Біназа, секретируемая рибонуклеаза (РНКаза) Bacillus pumilus, відома як перспективний агент альтернативної хіміотерапії раку, що володіє апоптоз-індукує дією по відношенню до клітин, експресуючих онкогени ras, kit, AML-ETO. кристалічна структура мутанта бінази з двома точковими замінами Glu43Ala / Phe81Ala свідчить про відсутність димеризованих форм білка, характерних для бінази дикого типу. У даній роботі з метою характеристики нативной структурної організації проведено електрофоретичний і хроматографический аналіз мутанта Glu43Ala / Phe81Ala. Показано, що мутантний фермент, як і біназа дикого типу, має каталітично активними димерами різного рівня стабільності, були ідентифіковані як в денатуруючих, але і в нативних умовах. Встановлено, що в біназе в переважній кількості представлена ​​стабільна дімерная форма, тоді як мутант Glu43Ala / Phe81Ala більшою мірою представлений нестабільними димерами. Хоча каталітична активність мутанта по відношенню до природного субстрату РНК у порівнянні з ферментом дикого типу була нижче, він проявив на 32-35% вищу цитотоксичность щодо клітин аденокарциноми легенів людини. Отримані дані свідчать про внесок структурної організації РНКаз в їх цитотоксичность і підтверджують значимість аналізу нативной конформації цитотоксичних білків.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Дудкіна Олена Володимирівна, Ульянова Віра Володимирівна, Сурченко Юлія Володимирівна, Нгуєн Тхі Нга, Колпаков Олексій Іванович


Crystal Structure of Binase Does Not Reflect Its Native Conformation

Cytotoxic ribonucleases (RNases) of the T1 family, including binase, the secreted guanyl-preferring RNase of Bacillus pumilus, are considered as promising agents of alternative anticancer chemotherapy. Binase has a selective apoptosis-inducing action against cells expressing oncogenes ras, kit, AML-ETO. The crystal structure of the binase mutant with two-point amino acid substitutions at positions 43 and 81 (Glu43Ala / Phe81Ala) indicates the absence of dimeric forms, which are characteristic for the wild-type binase. We studied the native structural organization of the Glu43Ala / Phe81Ala mutant. It was found that the mutant enzyme, similarly to the wild-type binase, possesses catalytically active dimers of different stability levels identified not only under denaturing gel electrophoresis, but also under native conditions. The results of the study show that binase exists predominantly in the dimeric form, whereas the Glu43Ala / Phe81Ala mutant approximately equally represented by both dimers and monomers formed as a result of the decomposition of unstable dimers. Although the catalytic activity of the mutant with respect to the natural substrate, RNA, was lower, as compared to the wild-type enzyme, it exhibited a 32-35% higher cytotoxicity against human adenocarcinoma cells. The data obtained indicate the contribution of the structural organization of RNases to their cytotoxicity and confirm the significance of the analysis of the native conformation of cytotoxic proteins.


Область наук:
  • Біотехнології в медицині
  • Рік видавництва: 2018
    Журнал: Вчені записки Казанського університету. Серія Природничі науки

    Наукова стаття на тему 'КРИСТАЛІЧНА СТРУКТУРА БІНАЗИ НЕ ВІДБИВАЄ ЇЇ нативної конформації'

    Текст наукової роботи на тему «КРИСТАЛІЧНА СТРУКТУРА БІНАЗИ НЕ ВІДБИВАЄ ЇЇ нативної конформації»

    ?2018, Т. 160, кн. 4 С.591-600

    ВЧЕНІ ЗАПИСКИ КАЗАНСЬКОГО УНІВЕРСИТЕТУ. СЕРІЯ ПРИРОДНИЧІ НАУКИ

    ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)

    УДК 577.112: 57.012.5: 577.151.6

    КРИСТАЛІЧНА СТРУКТУРА БІНАЗИ НЕ ВІДБИВАЄ ЇЇ нативної конформації

    1 + 1 12 Є.В. Дудкіна, В.В. Ульянова. , Ю.В. Сурченко, Н.Т. Нгуєн ,

    А.І. Колпаков1, О.Н. Ільінская.1

    1 Казанський (Приволзький) федеральний університет, м Казань, 420008, Росія 2Ханойскій медичний університет, м Ханой, 116001, В'єтнам

    анотація

    Біназа, секретується рибонуклеаза (РНКаза) Bacillus pumilus, відома як перспективний агент альтернативної хіміотерапії раку, що володіє апоптоз-індуці-рующим дією по відношенню до клітин, експресуючих онкогени ras, kit, AML-ETO. Кристалічна структура мутанта бінази з двома точковими замінами Glu43Ala / Phe81Ala свідчить про відсутність димеризованих форм білка, характерних для бінази дикого типу. У даній роботі з метою характеристики нативной структурної організації проведено електрофоретичний і хроматографический аналіз мутанта Glu43Ala / Phe81Ala. Показано, що мутантний фермент, як і біназа дикого типу, має каталітично активними димерами різного рівня стабільності, були ідентифіковані як в денатуруючих, але і в нативних умовах. Встановлено, що в біназе в переважній кількості представлена ​​стабільна дімерная форма, тоді як мутант Glu43Ala / Phe81Ala більшою мірою представлений нестабільними димерами. Хоча каталітична активність мутанта по відношенню до природного субстрату - РНК - в порівнянні з ферментом дикого типу була нижче, він проявив на 32-35% вищу цитотоксичность щодо клітин аденокарциноми легенів людини. Отримані дані свідчать про внесок структурної організації РНКаз в їх цитотоксичність і підтверджують значимість аналізу нативної конформації цітоток-Січной білків.

    Ключові слова: рибонуклеаза, біназа, мутант Glu43Ala / Phe81Ala, кристалічна структура, нативная конформація, цитотоксичність

    Вступ

    Секретуються бацилярні рибонуклеази сімейства Т1 розглядають як перспективні агенти альтернативної хіміотерапії раку в зв'язку з їх біологічною активністю, спрямованої на регуляцію експресії генів і індукцію апоптозу. Молекулярні характеристики цих ферментів визначають можливість індукції загибелі пухлинних клітин під впливом екзогенних мікробних РНКаз. Відомо, що каталітична активність, величина позитивного заряду і його локалізація важливі для прояву цитотоксичности РНКаз [1-3]. У той же час чутливість пухлинних клітин до апоптоз-індукує дії РНКаз пов'язана і з власне клітинними компонентами, зокрема з експресією певних онкогенів, таких як ras, kit, AML-ETO [4-6].

    Раніше ми охарактеризували етапи загибелі пухлинних клітин під дією екзогенних цитотоксичних РНКаз: це блокування активності кальцій-залежних калієвих (КСа) каналів, падіння мембранного потенціалу мітохондрій, появою морфологічних маркерів апоптозу (вакуолізація цитоплазми, конденсація і фрагментація хроматину, апоптичні зменшення обсягу клітин) [7 , 8]. Двофазна кінетика інгібування КСа-каналів РНКаз, тривалість і оборотність цього процесу вказують на те, що інгібірова-ня відбувається на рівні синтезу білків каналів. Результати обробки мРНК РНКаз in vitro свідчать про можливість утворення продуктів гідролізу, схожих за властивостями з мікроРНК і малими интерферирующими РНК, що дозволяє припускати їх втручання в процес РНК інтерференції [9].

    Останнім часом активно досліджується структура цитотоксичних РНКаз. Створено мутантні і модифіковані варіанти мікробних РНКаз, що володіють виборчої токсичністю для ракових клітин [10]. Нами встановлено, що біназа - гуанілспеціфічная РНКаза, секретується штамом Bacillus pumilus, - є природним димером [11]. Однак порівнянні даних про структуру ферменту в кристалі і в його нативному стані приділяється недостатньо уваги, хоча внесок нативной конформації РНКаз у взаємодію з пухлинної клітиною може бути домінуючим для подальшого прояву цитотоксичности. У зв'язку з вищевикладеним метою цієї роботи було визначення нативної структурної організації мутантною бінази з двома точковими замінами в первинну структуру білка і виявлення Цитотоксичність-сті цього ферменту по відношенню до пухлинних клітин аденокарциноми легенів людини.

    матеріали

    Біназа є катіонний білок молекулярною масою близько 12 кДа, що складається з 109 амінокислотних залишків і яку ми здобули в гомогенному стані з культуральної рідини продуцента за методикою, описаною раніше [12]. Об'єктом дослідження в даній роботі став препарат мутантною бінази з двома точковими замінами вихідних амінокислот в 43-м і 81-м положенні на аланін (Glu43Ala / Phe81Ala), люб'язно наданий В.А. Митькевич (Інститут молекулярної біології РАН, Москва). В якості контрольних білків використані комерційні препарати панкреатичної РНКази А і лізоциму (Sigma-Aldrich, США).

    Методи дослідження

    SDS-електрофорез в поліакриламідному гелі. Електрофоретичне поділ білків проводили в 15% -ному поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності 0.1% -ного додецилсульфата натрію (SDS) за стандартною методикою Леммлі [13].

    Визначення РНКазной активності методом зімографіі. Оцінку каталітичної активності ферментів проводили шляхом поділу білків в 15% -ному ПААГ за модифікованою методикою Леммлі [13]. Як субстрат

    в розділяє гель додавали дріжджову РНК (Sigma-Aldrich, США) в концентрації 7 мг / мл. Після електрофоретичного розділення білків гель відмивали по 10 хв в буфері I (10 мМ трис-HCl, 20% -ний изопропанол, pH 7.5), буфері II (10 мМ трісНС1, pH 7.5) і буфері III (100 мМ трис-HCl, pH 7.5). Для фарбування гелів використовували 0.2% -ний розчин толуїдинового синього (Sigma-Aldrich, США). Про наявність у білків РНКазной активності судили по зонам гідролізу РНК на гелі.

    Нативний електрофорез. Нативний електрофорез білків проводили в 15% -ному ПААГ згідно модифікованою методикою Леммлі без додавання денатуруючих агентів [13]. 15% -ний розділяє гель і 6% -ний концентрує гель були приготовлені на основі 1.5 М ацетатного буфера, (pH 4.8) і 0.25 М ацетатного буфера (pH 6.8) відповідно. Білки ресуспендіруют-вали в буфері для внесення (0.25 M CH3COOK, 10% -ний гліцерин, 0.02% -ний метиленовий зелений, рН 6.8) і розганяли в робочому буфері (0.35 М? -Аланін, 0.14 M CH3COOK). Візуалізацію білків проводили з використанням стандартних розчинів, використовуваних для SDS-електрофорезу.

    Гель-фільтрація. Ексклюзіонную хроматографію білків проводили на колонці Enrich SEC 70 (Bio-rad, США) в буфері I (25 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, pH 8.0) з використанням хроматографічної системи середнього тиску Biologic DuoFlow (Bio-Rad, США). Швидкість протоку склала 0.5 мл / хв. В якості маркерів використовували: бичачий сироватковий альбумін (молекулярна маса, ММ - 66.2 КДД), трипсин (ММ - 24 КДД) і лізоцим (ММ - 14.4 КДД) (Sigma-Aldrich, США).

    Цитотоксичність. Оцінку цитотоксичности досліджуваних білків проводили з використанням МТТ-тесту. Метод заснований на здатності мітохон-дріального ферменту сукцинатдегідрогенази відновлювати жовту сіль МТТ (3- [4,5-діметілтіазол-2-іл] -2,5-діфенілтетразолія бромід) до кристалів формазану. Клітинну лінію аденокарциноми легенів людини (А549) інкубували в стандартному середовищі DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) в присутності бінази або її мутанта в концентраціях 100 мкг / мл при 37 ° С в СО2-інкубаторі. Через 48 год середу міняли на свіжу, що містить реагент МТТ. Оптичну щільність реєстрували при довжині хвилі 540 нм на планшетному спектрофотометре Multiscan (Thermo Fisher Scientific, США).

    Результати та їх обговорення

    Тривимірна структура бінази при вирішенні 1.65 A і структура її мутанта Trp34Phe при вирішенні 1.7 A була визначена К.М. Поляковим зі співавторами [14]. У кристалічній формі і сама біназа, і даний мутант поряд з мономерной виявили наявність димеризованих структур. При цьому в димерах для каталізу був відкритий тільки один каталітичний центр. Автори [14] припустили, що інший мутант бінази - Glu43Ala / Phe81Ala - не формуватиме димери, оскільки глутамінова кислота в положенні 43 і фенілаланін в положенні 81 беруть участь у димеризації. Дійсно, В.А. Митькевич зі співавторами [10] показали, що в кристалі у мутанта Glu43Ala / Phe81Ala ді-заходи відсутні, а каталітична активність мутанта в 1.7 разів вище, ніж у бінази дикого типу, що побічно свідчить про відкриття каталитич-

    ського центру парного мономера. Однак нами припущено, що каталітична активність РНКази, виміряна по відношенню до поліінозіновой кислоті [ро1у (1)] не може адекватно відображати вплив ферменту на клітини: в природних умовах РНКаза розщеплює доступну РНК, серед якої є і дволанцюжкова, активність до якої гідроліз [ро1у (1)] не фіксує. У зв'язку з цим в даній роботі проведено електрофоретичний аналіз мутанта Glu43Ala / Phe81Ala в присутності денатурирующего агента додецилсульфата натрію, а також виявлення каталітичної активності мутанта по відношенню до високополімерної РНК в порівнянні з біназой дикого типу (рис. 1). Виявилося, що навіть в денатуруючих умовах частина ферменту зберігає димерную структуру, про що свідчить смуга в області 25 кДа (рис. 1, а). Більш того, каталітична активність мутанта по відношенню до природного субстрату, РНК, помітно нижче, ніж у ферменту дикого типу (рис. 1, б). Відзначимо, що обидва білка були нанесені на гель в рівних кількостях. Далі необхідно було визначити, чи існують димерні форми ферментів в неденатурірующіх умовах. Нативний електрофорез показав, що в біназе в переважній кількості представлена ​​дімерная форма, тоді як мутант Glu43Ala / Phe81Ala в приблизно рівних частках представлений і мономером і димером (рис. 2, а). Відзначимо, що контрольні білки, РНКаза А і лізоцим, в нативних умовах ді-мерів не утворюють. Ймовірно, мономери в процесі електрофорезу утворюються при розпаді нестабільних димарів.

    Це припущення було підтверджено методом ексклюзіонной хроматографії. Аналіз білків методом гель-фільтраційної хроматографії, в ході якої молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їх різну здатність проникати в пори нерухомої фази, показав, що і біназа, і її мутант Glu43Ala / Phe81Ala мають рівний час виходу, що свідчить про їх подібною димерной організації (рис. 2, б).

    Таким чином, в умовах водних розчинів Glu43Ala / Phe81Ala-мутант бінази, як і фермент дикого типу, представлений дімерная формами. Частина димарів цих бацилярних РНКаз нестабільна, що і зумовлює появу навіть в умовах неденатурірующего електрофорезу смуг, характерних для мономерів (рис. 2, а). Більш високий вміст нестабільних димарів у мутанта Glu43Ala / Phe81Ala в порівнянні з біназой дикого типу, ймовірно, визначає висновок про відсутність таких, зроблене в роботі [10].

    На основі молекулярного моделювання можна припускати у даних РНКаз наявність двох форм димарів, одна з яких формується ван-дер-ваальсовими і електростатичними взаємодіями, а інша збалансована різними нековалентними зв'язками. Обидві моделі білків здатні стабілізуватися за рахунок обміну N або С-решт білкових молекул (swapping-механізм) [11]. Димери, в яких мономери зв'язані високостабільним ді-сульфідними ковалентними зв'язками, виключаються з розгляду через відсутність сірковмісних амінокислот в молекулі ферменту. Ймовірно, що більш стабільні swapping-димери в біназе дикого типу, на відміну від мутанта Glu43Ala / Phe81А1а, переважають над димерами, освіченими слабкими некова-лентнимі зв'язками. Мутант Glu43Ala / Phe81Ala показав по відношенню до клітин

    WT Mut WT Mut M

    ji Л

    - ; 25 кДа

    mm 12 «Так

    А Б

    Мал. 1. SDS-електрофорез (а) і зімограмма (б) бінази і її Glu43Ala / Phe81Ala-MyTaHTa. WT - біназа дикого типу, Mut - Glu43Ala / Phe81Ala-MyTaHT бінази, М - маркери молекулярної маси. Концентрація білка в лунці - 10 мкг

    Мал. 2. Оцінка структурної організації бінази і її Glu43Ala / Phe81Ala-MyraHTa в нативних умовах: а) нативний електрофорез: WT - біназа дикого типу (pI 9.52), Mut - 01і43Л1а / РІе81Л1а-мутант бінази (pI 9.69), R - РНКаза А ( ММ - 13 кДа, pI 9.64), L - лізоцим (ММ - 14.4 кДа, pI 11.3); б) ексклюзійна хроматографія бінази і її мутанта (pH 8.0)

    гострого мієлоїдного лейкозу Касуми вищу цитотоксичность в порівнянні з біназой: його цитотоксичну дію перевищило таке у бінази на 27% [10]. Дані, отримані в відношенні клітин аденокарциноми легенів людини А549, також свідчать, що мутант Glu43Ala / Phe81Ala має більш високу цитотоксичність в порівнянні з біназой дикого типу, перевищуючи її цитотоксичну дію на 32-35% (табл. 1).

    Табл. 1

    Життєздатність клітин аденокарциноми легенів людини А549 після обробки РНКаз протягом 48 год (%). За 100% прийнята життєздатність необроблених клітин, культивованих рівний час

    Фермент Концентрація білка, мкг / мл

    100 300

    Біназа 71 ± 1.0 62 ± 0.9

    Мутант Glu43Ala / Phe81Ala 46 ± 1.7 42 ± 2.1

    Онкогенні мутації в ras - гені характерні приблизно для третини випадків всіх пухлин людини [15]. Кількість інцидентів мутацій ras - гена при аденокар-Ціном легких, а також при мієлоїдному лейкозі виявлено в 30% випадків цих ракових захворювань [16]. З огляду на, що саме онкоген ras є однією з мішеней дії екзогенних бацилярних РНКаз, можна припустити, що подібні показники цитотоксичності Glu43Ala / Phe81Ala-мутанта на клітинах Касуми і А549 пов'язані з експресією даного мутантного онкогена. Особливості структурної організації двох досліджених РНКаз безумовно вносять свій внесок в їх біологічну дію. Ймовірно, нізкостабільние димери ферментів, диссоциирующие у водних розчинах на мономери, більш активно індукують загибель пухлинних клітин.

    Подяки. Автори дякують В.М. Митькевич за надання мутантною бінази.

    Робота виконана за рахунок коштів субсидії, виділеної в рамках державної підтримки Казанського (Приволзького) федерального університету з метою підвищення його конкурентоспроможності серед провідних світових науково-освітніх центрів, а також підтримана грантами РНФ 18-74-00108 в частині характеристики структури РНКаз і РФФД 17- 00-00060 (КОМФИ) в частині визначення цитотоксичних властивостей ферментів.

    література

    1. Makarov AA., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: Molecular weapons and their targets // FEBS Lett. - 2003. - V. 540, No 1-3 - P. 15-20. - doi: 10.1016 / S0014-5793 (03) 00225-4.

    2. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents // BioEssays. - 2008. - V. 30, No 8. - P. 781-790. - doi: 10.1002 / bies.20789.

    3. Ilinskaya O.N., Dreyer F., Mitkevich V.A., Shaw K.L., Pace C.N., Makarov A.A. Changing the net charge from negative to positive makes ribonuclease Sa cytotoxic // Protein Sci. -2002. - V. 11, No 10. - P. 2522-2525. - doi: 10.1110 / ps.0216702.

    4. Ilinskaya O.N., Singh I., Dudkina E., Ulyanova V., Kayumov A., Barreto G. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase) // Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Res. - 2016. - V. 1863 No 7. - P. 1559-1567. - doi: 10.1016 / j.bbamcr.2016.04.005.

    5. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Kretova O.V., Zelenikhin P.V., Prassolov V.S., Tchu-rikov N.A., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. Oncogenic c-kit transcript is a target for binase // Cell Cycle. - 2010. - V. 9, No 13. - P. 2674-2678. - doi: 10.4161 / cc.9.13.12150.

    6. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V., Fedorova T.V., Kretova O.V., Tchu-rikov N.A., Prassolov V.S., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and АML1-ETO oncogenes // Cell Cycle. - 2011. - V. 10, No 23. - P. 4090-4097. - doi: 10.4161 / cc.10.23.18210.

    7. Ilinskaya O., Decker K., Koschinski A., Dreyer F., Repp H. Bacillus intermedius ribonu-clease as inhibitor of cell proliferation and membrane current // Toxicology. - 2001. -V. 156, No 2-3. - P. 101-107. - doi: 10.1016 / S0300-483X (00) 00335-8.

    8. Ilinskaya O.N., Koschinski A., Repp H., Mitkevich V., Dreyer F., Scholtz J.M., Pace C.N., Makarov A. RNase induced apoptosis: fate of calcium-activated potassium channels // Biochemie. - 2008. - V. 90, No 5. - P. 717-725. - doi: 10.1016 / j.biochi.2008.01.010.

    9. Mitkevich V.A., Tchurikov N.A., Zelenikhin P.V., Petrushanko I.Yu., Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Binase cleaves cellular noncoding RNAs and affects coding mRNAs // FEBS J. -2010. - V. 277, No 1. - P. 186-196. - doi: 10.1111 / j.1742-4658.2009.07471.x.

    10. Mitkevich V.A., Schulga A.A., Trofimov A.A., Dorovatovskii P.V., Goncharuk D.A., Tkach E.N., Makarov A.A., Polyakov K.M. Structure and functional studies of the ribonu-clease binase Glu43Ala / Phe81Ala mutant // Acta Cryst. Sect. D: Biol. Crystallogr. -2013. - V. 69, No 6. - Р. 991-996. - doi: 10.1107 / S0907444913004046.

    11. Dudkina E., Kayumov A., Ulyanova V., Ilinskaya O. New insight into secreted ribonucle-ase structure: Binase is a natural dimer // PLoS One. - 2014. - V. 9, No 12. -Art. e115818, P. 1-14. - doi: 10.1371 / journal.pone.0115818.

    12. Dudkina E., Ulyanova V., Shah MahmudR., Khodzhaeva V., Dao L., Vershinina V., Kolpa-kov A., Ilinskaya O. Three-step procedure for preparation of pure Bacillus altitudinis ribonu-cleas // FEBS Open Bio. - 2016. - V. 6, No 1. - Р. 24-32. - doi: 10.1002 / 2211-5463.12023.

    13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227, No 5259. - P. 680-685.

    14. Polyakov K.M., Goncharuk, D.A., Trofimov, A.A., Safonova, T.N., Mitkevich V.A., Tkach E.N., Makarov A.A., Shulga A.A. X-ray diffraction and biochemical studies of W34F mutant ribonuclease binase // Mol. Biol. - 2010. - V. 44, No 5. - Р. 817-822. -doi: 10.1134 / S0026893310050195.

    15. Adjei A.A. Ras signaling pathway proteins as therapeutic targets // Curr. Pharm. Des. -2001. - V. 7, No 16. - P. 1581-1594. - doi: 10.2174 / 1381612013397258.

    16. Bos J.L. ras Oncogenes in human cancer: A review // Cancer Res. - 1989. - V. 49, No 17. - P. 4682-4689.

    Надійшла до редакції 26.06.18

    Дудкіна Олена Володимирівна, кандидат біологічних наук, молодший науковий співробітник OpenLab «Маркери патогенезу» кафедри мікробіології

    Казанський (Приволзький) федеральний університет вул. Кремлівська, д. 18, м Казань, 420008, Росія E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Ульянова Віра Володимирівна, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник OpenLab «Маркери патогенезу» кафедри мікробіології Казанський (Приволзький) федеральний університет вул. Кремлівська, д. 18, м Казань, 420008, Росія E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Сурченко Юлія Володимирівна, аспірант кафедри мікробіології Казанський (Приволзький) федеральний університет вул. Кремлівська, д. 18, м Казань, 420008, Росія E-mail: sokurenko.yulia@gmail. com

    Нгуєн Тхі Нга, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

    Ханойський медичний університет

    1-я вул. Тон Зат Тунг, округ Донг Да, м Ханой, 116001, В'єтнам E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Колпаков Олексій Іванович, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник OpenLab «Маркери патогенезу» кафедри мікробіології Казанський (Приволзький) федеральний університет вул. Кремлівська, д. 18, м Казань, 420008, Росія E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Іллінська Ольга Миколаївна, доктор біологічних наук, завідувач кафедри мікробіології

    Казанський (Приволзький) федеральний університет вул. Кремлівська, д. 18, м Казань, 420008, Росія E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)

    UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)

    2018, vol. 160, no. 4, pp. 591-600

    Crystal Structure of Binase Does Not Reflect Its Native Conformation

    E. V. Dudkina a, V.V. Ulyanova a, Yu.V. Surchenko a, N.T. Nguen b "", A.I. Kolpakov a * "", O.N. Ilinskaya a ** "" aKazan Federal University, Kazan, 420008 Russia hHanoi Medical University, Hanoi, 116001 Vietnam E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її., Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її., Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її., nn7189 @ gmail.com, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її., Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Received June 26, 2018 Abstract

    Cytotoxic ribonucleases (RNases) of the T1 family, including binase, the secreted guanyl-preferring RNase of Bacillus pumilus, are considered as promising agents of alternative anticancer chemotherapy. Binase has a selective apoptosis-inducing action against cells expressing oncogenes ras, kit, AML-ETO. The crystal structure of the binase mutant with two-point amino acid substitutions at positions 43 and 81 (Glu43Ala / Phe81Ala) indicates the absence of dimeric forms, which are characteristic for the wild-type binase. We studied the native structural organization of the Glu43Ala / Phe81Ala mutant. It was found that the mutant enzyme, similarly to the wild-type binase, possesses catalytically active dimers of different stability levels identified not only under denaturing gel electrophoresis, but also under native conditions. The results of the study show that binase exists predominantly in the dimeric form, whereas the Glu43Ala / Phe81Ala mutant approximately equally represented by both dimers and monomers formed as a result of the decomposition of unstable dimers. Although the catalytic activity of the mutant with respect to the natural substrate, RNA, was lower, as compared to the wild-type enzyme, it exhibited a 32-35% higher cytotoxicity against human adenocarcinoma cells. The data obtained indicate the contribution of the structural organization of RNases to their cytotoxicity and confirm the significance of the analysis of the native conformation of cytotoxic proteins.

    Keywords: ribonuclease, binase, G1u43A1a / Phe81A1a mutant, crystal structure, native conformation, cytotoxity

    Acknowledgments. We are gratefu1 to V.M. Mitkevich for providing us with mutant binase. The work was performed according to the Russian Government Program of Competitive Growth of Kazan Federa1 University. Description of the structura1 organization of RNases was supported by the Russian Science Foundation (project no. 18-74-00108). Identification of the cytotoxic properties of enzymes was supported by the Russian Foundation for Basic Research (project no. 17-00-00060)

    Figure Captions

    Fig. 1. SDS e1ectrophoresis (a) and zymogram (b) of binase and G1u43A1a / Phe81A1a mutant. WT -wi1d-type binase, Mut - G1u43A1a / Phe81A1a binase mutant, M - mo1ecu1ar mass markers. Proteins per we11 - 10 ^ g.

    Fig. 2. Structura1 organization of binase and G1u43A1a / Phe81A1a mutant under native conditions: a) native e1ectrophoresis: WT - wi1d-type binase (pI 9.52), Mut - G1u43A1a / Phe81A1a mutant of binase (pI 9.69), R - RNase А (MM - 13 kDa, pI 9.64), L - 1ysozyme (MM - 14.4 kDa, pI 11.3); b) size-exc1usion chromatography of binase and its mutant (pH 8.0).

    References

    1. Makarov A.A., I1inskaya O.N. Cytotoxic ribonuc1eases: Mo1ecu1ar weapons and their targets (review). FEBS Lett., 2003 vo1. 540, nos. 1-3, pp. 15-20. doi: 10.1016 / S0014-5793 (03) 00225-4.

    2. Makarov A.A., Ko1chinsky A., I1inskaya O.N. Binase and other microbia1 RNases as potentia1 anticancer agents. BioEssays, 2008, vo1. 30, no. 8, pp. 781-790. doi: 10.1002 / bies.20789.

    3. I1inskaya O.N., Dreyer F., Mitkevich V.A., Shaw K.L., Pace C.N., Makarov A.A. Changing the net charge from negative to positive makes ribonuc1ease Sa cytotoxic. Protein Sci., 2002 vo1. 11, no. 10, pp. 2522-2525. doi: 10.1110 / ps.0216702.

    4. I1inskaya O.N, Singh I, Dudkina E., U1yanova V., Kayumov A., Barreto G. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuc1ease (binase). Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Res., 2016, vo1. 1863 no. 7, pp. 1559-1567. doi: 10.1016 / j.bbamcr.2016.04.005.

    5. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Kretova O.V., Ze1enikhin P.V., Prasso1ov V.S., Tchurikov N.A., I1inskaya O.N., Makarov A.A. Oncogenic c-kit transcript is a target for binase. Cell Cycle. 2010 vo1. 9, no. 13, pp. 2674-2678. doi: 10.4161 / cc.9.13.12150.

    6. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V., Fedorova T.V., Kretova O.V., Tchurikov N.A., Prasso1ov V.S., I1inskaya O.N., Makarov A.A. Sensitivity of acute mye1oid 1eukemia Kasumi-1 ce11s to binase toxic action depends on the expression of KIT and AML1-ETO oncogenes. Cell Cycle, 2011, vo1. 10, no. 23, pp. 4090-4097. doi: 10.4161 / cc.10.23.18210.

    7. I1inskaya O., Decker K., Koschinski A., Dreyer F., Repp H. Bacillus intermedius ribonuc1ease as inhibitor of ce11 pro1iferation and membrane current. Toxicology, 2001., vo1. 156, nos. 2-3, pp. 101-107. doi: 10.1016 / S0300-483X (00) 00335-8.

    8. I1inskaya O.N., Koschinski A., Repp H., Mitkevich V., Dreyer F., Scho1tz J.M., Pace C.N., Makarov A. RNase induced apoptosis: Fate of ca1cium-activated potassium channe1s. Biochemie, 2008, vo1. 90, no. 5, pp.717-725. doi: 10.1016 / j.biochi.2008.01.010.

    9. Mitkevich V.A., Tchurikov N.A., Ze1enikhin P.V., Petrushanko I.Yu., Makarov A.A., I1inskaya O.N .. Binase c1eaves ce11u1ar noncoding RNAs and affects coding mRNAs. FEBS J. 2010, vo1. 277, no. 1, pp. 186-196. doi: 10.1111 / j.1742-4658.2009.07471 .x.

    10. Mitkevich V.A., Schu1ga A.A., Trofimov A.A., Dorovatovskii P.V., Goncharuk D.A., Tkach E.N., Makarov A.A., Po1yakov K.M. Structure and functiona1 studies of the ribonuc1ease binase G1u43A1a / Phe81A1a mutant. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., 2013, vo1. 69, no. 6, pp. 991-996. doi: 10.1107 / S0907444913004046.

    11. Dudkina E., Kayumov A., U1yanova V., I1inskaya O. New insight into secreted ribonuc1ease structure: Binase is a natura1 dimer. PLoS One, 2014 року, vo1. 9, no. 12, art. e115818, pp. 1-14. doi: 10.1371 / journa1.pone.0115818.

    12. Dudkina E., Ulyanova V., Shah Mahmud R., Khodzhaeva V., Dao L., Vershinina V., Kolpakov A., Ilinskaya O. Three-step procedure for preparation of pure Bacillus altitudinis ribonucleas. FEBS Open Bio, 2016, vol. 6, no. 1, pp. 24-32. doi: 10.1002 / 2211-5463.12023.

    13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, no. 5259, pp. 680-685. doi: 10.1038 / 227680a0.

    14. Polyakov K.M., Goncharuk, D.A., Trofimov, A.A., Safonova, T.N., Mitkevich V.A., Tkach E.N., Makarov A.A., Shulga A.A. X-ray diffraction and biochemical studies of W34F mutant ribonuclease binase. Mol. Biol., 2010 vol. 44, no. 5, pp. 817-822. doi: 10.1134 / S0026893310050195.

    15. Adjei A.A. Ras signaling pathway proteins as therapeutic targets. Curr. Pharm. Des., 2001., vol. 7, no. 16, pp. 1581-1594. doi: 10.2174 / 1381612013397258.

    16. Bos J.L. ras oncogenes in human cancer: A review. Cancer Res., 1989, vol. 49, no. 17, pp. 4682-4689.

    Для цитування: Дудкіна О.В., Ульянова В.В., Сурченко Ю.В., Нгуєн Н.Т., Колпаков А.І., Іллінська О.Н. Кристалічна структура бінази не відображає її нативную конформацию // Учений. зап. Казан. ун-ту. Сер. Природ. науки. - 2018. - Т. 160, кн. 4. -С. 591-600.

    For citation: Dudkina E.V., Ulyanova V.V., Surchenko Yu.V., Nguen N.T., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N. Crystal structure of binase does not reflect its native conformation. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2018, vol. 160, no. 4, pp. 591-600. (In Russian)


    Ключові слова: рибонуклеазу / БІНАЗА / МУТАНТ GLU43ALA / PHE81ALA / КРИСТАЛІЧНА СТРУКТУРА / нативних конформація / цитотоксичності / RIBONUCLEASE / BINASE / GLU43ALA / PHE81ALA MUTANT / CRYSTAL STRUCTURE / NATIVE CONFORMATION / CYTOTOXITY

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити