властивістю володіє також компонент адапторной системи - бар-стар (див. Вище розділ 2.2, рис. 3).

    3. ДІАГНОСТИКА in vitro

    Однією з найбільш перспективних і швидко розвиваються областей застосування КТ є їх використання в якості флуоресцентних міток при вивченні пухлинних клітин in vitro: для візуалізації пухлинних клітин і для визначення місцезнаходження окремих молекул, експресуються в них. Унікальні властивості КТ, дають можливість багатобарвного мічення і спостереження флуоресценції об'єктів протягом тривалого часу, дозволяють істотно розширити межі традиційних методів, використовуваних в цій області. На сьогоднішній день з усіх варіантів біомедичного використання КТ діагностика in vitro - це єдине застосування КТ, яке може бути швидко впроваджено в клінічну практику (на відміну від застосування КТ in vivo, що вимагає тривалих досліджень токсичності КТ і віддалених наслідків їх введення в організм).

    Основні роботи ведуться в трьох напрямках: 1) візуалізація пухлинних клітин, гіперекспрессіруют певні онкомаркери; 2) фарбування тканин і їх зрізів; 3) спостереження в реальному часі за окремими молекулами і клітинами.

    3.1 Візуалізація пухлинних клітин

    Візуалізація пухлинних клітин і визначення в них окремих онкомаркерів має велике практичне значення. Більшість використовуваних для візуалізації онкомаркерів є рецептори, гіперекспрессіруют на поверхневій мембрані пухлинних клітин і практично не експресуються в нормальних тканинах. Високий рівень експресії таких маркерів свідчить про наявність пухлинного процесу в організмі, а їх детекция і кількісна оцінка важливі для ранньої діагностики, класифікації та терапії пухлин [51].

    Буквально протягом кількох років після виходу піонерських робіт по створенню і використанню біосумісних КТ [14, 15] відразу кілька груп заявили про можливість використання кон'югатів КТ для візуалізації пухлинних клітин. До теперішнього часу створені кон'югати КТ з різними направляючими агентами (антитілами, лигандами, пептидами), призначені для візуалізації клітин клінічно значущих пухлин людини: карциноми простати [53], аденокарциноми і карциноми проток молочної залози [21, 54, 55], карциноми підшлункової залози [56], гліобластоми мозку [32] і плоскоклітинної карциноми мови [57].

    Основні зусилля дослідників в цьому напрямку були зосереджені на оптимізації властивостей КТ для їх застосування в дослідах на живих клітинах і на рівні цілого організму. Переважний упор був зроблений на хорошу розчинність у водних розчинах, біосумісність і низьку токсичність КТ, а також на оснащення КТ напрямними молекулами, що забезпечують специфічність мечі-ня. За короткий термін були розроблені досить прості, дешеві і добре відтворювані методи візуалізації ракових клітин за допомогою КТ для діагностики клінічно значущих видів пухлин і прогнозу перебігу захворювання (таблиця). Таким чином, створено великий методичний доробок для впровадження цих методів в клінічну практику і подальших досліджень in vivo з метою візуалізації пухлин та їх метастазів безпосередньо в живому організмі.

    3.2 Одночасна детекция декількох онкомаркерів

    Як правило, напрямні молекули (антитіла, пептиди, аптамери і ін.), Вибірково зв'язуються з поверхневим онкомаркерів, забезпечують високу специфічність мічення відповідних пухлинних клітин [17]. У той же час така особливість пухлинних клітин, як їх надзвичайна мінливість в процесі розвитку захворювання і в відповідь на вплив лікарських агентів, ставить перед дослідниками завдання одночасної візуалізації відразу декількох поверхневих онкомаркерів. Для вирішення цього завдання в силу своїх фізико-хімічних властивостей КТ підходять як не можна краще (див. Розділ 1).

    Принципова можливість використання КТ для одночасної множинної детекції була продемонстрована на прикладі п'яти пухлинних маркерів в культурі клітин пухлини молочної залози людини. Одночасне виявлення рецепторів ER, PR, EGFR, mTOP і HER2 / neu за допомогою КТ, флуоресціюючих в різних областях спектру, точно корелює з результатами традиційних методів,

    включаючи іммуногістохімію, Вестерн-блот і флуоресцентну гібридизацію in situ, значно прискорюючи аналіз і знижуючи його вартість [61].

    Одночасна візуалізація двох передбачуваних пухлинних маркерів, интегрина avB3 і ну-клеоліна, з використанням КТ, кон'югованих з RGD-пептидом і аптамерами AS1411 відповідно, дозволила порівняти локалізацію цих маркерів в клітці [36]. За допомогою конфокальної мікроскопії були підтверджені интернализация нуклеоліна і поверхневий розподіл интегрина, що, можливо, дозволить уточнити їх участь в процесах, що відбуваються в пухлинних клітинах.

    Результати цих робіт показують, що кон'югати КТ з направляючими молекулами мають потужний потенціал в якості компонентів нових систем для оцінки типу пухлин, стадії їх прогресії і метастатичного потенціалу на основі одночасної візуалізації різних пухлинних маркерів і визначення їх клітинної локалізації (англ. Multiplex imaging).

    Фундаментальні дослідження онкологічних процесів вимагають не тільки детекції гіпер-експресуються в ракових клітинах маркерів, а й виявлення безлічі інших, часто нізкоко-пійних білків. Сучасним золотим стандартом для визначення нізкокопійних білків є імуноферментний аналіз (ІФА), чутливість якого досягає пікомолярной. Цей метод широко використовується, але він досить трудомісткий, недешевий, займає багато часу і не дає можливості одночасного визначення декількох білків. Заміна органічних флуорофорів і кольорових реагентів в імуноферментних дослідженнях на КТ сама по собі не забезпечує значного переваги в чутливості (чутливість аналізу з КТ ~ 100 пмоль) [70], але тільки застосування КТ з різними спектральними характеристиками дає можливість одночасної специфічної візуалізації декількох білків. Так, вдалося одночасно візуалізувати в сандвіч-ІФА чотири токсину, використовуючи чотири різних типи КТ з флуоресценцією в діапазоні 510-610 нм з порушенням на одній довжині хвилі [70]. На жаль, поки авторам не вдалося здійснити кількісну оцінку, і для створення гарного імунофлуоресцентного багатоколірного тесту необхідна подальша робота. В іншій роботі були продемонстровані простота і наочність одночасної детекції двох білків з двома різними за кольором КТ в Вестерн-блот [71]. Немає сумніву в тому, що одночасне багатобарвне мічення за допомогою КТ є новий потужний метод, який дозволить вирішувати не тільки традиційні, але й принципово нові

    HER2 (-)

    HER2 (2+)

    Мал. 5. Переваги КТ в иммуногистохимическом аналізі. Фарбування тканин з різним рівнем експресії HER2 з використанням КТ (А) і стандартного методу з пероксиду-зой (Б). Фотоустойчівость зразків, забарвлених КТ через 2 (в) і 75 діб (Г). Шкала - 100 мкм. Адаптовано з [74] (Chen С., Peng J., Xia H., Yang G., Wu Q., Chen L., Zeng L., Zhang Z., Pang D., Li Y. Biomaterials. 2009 30: 2912-2918) з дозволу Elsevier: [Biomaterials], copyright (2009).

    завдання, вирішення яких із застосуванням відомих підходів було неможливо або надзвичайно складно.

    Одночасне множинне мічення за допомогою КТ з різними спектральними характеристиками дає також незаперечні переваги в дослідженнях, що вимагають високопродуктивного скринінгу молекул. КТ успішно використовують для аналізу численних компонентів клітинних систем за допомогою технології мікрочіпів (англ. Microarray technology), а також для паралельного аналізу геномного і протеомних вмісту здорових і хворих клітин [72]. Яскравість і стійкість КТ значно підвищують чутливість і здатність до паралельної детекції компонентів складних сумішей. Отримані результати можуть сприяти кращому розумінню сигнальних шляхів в клітці і застосовуватися для розробки нових терапевтичних підходів.

    3.3 Иммуногистохимический аналіз

    Найбільш широко використовуваним в клініці методом діагностики пухлин є іммуногістохімі-ний аналіз (ІГХ). Цей метод морфологічного дослідження, в основі якого лежить візуалізація і оцінка за допомогою мікроскопії результатів реакції антиген-антитіло в зрізах біопсірованной-них тканин, дозволяє не тільки побачити наявність і інтенсивність сигналу, але і оцінити розподіл сигналу в клітині (фарбування мембрани, ци-

    топлазме, ядра та інших структурних елементів). Імунохімічної фарбування фіксованих формаліном тканин і парафінових зрізів зразків біопсії пухлин - непросте завдання через високу аутофлуоресценціі тканин і зменшення кількості антигену в процесі фіксації і включення в парафін.

    Виявилося, що для вирішення цього завдання як не можна краще підходять КТ. З використанням КТ були отримані зображення фіксованих зрізів тканин базально-клітинної карциноми людини [60], пухлини молочної залози миші, гіперекспрессіруют людський рецептор НЕІ2 / пеї [16], базально-плоскоклітинної карциноми шкіри людини [73]. На прикладі тканини пухлини молочної залози людини показано також, що на основі КТ можна створювати зонди для кількісного і дуже чутливого виявлення слабкої експресії поверхневих ракових маркерів, зокрема онкомаркера НЕІ2 / пеї [74]. Дослідники також відзначають високу фотостабільність препаратів, забарвлених КТ: інтенсивність їх флуоресценції не змінюється протягом 9-75 днів [74] (рис. 5).

    Комбінування традиційних методик ІГХ з флуоресцентними барвниками на основі КТ дозволяє значно поліпшити дозвіл і чутливість методу (див. Огляд [17]), а також дає можливість одночасної візуалізації декількох маркерів [75]. Крім того, застосування КТ робить метод ІГХ набагато більш наочним (рис. 5).

    40 I ACTA NATURAE | TOM 3 № 1 (8) 2011

    Візуалізація пухлинних клітин людини з використанням КТ

    Пухлина Лінія клітин (тип пухлини) Рецептор-мішень Направляючий модуль Тип КТ Метод візуалізації Примітка Посилання

    Пухлини простати С4-2 PSMA Повнорозмірні моноклональні антитіла Д591 CdSe / ZnS КТ, покриті амфіфільних полімерами Флуоресцентна мікроскопія клітин в культурі і тканин post mortem, неінвазивний отримання зображення цілого тваринного in vivo Проведено порівняння активної і пасивної доставки [53] *

    ИЧСаР (карцинома) аптамерами А10 RNA Комерційні CdSe / ZnS КТ, покриті полімером з карбоксильними групами на поверхні (EviTag) Конфокальна мікроскопія клітин в культурі Створено мультифункціональні (флуоресцентні та терапевтичні) конструкції КТ з доксирубіцином [35]

    С4-2В (пухлина простати з метастазами в кістковій тканині) Повнорозмірні моноклональні антитіла Д591 Qdot® 800 Antibody Conjugation Kit (Invitrogen) Неинвазивная візуалізація in vivo за допомогою системи для візуалізації IVIS Показана можливість візуалізації метастазів в кістковій тканині [58] *

    ИЧСаР Пептид СР1 CdSe / ZnCdS KT, покриті цистеїном, модифіковані ПЕГ Флуоресцентна мікроскопія клітин в культурі, флуоресцентна візуалізація органів post mortem Створено КТ невеликого розміру, здатні швидко виводитися з організму через нирки [59] *

    ау | 33-інтегринів Пептид RGD

    Пухлини молочної залози МБА-МВ-435 (карцинома проток молочної залози) Ендотеліальні клітини пухлинних судин Пептиди ОЕЕ і ЬуР-1 CdSe / ZnS КТ, модифіковані МУК Конфокальна мікроскопія клітин в культурі і тканин post mortem Проведено порівняння рівня поглинання органами РЕМ звичайних КТ і КТ , модифікованих ПЕГ [31] *

    вК-ВН-З (аденокарцинома) HER2 / neu Г уманізірованние моноклональні антитіла ТгаеШгітаЬ (Негсер ^ п®) Комерційні CdSe / ZnS КТ, покриті полімером з карбоксильними групами на поверхні (Quantum Dot Corporation) Флуоресцентна мікроскопія фіксованих клітин в культурі Показана можливість одночасної візуалізації декількох мішеней як на поверхні мембрани, так і всередині клітини [16]

    МСЕ-7 р-Г лікопротеін Первинні анти-р-глікопротеїн-антитіла і вторинні антімишіние поліклональні антитіла, кон'юговані з КТ CdSe / ZnS КТ, модифіковані цистеїном і покриті полімером з аміногрупами на поверхні Конфокальна мікроскопія клітин в культурі, флуоресцентна імуногістохімія Проведено порівняння фотостабільні КТ з органічними барвниками [60]

    ] \ №А-МВ-435 ау | 33-інтегринів Пептид RGD (аргініл-гліцил-аспарагінова кислота) CdTe / ZnS, модифіковані ПЕГ, з аміногрупами на поверхні (комерційна назва «Qdot® 705 ITK ™ amino (PEG) quantum dots» , Invitrogen) Флуоресцентна мікроскопія клітин в культурі [32]

    МСЕ-7 (аденокарцинома), ВТ-474 (карцинома проток молочної залози) EGFR, HER2 / neu Повнорозмірні моноклональні антитіла Qdot® Antibody Conjugation Kit (Invitrogen) Флуоресцентна мікроскопія фіксованих тканин Показана можливість використання КТ для ІГХ з одночасним міченням декількох онкомаркерів [61]

    КРЬ-4 HER2 / neu Г уманізірованние моноклональні антитіла ТгаеШгітаЬ (Негсер1лп®) Qdot® Antibody Conjugation Kit (Invitrogen) Конфокальна мікроскопія in vivo Спостереження за пересуванням окремих частинок в живому організмі в реальному часі після введення в хвостову вену. Показані рух, швидкість, траєкторія руху спрямованих комплексів КТ по ​​судинах пухлини і їх міграція в пухлинні клітини [54] *

    ОГЛЯД

    ТОМ З №1 (8) 2011 I ACTA NATURAE I 41

    SKBR-3, MCF-7 / HER2 HER2 Міні-антитіла формату есГу Комерційні CdSe / ZnS, покриті полімером з карбоксильними групами на поверхні (Invitrogen) Флуоресцентна мікроскопія і проточна цитометрії клітин в культурі, візуалізація пухлини in vivo на модельному тваринному Створення складних мультифункціональних конструкцій на основі іммуноліпосом з КТ і міні-антитілами [62]

    KPL-4 HER2 / neu Г уманізірованние моноклональні антитіла ТгаеШгітаЬ (Негсер1лп®) Qdot® 800 Antibody Conjugation Kit (Invitrogen) Оптична система для ЗБ-спостережень на основі модифікованого епіфлуоресцентного мікроскопа Спостереження за пересуванням окремих частинок в живому організмі в реальному часі після введення в хвостову вену [63] *

    MCF-7 IGF1R Г уманізірованние моноклональні антитіла АУЕ-тисячі шістсот сорок дві Qdot® Antibody Conjugation Kit (Invitrogen) Флуоресцентна мікроскопія, проточна цитометрия Вимірювання рівня експресії рецептора в клітині [55]

    Пухлина печінки HCCLM6 (карцинома) AFP Мишині моноклональні анти-АГР-антитіла CdSe / ZnS KT, модифіковані тиогликолевой кислотою, розчинені в PBS Візуалізація пухлин in vivo і окремих органів post mortem; флуоресцентна мікроскопія тканин post mortem Порівняння пасивної і активної доставки [64] *

    Мишачі моноклональні анти-АГР-антитіла CdSe / ZnS з максимумом 590 нм, модифіковані тиогликолевой кислотою Біохімічний аналіз крові, конфокальна мікроскопія тканин, кількісний аналіз рівня Cd і Se з використанням мас-спектрометрії з індуктивно зв'язаною плазмою (ICP-MS) Візуалізація пухлини і метастазів . Проведено оцінку токсичності і біосумісності, досліджена фармакокінетика, кількісний розподіл по тканинах [65] *

    Пухлина подже- лудочной залози MIA PaCa-2 (карцинома) Клаудина-4, PSCA Анти-Клаудина-4 і анти-Р8СА-моноклональні антитіла InP / ZnS, модифіковані меркаптоянтарной кислотою Отримання зображень in vivo за допомогою системи «Maestro», конфокальна мікроскопія зрізів успішне використання для візуалізації модельної пухлини з нетоксичними КТ, що не містять кадмію [56] *

    MIA PaCa-2 EGFR Міні-антитіла формату есГу CdSe / ZnS, покриті амфіфільних полімером і модифіковані короткими ланцюжками ПЕГ Конфокальна мікроскопія зрізів тканин Вивчено розподіл по органах при пасивної і активної доставці [25] *

    Пухлина кишечника НСТ166 EGFR ЕСГ Qdot® 800ITK ™ amino (PEG) quantum dots (Invitrogen) Отримання оптичних серій зображень зрізів органів post mortem Досліджено динаміку накопичення спрямованих і ненаправленої КТ в пухлинної тканини [66] *

    Пухлина шийки матки HeLa (аденокарцинома) р-Г лікопротеін Моноклональні антитіла 4ЕЗ CdSe / ZnS, модифіковані DHLA Флуоресцентна мікроскопія живих клітин в культурі Стабільність фарбування протягом тижня, можливість довготривалих досліджень з КТ [67]

    Пухлина мозку U-87MG (гліобластома) ау | 33-інтегринів Пептид RGD CdTe / ZnS, модифіковані ПЕГ, з аміногрупами на поверхні (комерційна назва «Qdot® 705 ITK ™ amino (PEG) quantum dots», Invitrogen) Конфокальна мікроскопія клітин в культурі і кріосрезов пухлинної тканини. Отримання зь-зображення тваринного in vivo за допомогою системи для візуалізації «Maestro» Порівняння активної і пасивної доставки, ясно видно накопичення КТ в органах РЕМ в обох випадках [32] *

    Пухлина мови Тса8113 (плоскоклеточная карцинома) р-Г лікопротеін Первинні анти-р-глікопротеїн-антитіла, вторинні біотінілірованние анти-мишачі поліклональні антитіла, стрептавидин, кон'югат біотину з КТ CdTe, модифіковані тиогликолевой кислотою Флуоресцентна мікроскопія Використано КТ, синтезовані в водних розчинах [57 ]

    Пухлина яєчників А431 (плоскоклеточная карцинома) EGFR ЕСГ Комерційні CdSe / ZnS, покриті полімером, кон'юговані з стрептавідином (Invitrogen) Конфокальна мікроскопія і проточна цитометрії клітин в культурі Відстеження шляхів пересування окремих молекул в клітині [П]

    Флуоресцентна мікроскопія клітин, FRET, атомно-силова мікроскопія Відстеження шляхів пересування окремих молекул в клітині і димеризации рецепторів [68]

    Пухлина ротової порожнини КВ (плоскоклеточная карцинома) фолатного рецептор Фолієва кислота InP / ZnS Конфокальна і двухфотонная мікроскопія клітин в культурі Специфічна візуалізація пухлинних клітин з використанням нетоксичних КТ, що не містять кадмію [69]

    'Візуалізація пухлин в організмі модельних тварин.

    ОГЛЯД

    3.4 Спостереження в реальному часі за молекулярними процесами і клітинами

    Висока стійкість КТ до фотовицветанію, а також їх висока яскравість дозволяють використовувати їх для візуалізації процесів, що відбуваються в клітинах, в тому числі для відстеження динаміки окремих молекул [41]. Особливий інтерес представляють мембранні білки, дослідження місцезнаходження та динаміки яких важливо для розуміння таких процесів, як хемотаксис, міжклітинна і внутрішньоклітинна передача сигналів. Так, КТ, кон'юговані з відповідними направляючими лигандами, були успішно використані для візуалізації динаміки рецепторів гліцину [12] і у-аміномасляної кислоти [76] в клітинах нейронів в культурі.

    Оскільки багато значущих онкомаркери є білки, які виконують в нормальних клітинах регуляторні функції і беруть участь у передачі сигналу, вивчення функціонування таких білків важливо для розуміння природи і механізмів процесу малігнізації. КТ, кон'юговані з епідермальний чинником зростання (EGF), були використані для вивчення механізмів інтерналізації EGF і шляхів передачі сигналу за участю білків сімейства трансмембранних рецепторів тирозинкіназ erbB1 / 2/3 [11].

    Було показано, що КТ можуть бути використані для вивчення рухливості пухлинних клітин з метою визначення їх інвазивного потенціалу [77]. Застосування КТ в якості маркерів для візуалізації траєкторії руху клітин менш трудомістким і дозволяє отримувати більш достовірні дані, ніж традиційний аналіз в камері Бойд.

    Ці нові і надзвичайно цікаві напрямки досліджень поки не знайшли застосування в клінічній діагностиці, але безумовно будуть розвиватися як область фундаментальної науки і сприяти отриманню нових знань про патогенез пухлин.

    4. ВІЗУАЛІЗАЦІЯ in vivo НА МОДЕЛЬНИХ ТВАРИН

    За останні п'ять років досягнуто значних успіхів в застосуванні КТ як флуорофорів в експериментах на клітинах і фіксованих тканинах. У той же час використання цих наночастинок для візуалізації в багатоклітинних організмах, особливо таких високоорганізованих, як ссавці, тільки починає розроблятися.

    При флуоресцентного мічення на рівні цілого організму виникають дві основні проблеми: 1) ослаблення сигналу в зв'язку зі збільшенням розмірів організму і товщини тканин; 2) ускладнення доставки флуорофорів до цільових клітин і тканин.

    Глибина проникнення флуоресценції є основною проблемою, оскільки біологічні тканини послаблюють більшу частину сигналів, використовуваних для візуалізації, і, крім того, мають значну аутофлуоресценціей в зеленому діапазоні. Однак в ІК-діапазоні спектра існує так зване «вікно прозорості» (650-1300 нм), в якому поглинання світла живими тканинами мінімально. Існування такого вікна пояснюється тим, що основні Хромофор ссавців (кров, флавін, вітаміни і NAD (P) H) мають мінімальний рівень поглинання в цій області [78]. Тому для візуалізації in vivo використовують КТ, флуоресцирующие в ближньому ІЧ-діапазоні (700-800 нм), що дозволяє підвищити яскравість одержуваного сигналу і знизити фон.

    Транспорт флуорофора до клітин-мішеней в організмі ссавців складний і многоетапен, оскільки транспортуються речовини повинні подолати ряд структурних і фізіологічних бар'єрів. Серед них можна відзначити ендотелій стінок судин, імунний бар'єр і метаболічну деградацію вводяться речовин. Крім того, введений внутрісистемного флуорофор разом з потоком крові може потрапляти в нецільові органи і тканини організму і накопичуватися там, погіршуючи контрастність, а також збільшуючи ймовірність хибнопозитивних сигналів і прояви токсичного ефекту. Тому надлишки флуорофора, що не зв'язалися з цільовими клітинами, повинні швидко і повністю виводитися з організму.

    4.1 Детекція пухлин з використанням КТ

    В живому організмі накопичення введених внутрішньовенно КТ в пухлинної тканини для її подальшої візуалізації можливо завдяки двом механізмам: 1) пасивного, характерному для частинок певного розміру і 2) активного, за допомогою направляючого агента [53] (рис. 6).

    У разі пасивного механізму частки нано-метрових розмірів вибірково накопичуються в пухлинної тканини завдяки її структурними особливостями. Такі частинки легко проникають в пухлину за рахунок збільшеної проникності стінок судин і затримуються в ній через відсутність нормального лімфатичного дренування. Доведено, що капілярна проникність ендотеліального бар'єру у знову васкулярізіруемих пухлинах значно вище, ніж в нормальних тканинах. Нормальні тканини вистелені нефенестрірованним судинним ендотелієм, і проходження макромолекул і наночастинок в тканину утруднено. Кровоносні судини, сформовані в процесі індукованого пухлиною ангіогенезу, мають нехарактерне будова і широкі ендотеліальні пори. Ці пори настільки великі,

    Активна доставка Пасивна доставка

    Стінка судини нормальної Стінка судини тканини пухлинної тканини

    КТ, кон'юговані / |- з напрямних агентом

    ? 51 Біоінертні КТ

    | Д | Клітка епітелію судин

    Оп.'олевая клітина I, О) зі специфічними

    'Рецепторами на поверхні

    ~ Л

    Мал. 6. Механізми доставки КТ в пухлину після внутрішньовенного введення.

    що молекули розміром до 400 нм можуть виходити з судин і акумулюватися в пухлинної тканини [79]. Крім того, в пухлинної тканини практично відсутня дренування лімфатичною системою, тому макромолекули залишаються там тривалий час. Описаний ефект збільшеною проникності і утримування (англ. EPR-ефект - enhanced permeability and retention) використовується для доставки в пухлини терапевтичних і діагностичних агентів на основі латексів, ліпосом та інших частинок [80]. При цьому для збільшення вибірковості мічення в разі пасивної доставки використовують «біоінертні» КТ, покриті ПЕГ і мають мінімальний рівень неспецифічного зв'язування з білками і клітинами крові [53].

    Для активної доставки КТ до пухлин їх постачають напрямними молекулами, які зв'язуються зі специфічними рецепторами, експонованими на поверхні пухлинних клітин (див. Розділ 2.1).

    Вперше можливість прижиттєвого мічення пухлин квантовими точками була продемонстрована на мишачих моделях. Показано, що після внутрішньовенного введення кон'югати КТ з пептидами, специфічними до різних типів пухлин і їх судинах, вибірково накопичуються в судинної мережі пухлини [31].

    Перший успіх застосування КТ in vivo стимулював появу великої кількості робіт, присвячених

    прижиттєвої візуалізації модельних пухлин людини в організмі тварин з застосуванням КТ, націлених на різні пухлинні маркери. Як напрямні агентів однаково успішно використовували повнорозмірні антитіла і їх фрагменти, специфічні пептиди і природні ліганди (таблиця). Результати цих робіт показують, що використання активного механізму доставки в порівнянні з пасивною доставкою значно збільшує накопичення КТ в пухлини незалежно від типу використовувалися КТ і від типу направляючого агента (рис. 7). Використання спрямованих КТ як флуорофорів в поєднанні з сучасними методами оптичного имид-жинга також дозволяє візуалізувати не тільки солідні пухлини, а й метастази в органах [65] і в кістковій тканині [58], а також виявляти мікрометастази на ранніх стадіях захворювання [81] . Необхідно відзначити, що у всіх випадках поряд з успішним маркуванням пухлин in vivo як активним, так і пасивним методом також спостерігалося неспецифічне накопичення КТ в різних органах модельних тварин, перш за все в печінці, селезінці і лімфовузлах (рис. 7).

    КТ можуть також мати велике діагностичне значення при місцевому введенні. Так, наприклад, було показано, що КТ різного кольору, введені в периферичні ділянки тіла, локалізувалися в раз-

    Мал. 7. Флуоресцентна ІК-візуалізація мишей з пухлинами гліобластоми людини U87MG (щеплені під ліву лопатку, вказані білими стрілками). Тварині зліва були введені внутрішньовенно кон'югати КТ з напрямних пептидом RGD, тварині справа - некон'югірованная КТ в тій же концентрації. Зеленим кольором показана аутофлуоресценція тканин, червоним - флуоресценція КТ. Помітно сильне накопичення КТ в печінці, кістковому мозку і лімфатичних вузлах. Адаптовано з [32] (Cai W., Shin DW, Chen K., Gheysens O., Cao Q., Wang SX, Gambhir SS, Chen X. Nano Lett. 2006 6: 669-676) з дозволу American Chemical Society: [Nano Letters], copyright (2006)

    них лімфовузлах, фарбуючи їх у відповідні кольори [82]. Останнім часом великий обсяг досліджень присвячений візуалізації сторожових лімфовузлів, за якими зазвичай починається поширення метастазів [83, 84]. Інтраопераційна візуалізація первинної пухлини разом зі сторожовими лимфоузлами дає можливість визначити розмір операційного поля і необхідність лімфо- диссекции [85].

    Розмір КТ і їх здатність до двухфотонная порушення привернули увагу дослідників до цих часток як до перспективного контрастує агенту для ангіографії, альтернативного традиційно застосовується для цих цілей флуорес-

    процентних декстрану. Завдяки великому перетину двухфотонного поглинання (на 2-3 порядки більше, ніж у традиційних органічних барвників) КТ можна порушувати в ІК-діапазоні. Це дозволяє домогтися більш високої роздільної здатності і на більшій глибині тканини (так як довгі хвилі розсіюються менше, ніж короткі), а також зменшити ступінь фототоксичности (так як збуджуючі фотони в ІК-частини спектру володіють меншою енергією і, отже, менш руйнівні для досліджуваної тканини ) [86]. Дійсно, використання двухфотонного збудження КТ для контрастування кровоносних судин пухлинної тканини значно покращує контрастність зображення в порівнянні з традиційними методами [87].

    Таким чином, результати робіт по прижиттєвої візуалізації пухлин, наведені вище, показали, що з-за високого рівня поглинання органами ретикулоендотеліальної системи (РЕС) і відсутності повного виведення з організму (див. Розділ 5.2 даного огляду) клінічне використання КТ в якості контрастують агентів для візуалізації in vivo пов'язане з певними труднощами. У той же час виняткова яскравість, високий квантовий вихід, а також велике перетин двухфотонного поглинання, що визначає яскравість флуорофора в многофотонной мікроскопії дозволяють успішно використовувати КТ як надійні візуалізують агенти для вивчення анатомії і патофізіології пухлин на тваринних моделях. Застосування КТ значно посилює існуючі методи прижиттєвої мікроскопії пухлин і їх мікрооточення. Комбінація виняткових спектральних властивостей КТ і сучасних технологій, що дозволяють отримувати зображення in vivo з високою роздільною здатністю, може привести до істотного прориву в розумінні біології пухлин.

    4.2 Біораспределеніе і фармакокінетика КТ

    Вирішальними факторами для успіху діагностики пухлин in vivo є високий вміст Флу-орофора в пухлини в порівнянні з його вмістом в нормальних тканинах і крові, а також відсутність хибнопозитивних сигналів. Крім того, діагностичні агенти повинні швидко виводитися з організму.

    У дослідженнях in vitro було показано, що поведінка і доля КТ в клітці залежать значною мірою від розміру і хімічних властивостей поверхні цих частинок [88, 89]. Передбачалося, що ці ж параметри будуть відігравати важливу роль і в розподілі КТ в організмі.

    При вивченні біораспределенія КТ в організмі модельних тварин виявилося, що все КТ повно-

    стю видаляються з кровотоку і акумулюються в органах і тканинах [90], перш за все в органах РЕЗ (печінки, селезінці і лімфовузлах). Аналогічні результати були отримані при візуалізації пухлин: поряд з накопиченням мітки в пухлини частина КТ затримувалася також в органах РЕЗ [25, 31, 32, 53, 65]. У тканинах легенів, серця, м'язів і мозку КТ майже у всіх випадках виявлено не було, в деяких роботах спостерігали невеликий вміст КТ в нирках. Причому, що несподівано, такий розподіл не залежало від властивостей поверхні і виду кон'югованого з КТ направляючого агента (або відсутність такого), а наявність ПЕГ на поверхні частинок лише трохи збільшувало час циркуляції в крові, але не виключало повністю накопичення в цих органах. Час напіввиведення КТ з кровотоку варьировало від декількох хвилин до декількох десятків годин і сильно залежало від їх гідродинамічного діаметра [91], а також від заряду і структури поверхні [92].

    У цьому контексті цікава робота, в якій було проведено пряме порівняння КТ і стандартного органічного барвника Alexa Fluor 680, кон'югованих з анти-IGF1R-антитілами в експериментах на модельних тварин in vivo [55]. Було показано, що обидва флуорофора дозволяють специфічно візуалізувати пухлину молочної залози, проте КТ істотно гірше виводяться з організму, накопичуючись в органах РЕМ.

    Початкові результати робіт, присвячених дослідженню впливу розміру і властивостей поверхні КТ на їх розподіл в організмі після внутрішньовенного введення, досить суперечливі. Так, в ряді досліджень було показано, що поверхневе покриття [93, 94] і розмір [94] сильно впливають на фармакокінетику і біораспределеніе частинок. З іншого боку, в систематичному дослідженні [95], проведеному з одночасним урахуванням всіх факторів, які можуть впливати на біораспределеніе, не спостерігалося жодних значущих відмінностей між КТ різного розміру, з різним зарядом і наявністю або відсутністю на поверхні різних молекул (альбумін, ПЕГ) - все КТ накопичувалися в першу чергу в печінці і селезінці.

    КТ можуть виводитися з організму двома шляхами: через нирки і через печінку [93, 96]. Шлях виведення найбільшою мірою залежить від двох параметрів частинок: розміру і поверхневого покриття, що визначає схильність до адсорбції білків сироватки крові [78]. Вивчення виведення з організму спеціально створених серій КТ різного розміру і з різним покриттям [59] показало, що одним з обов'язкових критеріїв для повного виведення наночастинок з організму через нирки є зна-

    чення гідродинамічного діаметра КТ менше 5.5 нм (тобто нижче порога ниркової фільтрації). На сьогоднішній день все синтезовані КТ з флуоресценцією в червоному і ближньому ІЧ-діапазоні, що використовуються для візуалізації in vivo, мають більший розмір (близько 10 нм) і в принципі не можуть виводитися через нирки. Крім того, ці КТ покриті полімером для кращої стабільності і містять на поверхні заряджені функціональні групи і ПЕГ, що ще більше збільшує їх розмір. Так, наприклад, гідродинамічний діаметр широко використовуваних комерційних КТ виробництва Invitro-gen - 15-19 нм [82]. Для таких великих небіодегра-діруемих КТ залишається тільки один шлях виведення з організму - через печінку, в складі жовчі. Це дуже повільний і неефективний процес, а довготривале перебування наночастинок в органах РЕМ підвищує можливість руйнування оболонки КТ і виникнення токсичного ефекту. Таким чином, для КТ, що ідеально підходять за своїми іншим (крім гідродинамічного діаметра) характеристикам для візуалізації пухлин in vivo, накопичення в печінці, селезінці та інших органах РЕЗ неминуче. Цікаво, що деякі автори відзначали в нирках накопичення КТ з гідродинамічним діаметром, що значно перевищують поріг ниркової фільтрації [95, 97]. Без проведення додаткових досліджень важко сказати, чи є наведені дані артефактом або свідчать про якісь, ще не вивчених механізми взаємодії наночастинок з живим організмом. У будь-якому випадку, утруднене виведення з організму залишається одним з основних перешкод для застосування КТ в організмі людини.

    5. ризик застосування кт в біологічних

    І МЕДИЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

    Унікальні фізико-хімічні властивості КТ роблять їх надзвичайно привабливими флуо-рофорамі для візуалізації живих об'єктів in vivo. Піонерські роботи в цій області з'явилися порівняно недавно (менше 10 років тому), і пошук оптимального для цих цілей дизайну КТ ведеться досі. У зв'язку з цим КТ, використовувані окремими лабораторіями, сильно розрізняються за такими параметрами, як розмір, форма, заряд, концентрація, окислювально-відновні властивості, поверхневе покриття і фізична стабільність. Широкий діапазон цих параметрів, а також різні умови експериментів (час обробки, вибір модельних клітинних ліній і середовища, вживання однакових одиниць концентрації, наявність або відсутність направляючого агента) сильно ускладнюють порівняння літературних даних про біо-

    безпеки КТ і складання загальної картини. Однак серед вкрай різноманітною та суперечливої ​​інформації все ж було виявлено ряд закономірностей [90, 98].

    5.1 Цитотоксичність КТ

    Цитотоксичну дію КТ визначається в основному чотирма факторами: наявністю в їх складі іонів важких металів, здатністю генерувати активні форми кисню (АФК), колоїдної нестабільністю і неспецифічним взаємодією з біологічними молекулами [90, 98].

    КТ першого покоління, що складаються тільки з флуоресцентного ядра (CdTe або СdSe) і стабілізовані тіоловими лигандами (наприклад, цистеїном або МУК), легко піддаються окисленню і деградації з вивільненням токсичних іонів кадмію [99], а також здатні індукувати освіту АФК [100]. Такі частинки надзвичайно токсичні для клітин в культурі навіть в невеликих концентраціях і тому непридатні для досліджень на живих об'єктах.

    КТ другого покоління забезпечені оболонкою з інертного сульфіду цинку для запобігання безизлучательной дисипації енергії. Крім того, як виявилося, така оболонка перешкоджає окисленню і деградації флуоресцентного ядра і вивільненню іонів кадмію, що значно знижує цитотоксичність. У той же час для КТ, стабілізованих дешевим і простим методом з використанням невеликих тіолових лігандів, характерна недостатня колоїдна стабільність [99]. Осадження агрегатів таких КТ на поверхні клітин, навіть без проникнення всередину, може викликати фізичні ушкодження, порушення функціонування і, в кінцевому підсумку, смерть клітини [89]. КТ другого покоління в принципі застосовні для короткочасних досліджень на культурі клітин, але існує великий ризик при їх використанні в організмі.

    В даний час в більшості біологічних досліджень застосовують КТ третього покоління -CdSe / ZnS-частинки, оточені полімерної або силіконовою оболонкою. Ці КТ набагато стабільніші коллоидно, хімічно і оптично порівняно з їх аналогами, покритими невеликими лигандами. КТ третього покоління проявляють деяку токсичність в культурі клітин лише в екстремальних умовах або при використанні в концентраціях, на порядок перевищують необхідну для фарбування і візуалізації клітинних мішеней [89, 101]. Такі КТ є найбільш перспективними для застосування в організмі. Однак при їх конструюванні необхідно враховувати, що КТ - НЕ молекули, а на-

    ночастіци, і для них, так само як і для інших наночастинок, більш важливим для прояву токсичності є не склад, а фізико-хімічні властивості поверхні. Деякі біоінертні наночастинки (золоті, вуглецеві) надають на клітини таке ж токсичний вплив, як і КТ. Наприклад, золоті наночастинки і КТ, покриті однією і тією ж оболонкою з амфіфільних полімерів, однаково викликали фізичні ушкодження клітин молочної залози в культурі і индуцировали їх відкріплення від підкладки [89]. Таким чином, хоча додаткове вторинне стійке покриття запобігає окисленню і деградацію КТ, воно саме може робити внесок в загальну токсичність частинок [102].

    Підсумовуючи вищевикладене, слід зазначити, що з моменту створення перших колоїдних КТ для біологічного застосування проведена велика робота по зниженню їх токсичності, в основному завдяки використанню різних покриттів, і створений заділ для їх застосування in vivo.

    5.2 Системна токсичність in vivo Дослідження цитотоксичності in vitro є важливим і необхідним етапом розробки агентів для діагностики і терапії на основі КТ, оскільки дозволяє прискорити і стандартизувати процес відбору найбільш придатних за всіма параметрами частинок для застосування in vivo. Однак для впровадження КТ в клінічну практику таких досліджень, як правило, недостатньо. При використанні КТ для візуалізації в організмі необхідно поряд з колоїдної природою і фізико-хімічними властивостями поверхні цих частинок додатково враховувати їх взаємодію з імунною системою, а також можливість фізико-хімічного руйнування в умовах агресивних середовищ організму з вивільненням токсичних елементів з їх флуоресцентного ядра.

    До теперішнього моменту отримані дані по взаємодії з імунною системою деяких типів наночастинок (ліпосомних, вуглецевих, золотих, магнітних) [103]. Показано, що після введення в кров наночастинки швидко піддаються опсонізації і подальшого фагоцитозу клітинами імунної системи. Крім того, їх введення в кров може викликати агрегацію тромбоцитів, активацію системи комплементу і стимуляцію або пригнічення імунної системи [103]. Відносно КТ експериментальні дані по цій темі поки практично відсутні. Можна було припустити, що взаємодія КТ з імунною системою аналогічно взаємодії, характерному для інших наночастинок. Дійсно, в роботі японських авторів [104] показано, що як in vitro, так і in vivo КТ не викликають повели-

    чення цитокиновой продукції CD4 + Т-лімфоцитами, але стимулюють проліферацію клітин імунної системи.

    Дані першого систематичного дослідження токсичності і біораспределенія КТ в організмі були опубліковані зовсім недавно [95]. На щурячих моделях були вивчені короткочасні (до 7 днів) і віддалені (більше 80 днів) біологічні ефекти КТ з різним полімерним покриттям. Були проведені стандартні клінічні біохімічні та гематологічні тести, а також гістологічні дослідження органів. Всупереч очікуванням, після внутрішньовенного введення КТ, що містять на поверхні карбоксильні групи, ПЕГ або бичачий сироватковий альбумін, в сумарній дозі 60 нмоль / тварина, введеної протягом чотирьох тижнів, ні для одного з варіантів частинок виражену токсичність відзначено не було.

    Дослідники, які вивчають біораспределеніе КТ в організмі і можливість візуалізації пухлин in vivo, також неодноразово відзначали відсутність під час експерименту ознак гострої токсичності у тварин, відсутність некрозів і збереження морфології тканин [86, 93, 96]. Однак можливість накопичення і деградації КТ в організмі не виключає їх прихованої токсичності і відкладеного дії.

    Стабільність КТ всередині тканин і органів РЕМ викликає суперечки. Деякі автори показали, що КТ, покриті полімером, зберігають свою морфологію і флуоресцентні властивості в тканинах протягом тривалого часу (до 4 місяців), не наражаючись руйнування з вивільненням потенційно токсичних складових елементів [96, 97]. У той же час в деяких випадках була відзначена деградація таких частинок в організмі, що веде до зміни флуоресценції [53]. Цей процес здається цілком можливим, оскільки в експериментах in vitro показано, що деякі джерела АФК, такі, як пероксид водню і хлорнуватиста кислота, які завжди присутні в клітці в невеликих кількостях, можуть проникати через полімерну оболонку і викликати деградацію флуоресцентного ядра [105]. Можливо також, що руйнування в організмі піддається лише частина КТ, а частина залишається інтактен-ної, і співвідношення цих частин - питання часу (місяців і навіть років) [95].

    Таким чином, явною токсичності КТ в модельних організмах показано не було. Однак наявність численних факторів ризику, недолік даних, а також відсутність довгострокових досліджень не дозволяють зробити остаточний діагноз безпеки застосування КТ для організму. Деякі уривчасті і суперечливі відомості

    про токсичність КТ, що зустрічаються в роботах, присвячених біораспределенію цих наночастинок, лише підкреслюють необхідність повномасштабних досліджень, які зачіпають різні системи органів, для адекватної оцінки ризику використання КТ in vivo.

    ВИСНОВОК: ПРОБЛЕМИ І ПЕРСПЕКТИВИ

    Квантові точки - це відносно новий клас сполук, що володіє великим потенціалом для застосування в різних видах діагностики пухлин від визначення онкомаркерів на мікропланшетів до неінвазивної візуалізації пухлин in vivo. Унікальні фізико-хімічні властивості КТ: легко настроюються спектри флуоресценції, високий квантовий вихід (особливо в ІК-області), можливість порушення в широкому діапазоні довжин хвиль і вузькі піки флуоресценції, велике перетин двухфотонного поглинання, стійкість до фотовицветанію, - дозволяють істотно розширити можливості сучасних методів флуоресцентної візуалізації і оптичної діагностики. Ці флуорофор дозволяють вирішувати завдання, важко здійсненні за допомогою традиційних барвників: наприклад, проводити одночасну детекцию декількох маркерів, протягом тривалого часу стежити за молекулярними процесами в реальному часі і отримувати зображення новоутворень в глибині тканин. У той же час для ряду рутинних завдань проблеми, пов'язані з колоїдної природою КТ, значно переважують переваги їх оптичних властивостей.

    Щодо велика площа поверхні КТ, доступна для хімічної модифікації, і можливість приєднання інших молекул і частинок також дозволяють отримувати на основі КТ різноманітні мультимодальні конструкції, що містять поряд з КТ частки іншої природи (золоті, магнітні, алмазні, ліпосомного і ін.) (Рис. 3) [28, 106] і що володіють одночасно напрямними, діагностичними та терапевтичними властивостями [107]. Подібні багатофункціональні наноустройства призначені для одночасної доставки чинного агента до пухлини і стеження за цим процесом [35, 62]. Подальша оптимізація биосов-местімих КТ сприятиме розвитку таких інноваційних підходів в онкології, як хірургічне втручання під контролем навігаційних систем (англ. Image-guided surgery), визначення молекулярного профілю пухлини, персоналізована діагностика і терапія [108].

    Успіх реалізації великого потенціалу КТ і широке впровадження його в діагностику in vivo залежать від рішення наступних нагальних завдань. перш

    за все, це проведення довготривалих токсикологічних досліджень і ретельне вивчення відкладеного ефекту введення КТ. До справжнього моменту вже розроблені покриття на основі полімерних матеріалів [109], які значно збільшили біоінертністю КТ і суттєво знизили їх токсичність, однак через накопичення КТ в органах ретикулоендотеліальної системи і повільного виведення з організму безпеку їх застосування в живому організмі залишається предметом вивчення. У зв'язку з цим можна сформулювати і дві інші завдання - необхідність розробки нового покоління КТ, швидко виводяться з організму, а також вивчення наслідків можливого вступу КТ в навколишнє середовище і забезпечення екологічної безпеки при їх широкому застосуванні. Рішення

    цих завдань, можливо, буде пов'язано з появою нових матеріалів і технологій для конструювання флуоресцентних наночастинок.

    Роботи лабораторії С.М. Дєєва з конструювання олігомерних надмолекулярних комплексів для діагностики і терапії раку, в тому числі з використанням КТ, підтримані грантом РФФД 09-04-01201-а, ФЦП «Дослідження і розробки за пріоритетними напрямами розвитку науково-технологічного комплексу Росії на 2007-2012 роки» , Програмами Президії РАН «Молекулярна і клітинна біологія» і «Основи фундаментальних досліджень нанотехнологій і наноматеріалів».

    СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

    1. Giepmans B.N., Adams S.R., Ellisman M.H., Tsien R.Y. // Science. 2006. V. 312. № 5771. P 217-224.

    2. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. // Trends Bio-technol. 2005. V. 23. № 12. P. 605-613.

    3. Shcherbo D., Murphy C.S., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Chepurnykh T.V., Shcheglov A.S., Verkhusha V.V., Pletnev V.Z., Hazelwood K.L., Roche P.M., Lukyanov S., Zaraisky A.G., Davidson M.W., Chudakov D.M. // Biochem. J. 2009. V. 418.

    № 3. P 567-754.

    4. Wang C., Gao X., Su X. // Anal. Bioanal. Chem. 2010. V. 397.

    № 4. P 1397-1415.

    5. Олейников В.А., Суханова А.В., Набієв І.Р // Російські нанотехнології. 2007. Т. 2. № 1-2. С. 160-173.

    6. Resh-Genger U., Grabolle1 M., Cavaliere-Jaricot S., Nitschke R., Nann T. // Nat. Methods. 2008. V. 5. № 9. P. 763-775.

    7. Alivisatos P // Nature Biotechnol. 2004. V. 22. № 1. P 47-52.

    8. Medintz I.L., Uyeda H.T., Goldman E.R., Mattoussi H. // Nat. Mater. 2005. V. 4. № 6. P. 435-446.

    9. Dabbousi B.O., Rodriguez-Viejo J., Mikulec F.V., Heine J.R., Mattoussi H., Ober R., Jensen K. F., Bawendi M.G. // J. Phys. Chem. B. 1997. V. 101. № 46. P. 9463-9475.

    10. Parak W.J., Gerion D., Pellegrino T., Zanchet D., Micheel C., Williams S.C., Alivisatos A.P., Boudreau R., Le Gros M.A., Larabell C.A. // Nanotech. 2003. V. 14. № 7. R15-R27. doi: 10.1088 / 0957-4484 / 14/7/201.

    11. Lidke D.S., Nagy P., Heintzmann R., Arndt-Jovin D.J., Post J.N., Grecco H.E., Jares-Erijman E.A., Jovin T.M. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. № 2. P. 198-203.

    12. Dahan M., Levi S., Luccardini C., Rostaing P., Riveau B., Triller A. // Science. 2003. V. 302. № 5644. P. 442-445.

    13. Tholouli E., Hoyland J.A., Di Vizio D., O'Connell F., Macder-mott S.A., Twomey D., Levenson R., Yin J.A., Golub T.R., Loda M., Byers R. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 348. № 2. P. 628-636.

    14. Chan W.C., Nie S. // Science. 1998. V. 281. № 5385. P. 20162018.

    15. Bruchez M.Jr., Moronne M., Gin P, Weiss S., Alivisatos A.P // Science. 1998. V. 281. № 5385. P. 2013-2016.

    16. Wu M.X., Liu H., Haley K.N., Treadway J.A., Larson J.P.,

    Ge N., Peale F., Bruchez M. // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. № 1. P. 41-46.

    17. Smith A.M., Dave S., Nie S., True L., Gao X. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2006. V. 6. № 2. P 231-244.

    18. Дєєв С.М., Лебеденко О.М. // A ^ a Naturae. 2009. Т. 1. № 1.

    C. 32-50.

    19. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. // Science. 1988. V. 242. № 4877. P. 423-426.

    20. Pack P., Pffickthun A. // Biochemistry. 1992. V. 31. № 6.

    P. 1579-1584.

    21. Wu A.M., Yazaki P.J. // Q. J. Nucl. Med. 2000. V. 44. № 3.

    P. 268-283.

    22. Edelweiss E., Balandin T.G., Ivanova J.L., Lutsenko G.V., Leonova O.G., Popenko V.I., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. // PLoS ONE. 2008. V. 3. № 6. P e2434.

    23. Balandin T.G., Edelweiss E., Andronova N.V., Treshalina

    E.M., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. // Invest. New Drugs. 2009. DOI 10.1007 / s10637-009-9329-2.

    24. Serebrovskaya E.O., Edelweiss E.F., Stremovskiy O.A., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Deyev S.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 23. P. 9221-9225.

    25. Yang L., Mao H., Wang YA, Cao Z., Peng X., Wang X., Duan H., Ni C., Yuan Q., Adams G., Smith MQ, Wood WC, Gao X. , Nie S. // Small. 2009. V. 5. № 2. P. 235-243.

    26. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Plflckthun A. // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. № 12. P 14861492.

    27. Deyev S.M., Lebedenko E.N. // Bioessays. 2008. V. 30. № 9.

    P 904-918.

    28. Nikitin M.P., Zdobnova T.A., Lukash S.V., Stremovskiy O.A., Deyev S.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 13.

    P. 5827-5832.

    29. Zhou M., Ghosh I. // Biopolymers. 2007. V. 88. № 3. P 325339.

    30. Winter J.O., Liu T.Y., Korgel B.A., Schmidt C.E. // Adv. Mater. 2001. V. 13. № 22. P. 1673-1677.

    31. Akerman M.E., Chan W.C., Laakkonen P., Bhatia S.N., Ruoslahti E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 20. P 12617-12621.

    32. Cai W., Shin D.W., Chen K., Gheysens O., Cao Q., Wang S.X., Gambhir S.S., Chen X. // Nano Lett. 2006. V. 6. № 4. P. 669-676.

    33. Zhang J., Jia X., Lv X.J., Deng Y.L., Xie H.Y. // Talanta. 2010. V. 81. № 1-2. P. 505-509.

    34. Chu T.C., Shieh F., Lavery L.A., Levy M., Kortum R.R., Korgel B.A., Ellington A.D. // Biosens. Bioelectron. 2006. V. 21. № 10. P. 1B59-1B66.

    35. Bagalkot V., Zhang L., Levy-Nissenbaum E., Jon S., Kantoff P.W., Langer R., Farokhzad O.C. // Nano Lett. 2007. V. 7. № 10. P. 3065-3070.

    36. Ko M.H., Kim S., Kang W.J., Lee J.H., Kang H., Moon S.H., Hwang D.W., Ko H.Y., Lee D.S. // Small. 2009. V. 5. № 10.

    P. 1207-1212.

    37. Smith A.M., Duan H., Mohs A.M., Nie S. // Adv. Drug. Deliv. Rev. 200B. V. 60. № 11. P. 1226-1240.

    3B. Chan W.C., Maxwell D.J., Gao X., Bailey R.E., Han M., Nie S. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13. № 1. P. 40-46.

    39. Pathak S., Davidson M.C., Silva G.A. // Nano Lett. 2007. V. 7. № 7. P. 1B39-1B45.

    40. Green N.M. // Methods Enzymol. 1990. V. 1B4. P. 51-67.

    41. Dahan M. // Histochem. Cell Biol. 2006. V. 125. № 5.

    P. 451-456.

    42. Лебеденко О.М., Баландін Т.Г., Едельвейс Е.Ф., Георгієв О., Моісеєва E.C., Петров Р.В., Дєєв СМ. // ДАН. 2007. Т. 414. № 3. C. 40B-411.

    43. Дєєв СМ., Лебеденко О.М. // Біоорган. хімія. 2009. Т. 35. №.6. C. 761-77B.

    44. Martsev S.P., Tsybovsky Y.I., Stremovskiy O.A., Odintsov S.G., Balandin T.G., Arosio P., Kravchuk Z.I., Deyev S.M. // Protein Eng. Des. Sel. 2004. V. 17. № 1. P. B5-93.

    45. Zdobnova T.A., Dorofeev S.G., Tananaev P.N.,

    Vasiliev R.B., Balandin T.G., Edelweiss E.F., Stremovskiy O.A., Balalaeva I.V., Turchin I.V., Lebedenko E.N., Zlomanov V.P., Deyev S.M. // J. Biomed. Opt. 2009. V. 14. № 2. P. 021 004.

    46. ​​Здобнова Т.А., Дорофєєв СГ., Тананаєв П.М., Зломанов В.П., &Ремовська О.А., Лебеденко О.М., Балалаєва І.В., Дєєв СМ., Петров Р.В. // ДАН. 2010. Т. 430. № 5. C. 705-70B.

    47. Bentzen E.L., Tomlinson I.D., Mason J., Gresch P., Warne-ment M.R., Wright D., Sanders-Bush E., Blakely R., Rosenthal

    S.J. // Bioconjug. Chem. 2005. V. 16. № 6. P. 14BB-1494.

    4B. Duan H., Nie S. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. № 11.

    P. 3333-333B.

    49. Бєляєва Т.М., Cалова А.В., Леонтьєва Е.А., Моженок Т.П., Корнілова E.C., Кроленка СА. // Цитология. 2009. Т. 51.

    № 10. C. B30-B36.

    50. Kelf T.A., Sreenivasan V.K., Sun J., Kim E.J., Goldys E.M., Zvyagin A.V. // Nanotechnology. 2010. V. 21. № 2B. e2B5105.

    51. Xing Y., Chaudry Q., Shen C., Kong K.Y., Zhau H.E., Chung L.W., Petros J.A., O'Regan R.M., Yezhelyev M.V., Simons J.W., Wang M.D., Nie S.M. // Nat. Protoc. 2007. V. 2. № 5. P. 11521165.

    52. Kairdolf B.A., Mancini M.C., Smith A.M., Nie S. // Anal. Chem. 200B. V. B0. № B. P. 3029-3034.

    53. Gao X., Cui Y., Levenson R.M., Chung L.W., Nie S. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. № B. P. 969-976.

    54. Tada H., Higuchi T.M., Wanatabe N., Ohuchi N. // Cancer Res. 2007. V. 67. № 3. P. 113B-1144.

    55. Zhang H., Sachdev D., Wang C., Hubel A., Gaillard-Kelly M., Yee D. // Breast Cancer Res Treat. 2009. V. 114. № 2.

    P. 277-2B5.

    56. Yong K.-T., Ding H., Roy I., Law W.-C., Bergey E.J., Maitra

    A., Prasad P.N. // ACS Nano. 2009. V. 3. № 3. P. 502-510.

    57. Li Z., Wang K., Tan W., Li J., Fu Z., Ma C., Li H., He X., Liu J. // Anal. Biochem. 2006. V. 354. № 2. P. 169-174.

    5B. Shi C., Zhu Y., Xie Z., Qian W., Hsieh C.L., Nie S., Su Y., Zhau H.E., Chung L.W. // Urology. 2009. V. 74. № 2.

    P. 446-451.

    59. Choi H.S., Liu W., Liu F., Nasr K., Misra P., Bawendi M.G., Frangioni J.V. // Nat. Nanotechnol. 2010. V. 5. № 1. P. 42-47.

    60. Sukhanova A., Devy J., Venteo L., Kaplan H., Artemyev M., Oleinikov V., Klinov D., Pluot M., Cohen J.H., Nabiev I. // Anal. Biochem. 2004. V. 324. № 1. P. 60-67.

    61. Yezhelyev MV, Al-Hajj A., Morris C., Marcus AI, Liu T., Lewis M., Cohen C., Zrazhevskiy P., Simons JW, Rogatko A., Nie S., Gao X., O 'Regan RM // Adv. Mater. 2007. V. 19. № 20.

    P. 3146-3151.

    62. Weng K.C., Noble C.O., Papahadjopoulos-Sternberg B., Chen F.F., Drummond D.C., Kirpotin D.B., Wang D.,

    Hom Y.K., Hann B., Park J.W. // Nano Lett. 2008. V. 8. № 9.

    P. 2851-2857.

    63. Takeda M., Tada H., Higuchi H., Kobayashi Y., Kobayashi M., Sakurai Y., Ishida T., Ohuchi N. // Breast Cancer. 2008. V. 15.

    № 2. P. 145-152.

    64. Yu X., Chen L.D., Li K.Y., Li Y., Xiao S., Luo X., Liu J., Zhou L., Deng Y.L., Pang D.W., Wang Q.Q. // J. Biomed. Opt. 2007.

    V. 12. № 1. P. 014 008.

    65. Chen L.D., Liu J., Yu X.F., He M., Pei X.F., Tang Z.Y., Wang Q.Q., Pang D.W., Li Y. // Biomaterials. 2008. V. 29. № 31.

    P. 4170-4176.

    66. Diagaradjane P., Orenstein-Cardona J.M., Colon-Casasnovas N.E., Deorukhkar A., ​​Shentu S., Kuno N., Schwartz D.L., Gelovani J.G., Krishnan S. // Clin. Cancer Res. 2008. V. 14. № 3. P. 731-741.

    67. Jaiswal J.K., Mattoussi H., Mauro J.M., Simon S.M. // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. № 1. P. 47-51.

    68. Kawashima N., Nakayama K., Itoh K., Itoh T., Ishikawa M., Biju V. // Chemistry. 2010. V. 16. № 4. P. 1186-1192.

    69. Bharali D.J., Lucey D.W., Jayakumar H., Pudavar H.E., Prasad P.N. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. № 32. P. 1136411371.

    70. Goldman E.R., Clapp A.R., Anderson G.P., Uyeda H.T., Mauro J.M., Medintz I.L., Mattoussi H. // Anal. Chem. 2004. V. 76. № 3. P. 684-688.

    71. Makrides S.C., Gasbarro C., Bello J.M. // Biotechniques. 2005. V. 39. № 4. P. 501-506.

    72. Rousserie G., Sukhanova A., Even-Desrumeaux K., Fleury

    F., Chames P., Baty D., Oleinikov V., Pluot M., Cohen J.H., Nabiev I. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2010. V. 74. № 1. P. 1-15.

    73. Estrada C.R., Salanga M., Bielenberg D.R., Harrell W.B., Zurakowski D., Zhu X., Palmer M.R., Freeman M.R., Adam R.M. // Cancer Res. 2006. V. 66. № 6. P. 3078-3086.

    74. Chen C., Peng J., Xia H., Yang G., Wu Q., Chen L., Zeng L., Zhang Z., Pang D., Li Y. // Biomaterials. 2009. V. 30. № 15.

    P. 2912-2918.

    75. Fountaine T.J., Wincovitch S.M., Geho D.H., Gargield S.H., Pittaluga S. // Mod. Pathol. 2006. V. 19. № 9. P. 1181-1191.

    76. Bouzigues C., Levi S., Triller A., ​​Dahan M. // Methods Mol. Biol. 2007. V. 374. P. 81-91.

    77. Parak W.J., Boudreau R., Gros M.L., Gerion D., Zanchet D., Micheel C.M., Williams S.C., Alivisatos A.P., Larabell C.A. // Adv. Mater. 2002. V. 14. № 12. P. 882-885.

    78. Frangioni J.V. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. V. 7. № 5.

    P. 626-634.

    79. Jain R.K. // J. Control. Release. 2001. V. 74. № 1-2. P. 7-25.

    80. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. // J. Control. Release. 2000. V. 65. № 1-2. P. 271-284.

    81. Mahmoud W., Sukhanova A., Oleinikov V., Rakovich Y.P., Donegan J.F., Pluot M., Cohen J.H., Volkov Y., Nabiev I. // Pro-teomics. 2010. V. 10. № 4. P. 700-716.

    82. Kobayashi H., Hama Y., Koyama Y., Barrett T., Regino C.A., Urano Y., Choyke P.L. // Nano Lett. 2007. V. 7. № 6. P. 17111716.

    83. Luciani A., Itti E., Rahmouni A., Meignan M., Clement O. // Eur. J. Radiol. 2006. V. 58. № 3. P. 338-344.

    B4. Ravizzini G., Turkbey B., Barrett T., Kobayashi H., Choyke P.L. // Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2009. V. 1. № 6. P. 610-623.

    B5. Kim S., Lim Y.T., Soltesz E.G., De Grand A.M., Lee J., Na-kayama A., Parker J.A., Mihaljevic T., Laurence R.G., Dor

    D.M., Cohn L.H., Bawendi M.G., Frangioni J.V. // Nat. Biotech-nol. 2004. V. 22. № 1. P. 93-97.

    B6. Larson D.R., Zipfel W.R., Williams R.M., Clark S.W., Bruchez M.P., Wise F.W., Webb W.W. // Science. 2003. V. 300. № 5624.

    P. 1434-1436.

    B7. Stroh M., Zimmer J.P., Duda D.G., Levchenko T.S., Cohen K.S., Brown E.B., Scadden D.T., Torchilin V.P., Bawendi M.G., Fukumura D., Jain R.K. // Nat. Med. 2005. V. 11. № 6.

    P. 67B-6B2.

    BB. Lovric J., Cho S.J., Winnik F.M., Maysinger D. // Chem. Biol.

    2005. V. 12. № 11. P. 1227-1234.

    B9. Kirchner C., Liedl T., Kudera S., Pellegrino T., Javier A.M., Gaub H.E., Stolzle S., Fertig N., Parak W.J. // Nano Lett. 2005. V. 5. № 2. P. 331-33B.

    90. Pelley J.L., Daar A.S., Saner M.A. // Toxicol. Sci. 2009. V. 112. № 2. P. 276-296.

    91. Choi H.S., Liu W., Misra P., Tanaka E., Zimmer J.P., Itty Ipe

    B., Bawendi M.G., Frangioni J.V. // Nat. Biotechnol. 2007. V. 25. № 10. P. 1165-1170.

    92. Campbell R.B., Fukumura D., Brown E.B., Mazzola L.M., Izumi Y., Jain R.K., Torchilin V.P., Munn L.L. // Cancer Res. 2002. V. 62. № 23. P. 6B31-6B36.

    93. Fischer H., Liu L., Pang K.S., Chan W. // Adv. Funct. Mater.

    2006. № 10. V. 16. P. 1299-1305.

    94. Schipper ML, Iyer G., Koh AL, Cheng Z., Ebenstein Y., Aharoni A., Keren S., Bentolila LA, Li J., Rao J., Chen X., Banin U., Wu AM, Sinclair R., Weiss S., Gambhir SS // Small. 2009. V. 5. № 1. P. 126-134.

    95. Hauck T.S., Anderson R.E., Fischer H.C., Newbigging S., Chan W.C. // Small. 2010. № 1. V. 6. P. 13B-144.

    96. Ballou B., Lagerholm B.C., Ernst L.A., Bruchez M.P., Waggoner A.S. // Bioconjug. Chem. 2004. V. 15. № 1. P. 79-B6.

    97. Yang R.H., Chang L.W., Wu J.P. // Environ. Health. Perspect.

    2007. V. 115. № 9. P. 1339-1343.

    9B. Hardman R. // Environ. Health Perspect. 2006. V. 114. № 2.

    P. 165-172.

    99. Aldana J., Wang Y.A., Peng X. // J. Am. Chem. Soc. 2001.

    V. 123. № 36. P. BB44-BB50.

    100. Haram S.K., Quinn B.M., Bard A.J. // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. № 36. P. BB60-BB61.

    101. Zhang T., Stilwell J.L., Gerion D., Ding L., Elboudwarej O., Cooke P.A., Gray J.W., Alivisatos A.P., Chen F.F. // Nano Lett.

    2006. V. 6. № 4. P. B00-B0B.

    102. Rzigalinski B.A., Strobl J.S. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. V. 23B. № 3. P. 2B0-2BB.

    103. Dobrovolskaia M.A., McNeil S.E. // Nat. Nanotechnol. 2007. V. 2. № B. P. 469-47B.

    104. Hoshino A., Hanada S., Manabe N., Nakayama T., Yamamoto K. // IEEE Trans. Nanobioscience. 2009. V. B. № 1. P. 51-57.

    105. Mancini M.C., Kairdolf B.A., Smith A.M., Nie S. // J. Am. Chem. Soc. 200B. V. 130. № 33. P. 10B36-10B37.

    106. Kim J., Piao Y., Hyeon T. // Chem. Soc. Rev. 2009. V. 3B. № 2. P. 372-390.

    107. Biju V., Mundayoor S., Omkumar R.V., Anas A., Ishikawa M. // Biotechnol. Adv. 2010. V. 2B. № 2. P. 199-213.

    10B. Zrazhevskiy P., Gao X. // Nano Today. 2009. V. 4. № 5.

    P. 414-42B.

    109. Generalova A.N., Sizova S.V., Zdobnova T.A., Zarifullina M.M., Artemyev M.V., Baranov A.V., Oleinikov V.A.,

    Zubov V.P., Deyev S.M. // Nanomedicine. 2011. V.6. №2.

    P. 195-209.


    Ключові слова: КВАНТОВІ ТОЧКИ /флуоресцентні ВІЗУАЛІЗАЦІЯ /багатобарвний мічених /НАНОЧАСТИНКИ

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити