У статті наведені дані по культивуванню і характеристиці мезенхімальних стромальних клітин (МСК), виділених з кісткового мозку пацієнтів з диспластичних коксартрозом. У фракції адгезивних МСК з обох зразків кісткового мозку виявлено кілька морфологічних фенотипів: веретеноподібні подовжені клітини, великі сплощені клітини і тонкі зірчасті клітини. Імунофенотипових аналіз показав, що за характером і рівнем експресії поверхневих антигенів (CD90, CD73, CD105, CD45 і CD34) клітини є популяції МСК. Використання для культивування МСК людини нової ростовой середовища, яка не містить компонентів тваринного походження, дозволяє МСК досягати конфлюентності на 16-18 день інкубації, без уповільнення проліферативної активності клітин і без втрати здатності до диференціювання в хондроі остеогенні типи тканин. Мультіпотентность МСК підтверджена остеогенной і хондрогенной дифференцировкой клітин при їх тривалому культивуванні в відповідних індукційних середовищах in vitro. диференціювання МСК в остеобласти підтверджували іммуноцітохіміческіе фарбуванням на лужну фосфатазу та алізариновим червоним. специфічну диференціювання МСК по хондрогенному типу виявляли іммуноцітохіміческіе фарбуванням хрящових депозитів альциановим синім. Вперше визначено такі характеристики МСК людини, як мітотичний індекс, траєкторії і середня швидкість руху клітин на культуральном пластиці. мітотичний індекс активно проліферуючих МСК склав від 2,7 до 3,4% від загальної кількості клітин, рухова активність (швидкість міграції) 38-42 мкм / год. Таким чином, аспірат кісткового мозку від пацієнтів з ортопедичною патологією є джерелом МСК, які задовольняють критеріям, визначеним Міжнародним товариством клітинної терапії, і можуть бути використані в регенеративної терапії кісткової і хрящової тканин.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Астахова Наталя Михайлівна, Корель Анастасія Вікторівна, Орищенко Костянтин Євгенович, Єфремов Ярослав Рейнгольдовіч, Кудрі Гліб Олександрович


CULTIVATION AND CHARACTERISTICS OF MESENCHyMAL STEM CELLS FROM THE BONE MARROW OF THE PATIENTS WITH ORTHOPEDIC PATHOLOGY

The article presents data on the cultivation and characteristics of mesenchymal stem cells (MSC) isolated from the bone marrow of patients with dysplastic coxarthrosis. Several morphological phenotypes were found in the fraction of adhesive MSC: spindle-shaped elongated cells, large flattened cells, and thin stellate cells in both samples of bone marrow. Immunophenotypic analysis showed that cells express surface antigens (CD90, CD73, CD105, CD45 and CD34), which are characteristic for typical stem cells. It was shown that the use of a new growth medium containing no components of animal origin for the cultivation of human MSC allowed to achieve confluence of the cell culture on the 16th-8th day of incubation without delaying the proliferative activity of the cells and without loss of ability to differentiate into chondroand osteogenic types of tissues. Multipotency of MSC was confirmed by osteogenic and chondrogenic differentiation of cells, during prolonged cultivation of MSCs in induction media in vitro. The differentiation of MSC into osteoblasts was confirmed by immunocytochemical staining for alkaline phosphatase and alizarin red S. Specific differentiation of MSC in chondrogenic type was revealed by staining of cartilage deposits with alcian blue. For the first time, such characteristics of human MSC as: mitotic index, trajectory of cells migration and average speed of migration on culture plastics were determined. The mitotic index of actively proliferating MSC was from 2.7 to 3.4% of the total cell number. The moving activity (speed of cell migration) was 38-42? M / h. Thus, bone marrow aspirate from patients with orthopedic pathology is the source of stem cells that meet all the criteria for MSC as determined by the International Society of Cellular Therapy and can be used in regenerative therapy of bone and cartilage.


Область наук:

  • Біотехнології в медицині

  • Рік видавництва: 2018


    Журнал: Сибірський науковий медичний журнал


    Наукова стаття на тему 'КУЛЬТИВУВАННЯ І ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН ІЗ КІСТКОВОГО МОЗКУ ПАЦІЄНТІВ З ОРТОПЕДИЧНОЇ ПАТОЛОГІЄЮ'

    Текст наукової роботи на тему «КУЛЬТИВУВАННЯ І ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН ІЗ КІСТКОВОГО МОЗКУ ПАЦІЄНТІВ З ОРТОПЕДИЧНОЇ ПАТОЛОГІЄЮ»

    ?УДК: 616-71 / -78

    DOI: 10.15372 / SSMJ20180106

    КУЛЬТИВУВАННЯ І ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН ІЗ КІСТКОВОГО МОЗКУ ПАЦІЄНТІВ З ОРТОПЕДИЧНОЇ ПАТОЛОГІЄЮ

    Наталя Михайлівна АСТАХОВА12, Анастасія Вікторівна КОРЕЛЬ1, Костянтин Євгенович Орищенко 3, Ярослав Рейнгольдовіч ЕФРЕМОВ34, Гліб Олександрович КУДРОВ1, Ірина Анатоліївна КІРІЛОВА1

    1 Новосибірський НДІ травматології та ортопедії ім. Я.Л. Цив'яна МОЗ Росії 630091, Новосибірськ, вул. Фрунзе, 17

    2АО «Інноваційний медико-технологічний центр (Медичний Технопарк)» 630091, м Новосибірськ, вул. Фрунзе, 19-а

    3 Фіц «Інститут цитології і генетики» СО РАН 630090, Новосибірськ, просп. Академіка Лаврентьєва, 10

    4 Новосибірський державний університет 630090, Новосибірськ, вул. Пирогова, 2

    У статті наведені дані по культивуванню і характеристиці мезенхімальних стромальних клітин (МСК), виділених з кісткового мозку пацієнтів з диспластичних коксартрозом. У фракції адгезивних МСК з обох зразків кісткового мозку виявлено кілька морфологічних фенотипів: веретеноподібні подовжені клітини, великі сплощені клітини і тонкі зірчасті клітини. Імунофенотипових аналіз показав, що за характером і рівнем експресії поверхневих антигенів (CD90, CD73, CD105, CD45 і CD34) клітини є популяції МСК. Використання для культивування МСК людини нової ростовой середовища, яка не містить компонентів тваринного походження, дозволяє МСК досягати конфлюентності на 16-18 день інкубації, без уповільнення проліферативної активності клітин і без втрати здатності до диффе-ренціровке в хондро- і остеогенні типи тканин. Мультіпотентность МСК підтверджена остеогенной і хон-дрогенной дифференцировкой клітин при їх тривалому культивуванні в відповідних індукційних середовищах in vitro. Диференціювання МСК в остеобласти підтверджували іммуноцітохіміческіе фарбуванням на лужну фосфатазу та алізариновим червоним. Специфічну диференціювання МСК по хондрогенно-го типу виявляли іммуноцітохіміческіе фарбуванням хрящових депозитів альциановим синім. Вперше визначено такі характеристики МСК людини, як мітотичний індекс, траєкторії і середня швидкість руху клітин на культуральном пластиці. Мітотичний індекс активно проліферуючих МСК склав від 2,7 до 3,4% від загальної кількості клітин, рухова активність (швидкість міграції) - 38-42 мкм / год. Таким чином, аспірат кісткового мозку від пацієнтів з ортопедичною патологією є джерелом МСК, які задовольняють критеріям, визначеним Міжнародним товариством клітинної терапії, і можуть бути використані в регенеративної терапії кісткової і хрящової тканин.

    Ключові слова: мезенхімальні стромальні клітини, кістковий мозок, диспластичний коксоартроз, мі-тотіческій індекс, швидкість міграції, диференціювання, регенерація кістки і хряща.

    Астахова Н.М. - к.б.н., старший науковий співробітник лабораторно-експериментального відділу, спеціаліст з клітинним технологіям, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Корель А.В. - к.б.н., старший науковий співробітник лабораторно-експериментального відділу, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Орищенко К.Є. - к.б.н., зав. сектором клітинних технологій, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. Єфремов Я.Р. - провідний інженер ЦКПмікроскопіческого аналізу біологічних об'єктів, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Кудрі Г.А. - молодший науковий співробітник лабораторно-експериментального відділу, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Кирилова І.А. - д.м.н., провідний науковий співробітник лабораторно-експериментального відділу, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Однією з головних проблем травматології та ортопедії залишається заміщення дефектів кісткової тканини опорно-рухового апарату. В даний час широкого поширення набули методи клітинної терапії, засновані на застосуванні остеогенних клітин, диференційованих з МСК, отриманих з різних тканинних джерел: кісткового мозку, жирової тканини, пульпи зуба, периферичної крові і т.д. [7, 11, 13-15]. Однією з вимог до пластичного матеріалу є тканеспеціфічность, відсутність токсичності, високий регенераторний потенціал і формування органоспеці-фіческой кісткової тканини в зоні трансплантації. Для забезпечення запитів практичної хірургії необхідні тканеінженерной конструкції, придатні для заміщення кісткових дефектів, що характеризуються наступними властивостями: збереження фізичних і анатомічних особливостей кістки, висока міцність, швидка фіксація в зоні імплантації та заміщення тканиною реципієнта, відсутність реакції відторгнення їм-плантата.

    Головна стратегія тканинного інжинірингу полягає в наступному: 1) виділення MCK і їх проліферація in vitro, 2) заселення на тривимірний скаффолд і 3) імплантація скаффолда в осередок пошкодження [10, 17]. Впровадження даної стратегії в медичну практику вимагає проведення додаткової хірургічної процедури і тимчасових витрат, які необхідні для створення кісткового трансплантата in vitro. Кістковий мозок є резервуаром МСК для ряду сполучних тканин, які можуть диференціюватися в остеогенні, хондрогенние і жирові клітини [5, 6]. В умовах хірургічного стаціонару травматолого-ортопедичного профілю використання такого ресурсу, як резецированной при первинному ендопротезуванні полусуставом, представляється доцільним. Оскільки обсяг первинних операцій постійно зростає, то обмеження в джерелі кісткового мозку, при згоді пацієнта, немає. А збільшення ревізійних операцій, пов'язаних з дефіцитом кісткової тканини, формує запит клініцистів на тканеінженерной конструкції, що володіють високими властивостями міцності.

    Як перший крок у створенні подібних конструкцій, нами виконані паркан кісткового мозку у двох пацієнтів, виділення МСК, культивування та опис їх характеристик. У нашому експерименті МСК з аспиратов кісткового мозку служили джерелом остеогенних і хондрогенних клітин людини, які в подальшому передбачається використовувати для заселення тривимірних імплантатів ( «скаффолдов») з перспективою ис-

    користування для відновлення кісткової і хрящової тканин. Диференціація цих клітин проводилася in vitro шляхом зміни умов культивування в процесі росту. Її можна також ініціювати, забезпечуючи нове фізіологічне микроокружение в галузі трансплантації in vivo [8]. Крім того, в ряді робіт було показано, що жорсткість субстрату і топографія поверхні «скаффолда», а також біомеханічні впливу на тривимірні каркаси значно впливають на розвиток тканин, морфогенез, патогенез і загоєння, особливо в ортопедичних тканинах. Такі біологічні процеси критично пов'язані з диференціюванням МСК людини. Поточні дослідження припускають використання різних факторів для контролю процесу диференціювання МСК і прискорення процесу створення тривимірних тканеінженер-них конструкцій [12, 18].

    Проліферація МСК, виділених з клітинного аспирата кісткового мозку, залежить від обсягу, техніки виділення і культивування клітин. У зв'язку з новими міжнародними вимогами до культивування МСК пацієнтів in vitro без реагентів тваринного походження була використана вдосконалена безсиворо-точна живильне середовище. Досліджували наступні характеристики виділених МСК: адгезія, експресія специфічних CD-маркерів, збереження мультипотентні, дифференциров-ка, проліферативний потенціал (мітотичний індекс), рухова активність (швидкість міграції). Вивчення динамічних характеристик МСК і підбір оптимальних умов культивування дозволять розробити стандартні підходи для нових технологій отримання індивідуальних тканеінженерной конструкцій в регенеративної медицини.

    МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

    МСК людини були виділені з аспиратов кісткового мозку резектованих головок стегнових кісток пацієнтів з диспластичних Коксар-трозом при операції первинного ендопротезіро-вання тазостегнових суглобів в Новосибірському НДІ травматології та ортопедії ім. Я.Л. Цівія-на МОЗ Росії. В експериментах були використані МСК від двох донорів (жінки, вік 37 років і 41 рік), із загальним числом пасажів від 0 до 4. МСК пацієнток задовольняли критеріям, визначеним Комітетом міжнародного товариства з клітинної терапії. Мінімальний набір стандартних критеріїв для визначення МСК людини наступний: по-перше, вони повинні бути пластик-адгезивними при куль-

    тівірованіі в стандартних умовах; по-друге, повинні експресувати CD105, CD73 і CD90 і бути негативними по поверхневих антигенів CD45, CD34, CD14 або CD11b, CD79a або CD19, HLA-DR; по-третє, повинні диференціюватися в остеобласти, адипоцити або хондробласти при культивуванні in vitro в індукційних середовищах [9, 12].

    Це дослідження відповідає етичним стандартам, розробленим відповідно до Гельсінкської декларацією Всесвітньої медичної асоціації «Етичні принципи проведення наукових медичних досліджень за участю людини» з поправками 2000 року і «Правилами клінічної практики в Російській Федерації», затверджених Наказом МОЗ РФ від 19.06.2003 № 266. Робота отримала схвалення локального етичного комітету Новосибірського НДІ ім. Я.Л. Цив'яна МОЗ Росії (протокол № 011/16 від 04.10.2016). Всі особи дали інформовану згоду на участь в дослідженні.

    Виділення і культивування. Аспірати кісткового мозку, отримані при хірургічної операції в стерильних умовах, промивали модифікованої по Дульбекко середовищем Голка (Sigma, США) з додаванням 100 Ед / мл пеніциліну і стрептоміцину, 2,5 мкг / мл фунгізо-ну (Life Technologies, США), проціджували через нейлонове сито з діаметром пір 100 мкм. Суспензію клітин кісткового мозку розводили в співвідношенні 1: 2 0,9% -м NaCl, нашаровуються на градієнт щільності PANcoll (PAN biotech, Німеччина) (d = 1,077 г / мл) і центрифугували при 1300 g протягом 15 хв [1, 2 ]. Ядерні клітини переносили в окрему пробірку, відмивали від PANcoll центрифугуванням при 1500 g протягом 15 хв в бессивороточной середовищі DMEM з додаванням 100 Ед / мл пеніциліну, 100 мкг / мл стрептоміцину і 2,5 мкг / мл фунгізона. Над-осадочную рідина видаляли, осад клітин ре-суспендованих в ростовий середовищі і переносили в культуральні флакони з поверхнею росту клітин 25 см2 або в чашки Петрі з поверхнею росту клітин 10 см2 (Techno Plastic Products AG, Швейцарія). Культивування клітин з нульового пасажу проводили в спеціальній бессивороточной ростовой середовищі PowerStem MSC1 (PAN biotech), що містить 100 Ед / мл пеніциліну, 100 мкг / мл стрептоміцину і 2,5 мг / мл фунгізона, при 37 ° С в СО2-інкубаторі (5% концентрації СО2). Через 48 годин після посіву первинної культури клітини, що не прикріпилися до пластику, видаляли шляхом зміни середовища. Фракцію адгезивних МСК культивували до освіти 8090% конфлюентного моношару, середу замінювали

    кожні 3-4 дні. Клітини 0-4 пасажів були використані для наступних експериментів.

    Іммуноцітометріческіе дослідження. Конфлюентний моношар культури клітин знімали з культурального пластика шляхом додавання 0,25% розчину трипсину (Sigma) в 1мМ розчині ЕДТА протягом 1-3 хв при 37 ° С. Потім промивали центрифугуванням в бессивороточной середовищі PowerStem hMSC (PAN biotech) при 1300 g протягом 5 хв. Далі суспензію МСК пропускали через клітинний фільтр з діаметром пор 40 мкм для видалення великих кон'югатів, після чого інкубували з флуорохром-кон'-югірованнимі антитілами на льоду протягом 20 хв. Отримані таким чином зразки клітин аналізували на проточному цітофлуо-ріметре FACSAria (BD Biosciences, США). Їм-мунофенотіпіческій аналіз (експресію найбільш загальних позитивних і відсутність експресії негативних поверхневих антигенних маркерів) МСК проводили на 0-2 пасажі із застосуванням антитіл до CD90 (1: 80), CD73 (1: 750), CD105 (1: 500) CD45 ( 1: 150) і CD34 (1: 20). Використовували моноклональні антитіла до CD90-FITC (Abcam, Великобританія), CD73-PE (BD Pharmingen, США), CD105-PE (BD Pharmingen), CD45-FITC (BioLegend, США), CD34-Alexa Fluor (BD Pharmingen). Дані їм-мунофенотіпіческого аналізу обробляли з використанням програмного забезпечення 2.5.1 для проточної цитометрії.

    Cell-IQ аналіз МСК. Для аналізу проліфе-ративного потенціалу (мітотичний індекс) і рухової активності (швидкість міграції) виділені МСК культивували протягом чотирьох днів з використанням системи тривалого спостереження за живими клітинами - Cell-IQ (CM Technologies, Німеччина). Параметри культивування: температура 37 ° С; 5% -й зволожений О2 прокачувався безпосередньо через культуральний планшет; періодичність подачі газу - 15 хв включений, 15 хв вимкнений; первинна подача газу - 30 хв. Параметри зйомки: об'єктив - Nikon CFI Plan Fluorescence DL 10x (Nikon, Японія); частота зйомки - 12 зображень в годину; кількість полів зйомки - 12 на одну лунку шестілуночного планшета. Отримані зображення аналізували за допомогою спеціалізованого програмного забезпечення Cell-IQ Analyser. Для оцінки митотического індексу вважали загальна кількість клітин і кількість клітин, що знаходяться в стані поділу. Для цього створювали бібліотеку зображень для детекції та диференціювання розпластаних клітин, що діляться клітин, клітинних відростків, структур цитоплазми в клітинах великої

    діаметра і клітинного дебриса. На основі даної бібліотеки і підібраних параметрів (мінімальної відстані між сусідніми клітинами, максимального діаметра клітини, симетрії клітини та ін.) Були проаналізовані всі отримані зображення. Мітотичний індекс розраховували як відношення числа клітин, які діляться до їх загальної кількості. Рухову активність оцінювали для 20 випадково вибраних клітин по вимірюванню протяжності траєкторії, пройденої кліткою за час зйомки, або до моменту, поки вона перебувала в полі зйомки. Маркування клітин здійснювали в ручному режимі по центру ядер. Пройдену траєкторію розраховували, вимірюючи відстань між мітками.

    Мультилинейной диференціювання МСК in vitro. Для оцінки мультипотентні MCK индуцировали диференціювання клітин по Остеогенні і хондрогенному типу шляхом культивування їх в індукційних середовищах в умовах культури. Для іммуноцітометріческого аналізу МСК в концентрації 0,3 х 104 / см2 рассе-вали в культуральні флакони площею 25 см2. Для гістохімічного аналізу клітин і аналізу на апараті Cell-IQ МСК розсівали в 6-лу-нічні планшети. Для здійснення остео-генної диференціювання МСК інкубували в середовищі StemPro Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco), для ініціації хондрогенной диференціювання використовували StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco). Повні культуральні середовища включали всі необхідні реагенти для спрямованої диференціювання МСК, але не містили сироватки тваринного походження. Для виявлення експресії маркерів остеобласт-ного профілю на 14-у добу інкубації клітин в індукційної остеогенной середовищі визначали активність лужної фосфатази (Amresco, США) згідно з протоколом фірми-виробника. Для візуалізації мінеральних відкладень позаклітинного матриксу клітини після 21 діб інкубування в індукційної середовищі двічі промивали в PBS (без Са ++ і Mg ++), нашаровується 10% -й формалін і фіксували протягом 15 хв при кімнатній температурі. Потім видаляли розчин формаліну, двічі відмивали клітини де-іонізованої водою і фарбували 2% -м розчином алізариновий червоного (pH 4,1) протягом 20 хв, після чого відмивали шість разів деіоні-зовано водою, щоб видалити зайву фарбу. Хондрогенную диференціювання підтверджували гістохімічним фарбуванням хрящових депозитів альциановим синім. Клітини обох типів тканини аналізували і фотографували за допомогою мікроскопа Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Німеччина) та програмного забезпечення ZEN 2012 (blue edition).

    РЕЗУЛЬТАТИ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

    Адгезивная фракція МСК, ізольованих з кісткового мозку, відносно легко нарощується in vitro в спеціальних ростових середовищах без диференціювання. Раніше поруч авторів [4, 16] показано, що умови in vitro нарощування МСК можуть призводити до поступової втрати характеристик ранніх попередників і до уповільнення швидкості проліферації вже до другого пасажу. Тип живильного середовища і використання добавок істотно впливають на генотип і фенотип МСК, що слід враховувати при виборі оптимальних умов культивування клітин для клінічного використання [4]. У нашому експерименті МСК досягали конфлюентності на 16-18 день інкубації (0 пасаж), без уповільнення проліферативної активності клітин і без втрати здатності до диференціювання в хондро- і остеогенні типи тканин. Це пояснюється застосуванням нової високоякісної, яка не містить сироватки плодів корів і компонентів тваринного походження, ростовой середовища PowerStem MSC1, спеціально розробленої для проліферації і тривалого культивування МСК людини без диференціювання клітин. Ростові середу PowerStem MSC1 містить солі, амінокислоти, гормони, ростові фактори і збагачена білками та ліпідами з компонентів крові людини по оптимізованої рецептурою, при строгому дотриманні стандартів виробництва високої якості.

    Відомо, що МСК представляють собою гетерогенну популяцію клітин [3, 4]. На рівні клітинних колоній ми визначили декілька морфологічних фенотипів: веретеноподібні подовжені клітини, великі сплощені клітини і тонкі зірчасті клітини (рис. 1, а-в). Обидва зразки МСК пацієнтів мали подібні морфологічні типи клітин, значущих відмінностей між ними не виявлено.

    В результаті імунофенотипових аналізу було показано, що профілі експресії поверхневих антигенів культивованих МСК відповідали прийнятим стандартам [9]. Зокрема, більше 90% клітин експресували CD90, CD73, CD105 - позитивні маркери, типові для МСК (рис. 2). У той же час більше 95% клітин були негативні по CD45 (загальний лейкоцитарний антиген) і по CD34 (маркер ранніх кровотворних попередників), що свідчить про відсутність їх домішок в популяції МСК (див. Рис. 2). Відмінності по експресії CD-маркерів між зразками клітин від різних донорів були статистично недостовірними. Таким чином, імунофенотипових

    Мал. 1. Фенотип і гістохімічна характеристика мультипотентні МСК людини. У колоніях МСК спостерігалися три клітинних фенотипу: а - веретеноподібні клітини (ув. Х10), б - великі сплощені клітини (ув. Х63), в - зірчасті клітини (ув. Х 20), г - забарвлення на алізариновий червоний S, щільність мінералізації з'єднань кальцію пропорційна інтенсивності червоного забарвлення при остеогенной диференціювання МСК (ув. х63), д - забарвлення на альціановий синій, ядра клітин пофарбовані ядерним червоним швидким, хрящові депозити позаклітинного матриксу пофарбовані від блідо-блакитного до темно-синього в залежності від щільності при хондрогенной диференціювання МСК (ув. х10)

    Specimen_001-34

    Specimen_001-45

    Specimen_001-73

    FITC-A

    10J

    FITC-A

    SpecimenOO 1-90

    Specimen_001-105

    -39 0101 102

    10J 10 FITC-A

    Мал. 2. Аналіз поверхневого антигенного фенотипу МСК з кісткового мозку: а - CD34, б - CD45, в - CD73, г - CD90, д - CD105. Горизонтальні лінії показують аналізовані ділянки в порівнянні з профілем нефарбованих клітин. По осі абсцис - інтенсивність флуоресценції (логарифмічна шкала), по осі ординат - кількість подій

    Мал. 3. Аналіз зображень за допомогою програмного забезпечення Cell-IQ Analyser. а - червоними крапками позначені детектувати розпластані клітини, світло-зеленими - діляться клітини, темно-зеленими - цитоплазма в клітинах великого діаметру, рожевими - клітинні відростки, бордовими - дебрис, жовтими - фон зображення; б - приклад визначення траєкторій руху п'яти випадково обраних клітин. Траєкторії руху різних клітин пофарбовані в різні кольори

    аналіз показав, що за характером і рівнем експресії досліджених поверхневих антигенів ^ 90, CD73, CD105, CD45 і CD34) культури МСК людини на ранніх пасажах (0-4) представляють собою практично гомогенну популяцію МСК.

    Аналіз клітинної проліферації дозволив визначити загальне число клітин, кількість клітин, які діляться і їх співвідношення. За допомогою створеної бібліотеки зображень ідентифікували розпластані, діляться клітини і клітинний дебрис (рис. 3, а). після автоматичної

    Про 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

    Мал. 4. Пролиферативная активність МСК. Червона і зелена лінії відповідають кількості розпластаних і клітин, які діляться відповідно, чорна лінія - сумарна кількість клітин; по осі абсцис - час (ч), по осі ординат - кількість клітин

    обробки всіх зображень за допомогою пакета програм Cell-IQ Analyser підраховано середнє значення мітотичного індексу протягом чотирьох днів безперервного аналізу проліфе-рірующіх МСК. Для клітин, отриманих від першого і другого пацієнта, середнє значення мітотичного індексу становить 2,7 і 3,4% відповідно, що вказує на проліферацію МСК і підтверджується кривої збільшення кількості клітин (рис. 4). Рухову активність оцінювали для 20 випадково вибраних клітин, для чого в програмному забезпеченні Cell-IQ Analyser відстежували траєкторію руху для кожної з них. Для аналізу вибиралися траєкторії тих клітин, які за період трекінгу не відчували контактних взаємодій з іншими клітинами (див. Рис. 3, б) і, таким чином, були наслідком їх внутрішньої активності, що не залежить від розташування інших клітин. Обчислення характеристик рухливості МСК виробляли з використанням програми в пакеті Mathematica 10, розробленої для обробки параметрів рухової активності остеобластів і хондробластов. Значення рухливості (швидкість міграції клітин) МСК першого пацієнта становить 42 мкм / год (59 пікселів / год), другого -38 мкм / год (56 пікселів / год), що дозволяє говорити про активний рух клітин (див. Рис. 3, б ).

    Дослідження остеогенного потенціалу МСК людини проводили культивуванням клітин в стандартній остеогенной середовищі [1]. За допомогою фазово-контрастної мікроскопії встановлено, що кількість веретеноподібних клітин знижується, а число полігональних збільшується візуально вже на третю добу інкубування

    в дифференцировочной середовищі. Зі збільшенням терміну культивування МСК в остеогенной середовищі також зростала активність лужної фос-фатази, одного з основних маркерів остеогенной диференціювання клітин. Це пов'язано з участю ферменту в формуванні кристалів гідроксиапатиту в позаклітинному матриксі [17]. Інтенсивність реакції на лужну фосфо-тазу оцінювали на 16-18-е добу експерименту, за інтенсивністю фарбування вона досягала максимальних значень в «кісткових бляшках», нерівномірно утворюються в щільному монослое при тривалому культивуванні остеобластів. Завершення остеогенной дифференциров-ки дозріванням остеобластів і формуванням кальцієвих депозитів позаклітинного матриксу підтверджується інтенсивним фарбуванням алізариновим червоним. У клітинних скупченнях, що нагадують «кісткові бляшки», щільність мінералізації сполук кальцію пропорційна інтенсивності червоного забарвлення (див. Рис. 1, г). Для підтвердження хондрогенной диф-ференціровкі МСК культивовані клітини їм-муноцітохіміческі офарблювалися альциановим синім. При дозріванні хондробласти починають продукувати міжклітинний матрикс хрящової тканини, який специфічно офарблювався в синій колір, від світло-блакитного до темно-синього пропорційно товщині відкладення хрящового матриксу (див. Рис. 1, д).

    ВИСНОВОК

    Активні розробки тканеінженерной конструкцій для регенерації тканин опорно-рухового апарату визначають підвищений інтерес до досліджень МСК. МСК, виділені з кісткового мозку, залишаються в центрі уваги більшості досліджень через наявність у них здатності диференціюватися в клітини хондро- і остеогенних типів тканин. У нашій роботі показано, що аспірати кісткового мозку пацієнтів з диспластичних коксоартроз є повноцінним джерелом МСК, які задовольняють вимогам, визначеним Міжнародним товариством клітинної терапії. В експериментах по тривалому культивування з візуальним контролем на апараті Се11-Щ визначені розміри і морфологія типів клітин в популяції МСК, адгезія, експресія типових поверхневих маркерів, проведена діфферен-цировка МСК по Остеогенні і хондрогенному типу. Вперше оцінено параметри рухливості МСК, включаючи траєкторію руху, середню швидкість, а також мітотичний індекс МСК при інкубації на культуральном пластиці.

    МСК є перспективними кандидатами для тканинної інженерії, з прицілом на регенерацію кісткової і хрящової тканини. Отримані дані можуть використовуватися як контрольні параметри клітин при порівнянні з аналогічними параметрами при заселенні клітинами різних «скаффолдов». Порівняння вивчених характеристик клітин дозволить оцінити токсичність і біосумісність «скаффолдов» різного походження і різних фізико-хімічних властивостей. Обчислення швидкості заселення клітинами об'ємних тривимірних «скаффолдов» дозволить розробити методичні підходи до досягнення оптимальних показників адгезії МСК, підтримання їх проліферації і спрямованої диференціювання.

    КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ

    Автори заявляють про відсутність явних і потенційних конфліктів інтересів, пов'язаних з публікацією цієї статті.

    ПОДЯКИ

    Дослідження проводилося за підтримки Російського фонду фундаментальних досліджень (грант № 15-29-04875) c використанням наукового обладнання Центру колективного користування «Регенеративне медицина і клітинні технології», організованого на базі АТ «Інноваційний медико-технологічний центр (Медичний технопарк)». Робота в частині аналізу рухової активності клітин виконана за підтримки бюджетного проекту Фіц «Інститут цитології і генетики СВ РАН» № 0324-2016-0003.

    СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

    1. Андрєєва Н.В., Бонарцев А.П., Жаркова І.І., Махіна Т.К., Мишкіна В.Л., Харитонова Є. П., Воїнова В.В., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В., Белявський А.В. Культивування мезенхімних стовбурових клітин миші на матриксу з полі-3-оксибутират // Клітинні технології в біології та медицині. 2015. (2). 114-119.

    2. Кожевникова М.Н., Мікаєлян А.С., Старостін В.І. Молекулярно-генетичний і іммунофе-нотіпіческій аналіз антигенного профілю, остео-генних і адіпогенних потенцій мезенхімальних стромальних клітин з печінки зародків і кісткового мозку статевозрілих щурів // Цитология. 2009. 51. (6). 526-538.

    3. Banfi A., Muraglia A., Dozin B., Mastrogiaco-mo M., Cancedda R., Quarto R. Proliferation kinetics

    and differentiation potential of ex vivo expanded human bone marrow stromal cells: Implications for their use in cell therapy // Exp. Hematol. 2000. 28. (6). 707-715.

    4. Bara J., Richards R.G., Alini M., Stoddart M.J. Concise review: Bone marrow-derived mesenchymal stem cells change phenotype following in vitro culture: implications for basic research and the clinic // Stem Cells. 2014. 32. 1713-1723.

    5. Beyer Nardi N., da Silva Meirelles L. Mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion and characterization // Handb. Exp. Pharmacol. 2006. (174). 249-282.

    6. Bianco P., RiminucciM., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications // Stem Cells. 2001. 19. (3). 180192.

    7. Charbord P. Bone marrow mesenchymal stem cells: historical overview and concepts // Hum. Gene Ther. 2010. 21. 1045-1056.

    8. Da Silva Meirelles L., Caplan A.I., Nardi N.B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells // Stem Cells. 2008. 26. (9). 2287-2299.

    9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. 2006. 8. (4). 315-317.

    10. Dong Y., Chen X., Hong Y. Tissue-engineered bone formation in vivo for artificial laminae of the vertebral arch using beta-tricalcium phosphate bioceramics seeded with mesenchymal stem cells // Spine. 2013. 38. (21). 1300-1306.

    11. Gimble J.M., Grayson W., Guilak F., Lopez M.J., Vunjak-Novakovic G. Adipose tissue as a stem cell source for musculoskeletal regeneration // Front. Biosci. 2011. 3. 69-81.

    12. Horner CB, Hirota K., Liu J., Maldonado M., Hyle Park B., Nam J. Magnitude-dependent and inversely-related osteogenic / chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under dynamic compressive strain // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2016. doi: 10.1002 / term.2332.

    13. Horwitz EM, Le Blanc K., Dominici M., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini FC, Deans RJ, Krause DS, Keating A. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. 2005. 7. (5). 393-395.

    14. Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review // J. Nippon. Med. Sch. 2009. 76. (2). 56-66.

    15. Mizuno H. Adipose-derived stem and stromal cells for cell-based therapy: current status of preclinical studies and clinical trials // Curr. Opin. Mol. Ther. 2010. 12. (4). 442-449.

    16. Mosna F., Sensebe L., Krampera M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide // Stem Cells Develop. 2010. 19. (10) 1449-1470.

    17. Di Maggio N. Bone marrow mesenchymal stem cell niches and regenerative medicine. Basel, 2010. 142 p.

    18. Wu Y, Yang Z, Law J.B., He A.Y., Abbas A.A., Denslin V., Kamarul T., Hui J.H., Lee E.H. The combined effect of substrate stiffness and surface topography on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells // Tissue Eng. Part A. 2017. 23. (1-2). 43-54.

    CULTIVATION AND CHARACTERISTICS OF MESENCHYMAL STEM CELLS FROM THE BONE MARROW OF THE PATIENTS WITH ORTHOPEDIC PATHOLOGY

    Nataliya Mikhaylovna ASTAKHOVA12, Anastasiya Viktorovna KOREL1, Konstantin Evgen'evich ORISHCHENKO3, Yaroslav Reyngol'dovich EFREMOV34, Gleb Aleksandrovich KUDROV1, Irina Anatol'evna KIRILOVA1

    1 Novosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics n.a. Ya.L. Tsivyan of Minzdrav of Russia

    630091, Novosibirsk, Frunze str., 17

    2 Innovative Medical Technology Center (Medical TechnoPark) 630091, Novosibirsk, Frunze str., 19a

    3 Institute of Cytology and Genetics of SB RAS 630090, Novosibirsk, Academician Lavrentiev av., 10

    4 Novosibirsk State University 630090, Novosibirsk, Pirogov str., 2

    The article presents data on the cultivation and characteristics of mesenchymal stem cells (MSC) isolated from the bone marrow of patients with dysplastic coxarthrosis. Several morphological phenotypes were found in the fraction of adhesive MSC: spindle-shaped elongated cells, large flattened cells, and thin stellate cells in both samples of bone marrow. Immunophenotypic analysis showed that cells express surface antigens (CD90, CD73, CD105, CD45 and CD34), which are characteristic for typical stem cells. It was shown that the use of a new growth medium containing no components of animal origin for the cultivation of human MSC allowed to achieve confluence of the cell culture on the 16th-8th day of incubation without delaying the proliferative activity of the cells and without loss of ability to differentiate into chondro- and osteogenic types of tissues. Multipotency of MSC was confirmed by osteogenic and chondrogenic differentiation of cells, during prolonged cultivation of MSCs in induction media in vitro. The differentiation of MSC into osteoblasts was confirmed by immunocytochemical staining for alkaline phosphatase and alizarin red S. Specific differentiation of MSC in chondrogenic type was revealed by staining of cartilage deposits with alcian blue. For the first time, such characteristics of human MSC as: mitotic index, trajectory of cells migration and average speed of migration on culture plastics were determined. The mitotic index of actively proliferating MSC was from 2.7 to 3.4% of the total cell number. The moving activity (speed of cell migration) was 38-42 ^ m / h. Thus, bone marrow aspirate from patients with orthopedic pathology is the source of stem cells that meet all the criteria for MSC as determined by the International Society of Cellular Therapy and can be used in regenerative therapy of bone and cartilage.

    Key words: mesenchymal stem cells (MSCs), bone marrow, dysplastic coxarthrosis, mitotic index, speed of migration, differentiation, bone and cartilage regeneration.

    Astakhova N.M. - candidate of biological sciences, senior researcher of experimental department, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Korel A.V. - candidate of biological sciences, senior researcher of experimental department, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. Orishchenko K.E. - candidate of biological sciences, head of cell technologies sector, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Efremov Ya.R. - leading engineer of the center for microscopic analysis of biological objects, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. Kudrov G.A. - junior researcher of experimental department, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Kirilova I.A. - doctor of medical sciences, leading researcher of experimental department, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.


    Ключові слова: МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ стромальні клітини /КІСТКОВИЙ МОЗОК /диспластична коксоартроз /мітотичний індекс /ШВИДКІСТЬ МІГРАЦІЇ /диференціювання /РЕГЕНЕРАЦІЯ КІСТКИ І ХРЯЩА

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити