Метою роботи була оцінка терапевтичного потенціалу кріоконсервованих культур алогенних ММСК кісткового мозку при даній патології. Щурам зі змодельованим компресійним дегенеративно-дистрофічних пошкодженням міжхребцевого диска СоУ1-У11 на коллагеновой губці в зону дефекту вводили по 0,5 х 10 6 нативних або кріо-консервованих клітин, в тому числі мічених РКН-26 клітин. Контрольні групи були представлені тваринами з природним ходом відновного процесу (без застосування терапевтичних методів) і введенням фізіологічного розчину. На 30-у добу. після терапії проводили гістоморфометріческое дослідження і люмінесцентну мікроскопію зрізів міжхребцевих дисків СоУ1-У11. У контрольних групах тварин відзначався вкрай низький регенеративний потенціал. На фоні клітинної терапії спостерігалася тенденція до репарації лінійних дефектів, фрагментація пучків колагенових волокон фіброзного кільця, більш виражена в разі застосування нативной культури ММСК. Застосування кріоконсервованої культури ММСК супроводжувалося збільшенням кількості хон-дроцітов дорсальній частині фіброзного кільця на одиницю площі зрізу міжхребцевого диска СоУ1-У11 в 1,25 разів відносно модельних значень. Висота фіброзного кільця при цьому збільшувалася на 12,5 ± 3,3%, а Денсі-тометріческій показник хрящової тканини - на 64 ± 5,7% щодо модельних показників. При люмінесцентної мікроскопії кріостатних зрізів міжхребцевих дисків СоУ1-У11 на 30-е добу. після введення мічених нативних або кріоконсервованих ММСК в зовнішніх відділах фіброзного кільця і ​​по його краю спостерігали світіння в червоному діапазоні спектра у вигляді округлих включень і конгломератів, що свідчило про виживання і міграції в диск трансплантованих і (або) їх дочірніх клітин. Отримані нами дані свідчать про стимулюючий ефект кріоконсервованої суспензії ММСК при дегенеративно-дистрофічних ушкодженнях міжхребцевих дисків.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Юхта М. С., Волкова Н. А., Жуликова Е. П., Гончарук Є. І.


Cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells stimulate reparative chondrogenesis in degenerated intervertebral disc

The choice object for cell therapy of degenerative changes of the intervertebral discs is a cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC). The research aim was to evaluate a therapeutic potential of cryopreserved allogenic marrow-derived MMSC in this pathology. Rats with modeled compressive degenerative damage of the intervertebral disc CcVI-VII were introduced by 0.5x10 B native or cryopreserved as well as PKH-26-labeled cells on a collagen sponge in the defect area. Animals with spontaneous recovery and administration of saline were served as a control. Histomorphometric study and fluorescent microscopy of intervertebral disc sections was performed on the 30th day after treatment. There was extremely low regenerative potential in the control groups of animals. Histologically after cell therapy, there was tendency to repair of cracks, fissures, collagen fiber fragmentations of the fibrous ring, which was more pronounced in the case of the native MMSC culture application. The cryopreserved MMSC administration was accompanied by increasing in the fibrochondrocyte number of the dorsal annulus per unit area of ​​the intervertebral disc CcVI-VII slice at 1.25 times relative to the model values. At the same time the fibrous ring height increased by 12.5 ± 3.3%, and densitometric index of cartilaginous tissue - by 64 ± 5.7% relative to the model values. The luminescence in the red range of the spectrum in the form of drops and conglomerates, which was localized in outer parts of fibrous ring, was detected by fluorescent microscopy of intervertebral disc cryostat sections on the 30 day after introduction of labeled native or cryopreserved MMSC, that indicated the safety and partial migration of transplanted and / or their daughter cells in the intervertebral disc CcVI-VII. Our data showed a stimulating effect of native and cryopreserved marrow-derived MMSC suspension in degenerative intervertebral disc damages.


Область наук:

  • Біотехнології в медицині

  • Рік видавництва: 2013


    Журнал: Гени і клітини


    Наукова стаття на тему 'кріоконсервованих мультипотентні мезенхимниє стромальні клітини стимулюють репаративний хондрогенез в дегенеративно зміненому міжхребцевому диску'

    Текст наукової роботи на тему «кріоконсервованих мультипотентні мезенхимниє стромальні клітини стимулюють репаративний хондрогенез в дегенеративно зміненому міжхребцевому диску»

    ?оригінальні дослідження

    29

    ОРИГІНАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

    Кріоконсервовані мультипотентні мезенхимниє стромальні клітини стимулюють репаративний хондрогенез в дегенеративно зміненому міжхребцевому диску

    М.С. Юхта, Н.А. Волкова, Є.П. Жуликова, Є.І. Гончарук

    Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, Україна

    Cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells stimulate reparative chondrogenesis in degenerated intervertebral disc

    M. S. Iukhta, N.A. Volkova, Zhulikova E.P., E.I. Goncharuk

    Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of Ukraine NAS, Kharkov, Ukraine

    Альтернативою традиційному лікуванню дегенеративних змін міжхребцевих дисків є клітинна терапія мультипотентними мезенхимной стромальних клітинами (ММСК).

    Метою роботи була оцінка терапевтичного потенціалу кріоконсервованих культур алогенних ММСК кісткового мозку при даній патології. Щурам зі змодельованим компресійним дегенеративно-дистрофічних пошкодженням міжхребцевого диска СоУ1-У11 на коллагеновой губці в зону дефекту вводили по 0,5 х 106 нативних або кріоконсервованих клітин, в тому числі мічених РКН-26 клітин. Контрольні групи були представлені тваринами з природним ходом відновного процесу (без застосування терапевтичних методів) і введенням фізіологічного розчину. На 30-у добу. після терапії проводили гістоморфометріческое дослідження і люмінесцентну мікроскопію зрізів міжхребцевих дисків СоУ1-У11.

    У контрольних групах тварин відзначався вкрай низький регенеративний потенціал. На тлі клітинної терапії спостерігалася тенденція до репарації лінійних дефектів, фрагментація пучків колагенових волокон фіброзного кільця, більш виражена в разі застосування нативной культури ММСК. Застосування кріоконсервованої культури ММСК супроводжувалося збільшенням кількості хон-дроцітов дорсальній частині фіброзного кільця на одиницю площі зрізу міжхребцевого диска СоУ1-У11 в 1,25 разів відносно модельних значень. Висота фіброзного кільця при цьому збільшувалася на 12,5 ± 3,3%, а денситометричний показник хрящової тканини - на 64 ± 5,7% щодо модельних показників.

    При люмінесцентної мікроскопії кріостатних зрізів міжхребцевих дисків СоУ1-У11 на 30-е добу. після введення мічених нативних або кріоконсервованих ММСК в зовнішніх відділах фіброзного кільця і ​​по його краю спостерігали світіння в червоному діапазоні спектра у вигляді округлих включень і конгломератів, що свідчило про виживання і міграції в диск трансплантованих і (або) їх дочірніх клітин.

    Отримані нами дані свідчать про стимулюючий ефект кріоконсервованої суспензії ММСК при дегенеративно-дистрофічних ушкодженнях міжхребцевих дисків.

    Ключові слова: міжхребцевий диск, дегенеративно-дистрофічні пошкодження, хрящова тканина, мультипотентні мезенхимниє стромальні клітини, кріоконсервування, клітинна терапія.

    e-mail: Е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    The choice object for cell therapy of degenerative changes of the intervertebral discs is a cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC). The research aim was to evaluate a therapeutic potential of cryopreserved allogenic marrow-derived MMSC in this pathology. Rats with modeled compressive degenerative damage of the intervertebral disc CcVI-VII were introduced by 0.5x10B native or cryopreserved as well as PKH-26-labeled cells on a collagen sponge in the defect area. Animals with spontaneous recovery and administration of saline were served as a control. Histomorphometric study and fluorescent microscopy of intervertebral disc sections was performed on the 30th day after treatment.

    There was extremely low regenerative potential in the control groups of animals. Histologically after cell therapy, there was tendency to repair of cracks, fissures, collagen fiber fragmentations of the fibrous ring, which was more pronounced in the case of the native MMSC culture application. The cryopreserved MMSC administration was accompanied by increasing in the fibrochondrocyte number of the dorsal annulus per unit area of ​​the intervertebral disc CcVI-VII slice at 1.25 times relative to the model values. At the same time the fibrous ring height increased by 12.5 ± 3.3%, and densitometric index of cartilaginous tissue - by 64 ± 5.7% relative to the model values.

    The luminescence in the red range of the spectrum in the form of drops and conglomerates, which was localized in outer parts of fibrous ring, was detected by fluorescent microscopy of intervertebral disc cryostat sections on the 30 day after introduction of labeled native or cryopreserved MMSC, that indicated the safety and partial migration of transplanted and / or their daughter cells in the intervertebral disc CcVI-VII.

    Our data showed a stimulating effect of native and cryopreserved marrow-derived MMSC suspension in degenerative intervertebral disc damages.

    Key words: intervertebral disk, degenerative damage, cartilaginous tissue, multipotent mesenchymal stromal cells, cryopreservation, cell therapy.

    Клітинна трансплантологія і тканинна інженерія Том VIII, № 2, 2013

    30

    оригінальні дослідження

    У МПД дегенеративні зміни настають значно раніше, ніж в кісткових і м'язових структурах. Мінімальні їх прояви виявляють у віці 11-16 років [1]. Надалі вони лише прогресують, викликаючи больовий синдром в області тулуба і кінцівок в середньому до 35- 45 років [2].

    Проблема лікування дорсопатий, зокрема, обумовлених дегенеративно-дистрофічними змінами МПД, ще далека до повного дозволу. В даний час поряд з удосконаленням вже існуючих методів лікування ведеться пошук нових підходів до терапії даної патології. З огляду на, що найбільш значущими клітинними і біохімічними змінами, пов'язаними з дегенерацією МПД, є зниження в ньому чисельної щільності хондроцитов - клітин, що синтезують компоненти позаклітинного матриксу хрящової тканини, - можна припустити, що клітинна терапія при цій патології повинна показати досить високу клінічну ефективність [3 ]. Перспективним «терапевтичним» типом клітин в даному випадку є мультипотентні мезенхимниє стромальні клітини (ММСК), які вже добре «зарекомендували себе» в дослідженнях в рамках травматології та ортопедії. Деякі експериментальні дослідження in vitro показали, що ММСК здатні за певних умов набувати фенотип клітин фіброзного кільця (ФК) [4] і куль-позна ядра (ПМ) [5]. Розроблені на сьогодні протоколи кріоконсервування ММСК кісткового мозку забезпечують високу якість збереженого клітинного препарату, що дозволяє застосовувати його в будь-який потрібний для лікування момент.

    Таким чином, дослідження здійсненності та ефективності застосування кріоконсервованих ММСК (КрММСК) при дегенеративно-дистрофічних ушкодженнях хрящової тканини МПД in vivo є актуальними.

    Матеріал і методи

    Метою роботи була експериментальна оцінка репаративного потенціалу алогенних КрММСК кісткового мозку при дегенеративно-дистрофічні пошкодження хрящової тканини МПД.

    ММСК виділяли з резектованих фрагментів стегнової кістки щурів (n = 7, масою 100-150 г) шляхом вимивання кісткового мозку розчином Хенкса з наступним пропусканням через голки зменшується діаметра. Отриману суспензію центрифугували при 1500 об / хв (834 g) протягом 5 хв., Осад ресуспендували і висівали з густиною 103 кл / см2. Культивування клітин проводили за методом, що забезпечує адгезію стромальной фракції до культуральному пластику з подальшим видаленням фракції неадгезіро-вавших клітин. Клітини культивували в живильному середовищі IMDM (Sigma, США), що містить 10% ембріональної сироватки (ЕС) великої рогатої худоби (HyClone, США), гентаміцин (150 мкг / мл; Фармак, Україна) і амфотерицин Б (10 мкг / мл; Sigma , США). У роботі були використані стандартні умови культивування (37 ° С, 5% СО2, 95% вологості) в СО2-інкубаторі (Sanyo, Японія). Зміну живильного середовища проводили кожні

    3-и добу. Клітини культивували протягом 14 діб. до досягнення 75% конфлюентних моношару, після

    чого їх використовували у вигляді суспензії нативних ММСК.

    Для кріоконсервування суспензії ММСК використовували ростові середу з додаванням кріопротектори ДМСО (ПанЕко, Росія) і ЕС в кінцевих концентраціях 10% і 20% відповідно. Кріоконсервування проводили по 2-етапної програмі (1 ° С / хв до -80 ° С з наступним зануренням у рідкий азот) [6]. Зразки зберігали в умовах низькотемпературного банку не менше 3 міс. Розморожування суспензій ММСК проводили на водяній бані (37 ° С) до досягнення рідкої фази з наступним видаленням кріопротектори шляхом повільного додавання до суспензії клітин розчину Хенкса 1: 9 (РАА, Австрія) і центрифугування. Цілісність мембран КрММСК визначали з використанням тесту на включення трипанового синього (Sigma-Aldrich, США). Для визначення проліферативного потенціалу клітини висівали на 6-ямкові планшети (РАА, Австрія) з щільністю 1х105 кл / лунку. Динаміку приросту клітин оцінювали кожні 2 доби. протягом 17 діб. [7]. Контролем для визначення впливу кріоконсервування на проліферативний потенціал і цілісність мембран ММСК були культури нативних клітин.

    Дослідження in vivo було виконано на 49 даху-сах-самцях масою 300-350 г. У всіх тварин моделювалася компрессионное дегенератівнодістрофіческіх пошкодження МПД шляхом формування лордозу хвостового відділу хребта і його фіксації в такому положенні протягом 60 діб. [8]. По досягненню зазначеного терміну дію компресії у всіх тварин припиняли. У тварин контрольної групи I (n = 7) загоєння проходило «мимовільно» - без будь-яких терапевтичних втручань. Тваринам контрольної групи II (n = 14) в область дефекту МПД СОУ | _У || вводили колагенову губку Gelaspon® (Ankerpharm, Німеччина) розміром 0,8х0,8х0,5 см, просочену 0,1 мл фізіологічного розчину. Тваринам експериментальних груп III (n = 7) і IV (n = 7) аналогічним способом в зону дефекту вводили по 0,5х10в алогенних нативних або КрММСК в 0,1 мл розчину Хенкса (РАА, Австрія) на коллагеновой губці, відповідно. У ряді випадків для візуалізації трансплантованих клітин in vivo їх попередньо мітили флуоресцентним барвником РКН-26 (Sigma-Aldrich, США). Фарбування клітин флюоресцентним барвником РКН-26 проводили згідно з інструкцією фірми виробника [9].

    Тварин виводили з експерименту на 30-е добу. після операції. Крім того, в експерименті використовували здорових тварин аналогічної маси і віку без моделювання пошкодження МПД (інтактні тварини), а також з модельованих пошкодженням (на терміні 60 діб.), Але без будь-яких терапевтичних впливів. Оцінку результатів проводили за допомогою рентгенологічного, гістоморфометріческого і люмінесцентного методів.

    Комп'ютерну томографію (КТ) проводили на рентгенівському спіральному комп'ютерному томографі General electric CT / e Dual (Німеччина) 3 тваринам з кожної групи, введеним в наркоз. Технічні параметри сканування - зрізи в сагітальній площині, товщина зрізу 0,1 мм; крок 1 мм, 120 кВ, 100 мАс. Комп'ютерну обробку отриманих з-

    Клітинна трансплантологія і тканинна інженерія Том VIII, № 2, 2013

    оригінальні дослідження

    31

    браженій проводили за допомогою програмного забезпечення eFilm (TM) Lite (TM) і Syngo fastView. Оцінювали щільність дорсальній частині ФК МПД Сом_уі в одиницях Хаунсфілда (HU).

    Для гістоморфометріческого дослідження екс-плантіровалі частина хребта на рівні З ^ і виготовляли целлоідіновие зрізи за стандартною методикою [10] з забарвленням оглядовими барвниками (гематоксиліном і еозином), використовували мікроскоп Carl Zeiss (Німеччина) з цифровою фотокамерою Canon EOS 30D. За допомогою морфометричної сітки і окуляр-мікрометра по раніше опублікованим методу [11] оцінювали висоту ФК і чисельну щільність клітин дорсальній частині ФК МПД Сом_уі, ступінь разволокненія і фрагментації колагенових волокон, наявність лінійних дефектів і ділянок зі зниженою чісленнойі щільністю і (або) відсутністю хондроцитов в ФК, цілісність кордону ФК / ПЯ. Висоту визначали по кінцевих елементів ФК на рівні найбільш наближених один до одного поверхонь тіл вище і нижче розташованих хребців. Чисельну щільність клітин визначали як середнє арифметичне вимірювань в зовнішньому, центральному та внутрішньому відділах дорсальній частині ФК шляхом підрахунку кількості ядер на одиниці площі зрізу (0,102 мм 2) з подальшим перерахуванням на 1 мм 2. При визначенні ступеня разволокненія і фрагментації колагенових волокон, поширеності лінійних дефектів, ділянок зі зниженою щільністю і (або) відсутністю хондро-цитов оцінювалася питома площа, яку займає патологічним елементом.

    Детекцию трансплантованих клітин проводили в кріостатних зрізах МПД З ^^ товщиною 7 мкм за допомогою люмінесцентного мікроскопа (LOMO МИКМЕД-2, Росія). Гасіння аутолюмінесценціі проводили шляхом 30-хвилинної інкубації зразків з 0,3 М розчином гліцину (Merck, Німеччина). за-

    лучанин результати фіксували фотографуванням.

    Всі маніпуляції з тваринами здійснювали відповідно до міжнародних вимог гуманного поводження з лабораторними тваринами [12].

    Сатиричну обробку отриманих даних проводили за допомогою комп'ютерних програм Statistica 8.0, Microsoft Excel з використанням непараметричних критеріїв. Результати представлені у вигляді середніх арифметичних і стандартних помилок середніх (M ± m), критичне значення рівня значущості приймалося рівним 0,05.

    результати

    Життєздатність ММСК після кріоконсервування становила 82,1 ± 5,2%, в контролі 98,4 ± 3,2% клітин мали неушкоджену мембрану. При дослідженні ростових характеристик КрММСК на початкових етапах культивування спостерігали зниження здатності клітин до адгезії і подальшої проліферації в порівнянні з неконсервованих зразками. Через 5 діб. культивування кількість клітин in vitro в порівнянні з контролем було менше на 30,5 ± 6,2%. На 17-у добу. в культурах КрММСК приріст клітин стабілізувався, проте був меншим на 23,2 ± 5,1%, ніж у контролі.

    При дослідженні гістологічних препаратів МПД CVI-VII інтактних тварин патологічних змін виявлено не було. ФК складалося з радіальних пластин колагенових волокон, уздовж яких розташовувалися хондроцити (рис. 1А). Останні являли собою фібробластоподібних витягнуті клітини з щільними овоіднимі ядрами (рис. 2А).

    Гістологічна картина МПД тварин контрольних груп I і II (див. Ріс.1в і Г) істотно не відрізнялася від вихідного стану МПД при змодельованому пошкодженні (див. Рис.1б).

    Мал. 1. Міжхребцевий диск щури: А - інтактні тварини; Б - модельна група (тварини на 60-е добу. Моделювання компресії); В - контрольна група I (без терапевтичних втручань); Г - контрольна група II (введення колагенової губки з фізіологічним розчином); Д - експериментальна група III (введення нативних ММСК на носії); Е - група IV (введення крММСК на носії): 1 - лінійні дефекти; 2 - розшарування колагенових фолокон; 3 - ацелюлярні ділянки фіброзного кільця; 4 - фрагментовані колагенові волокна.

    Забарвлення: гематоксилін, еозин.

    Ув .: А, В, Г х125; Б, Д, Е х100

    Клітинна трансплантологія і тканинна інженерія Том VIII, № 2, 2013

    32

    оригінальні дослідження

    Мал. 2. Фіброзне кільце міжхребцевого диска щури: А - інтактні тварини; Б - модельна група (тварини на 60-е добу. Моделювання компресії); В - контрольна група I (без терапевтичних втручань);

    Г - контрольна група II (введення колагенової губки з фізіологічним розчином); Д - експериментальна група III (введення нативних ММСК на носії); Е - група IV (введення крММСК на носії);

    1 - лінійні дефекти; 2 - розшарування колагенових фолокон; 3 - ацелюлярні ділянки фіброзного кільця;

    4 - фрагментовані колагенові волокна.

    Забарвлення: гематоксилін, еозин. Ув .: А-В, Е х200; Г х240; Д х300

    У структурі МПД CoVI-VII визначалися ознаки дегенеративно-дистрофічного пошкодження хрящової тканини у вигляді разволокненія, розшарування і фрагментації колагенових волокон, зниження щільності хондроцитов, нечіткості контурів кордону між ФК і ПЯ, освіти центральних лінійних дефектів, оточених ацелюлярним ділянками ФК. Гетероморфними хондроцити розташовувалися поодинці або утворювали ізогенні групи. У безпосередній близькості до лінійним дефектів ФК поряд з характерними для цього типу хрящової тканини клітинами зустрічалися великі хон-дроціти зі сферичними ядрами, оточеними широким обідком цитоплазми (див. Рис. 2В і Г). Така «трансформація» хондроцитов на тлі різкого зниження чисельної щільності клітин свідчить про напруженість відновних процесів на даній ділянці ФК [13].

    При мікроскопічному дослідженні гістологічних препаратів МПД Сом_от тварин III групи на 30-е добу. після введення нативних ММСК визначалося часткове відновлення його структури (див. рис. 1Д). Спостерігалася репарація лінійних дефектів, фрагментація пучків колагенових волокон, ставала більш чіткої межа між ФК і ПЯ. При цьому фібробластоподібних клітини з щільними овоіднимі ядрами розташовувалися не тільки по ходу колагенових волокон, а й густо пронизували їх товщу, що свідчило про високу інтенсивність репаративних процесів (див. Рис. 2Д).

    Застосування суспензії КрММСК так само сприяло репаративної хондрогенез в МПД З ^ _ VII, але ефект був менш виражений при порівнянні з використанням нативних ММСК. На 30-у добу. відзначалася тенденція до нормалізації гістологічної будови ФК МПД Сом_от (див. рис. 1Е): зниження ступеня разволокненія колагенових волокон, значне скорочення площі, займаної лінійними дефектами, поліпшення контурів кордону між ФК і ПЯ. Клітинна популяція ФК, так само як і в разі застосування нативних

    ММСК, була представлена ​​невеликими фібробластоподібних клітини з овоіднимі ядрами і вузьким обідком цитоплазми. При цьому клітини розташовувалися переважно вздовж колагенових волокон, лише в окремих ділянках пронизуючи їх товщу (див. Рис. 2 Е).

    Для об'єктивної оцінки виявлених якісних змін були проведені кількісні вимірювання висоти, чисельної щільності хондроцитов і денситометричної щільності хрящової тканини дорсальної частини ФК МПД Сом_от, результати яких представлені в таблиці.

    Згідно з отриманими даними, на тлі терапії КрММСК висота дорсальній частині ФК МПД З ^ _ VII збільшувалася на 12,5 ± 3,3%, чисельна щільність хондроцитов - на 26 ± 2,9%, а денситометричний показник хрящової тканини - на 64 ± 5 , 7% щодо модельних значень. Введення ж нативних ММСК супроводжувалося збільшенням чисельної щільності клітин хрящової тканини диска в 3,5 рази, висоти ФК МПД Сом_от на 25 ± 4,1%, а денситометричної щільності - на 91 ± 7,3%, при цьому в групах контролю тенденція до відновлення досліджуваних показників була відсутня зовсім (табл.).

    При люмінесцентної мікроскопії кріостатних зрізів МПД З ^ і тварин, яким були трансплантовані мічені РКН-26клеткі, на 30-е добу. спостерігалося світіння в червоному діапазоні спектра, яке було чітким у вигляді вкраплень і конгломератів і локализовалось в зовнішніх відділах ФК і по його краю. При цьому в разі застосування КрММСК визначалося меншу кількість Люми-несцірующіх елементів. Відмінність між нативной і кріоконсервованої популяціями клітин складалося також і в інтенсивності люмінесценції, яка була більш виражена в МПД тварин, які перенесли терапію нативними ММСК. При мікроскопічному дослідженні кріостатних зрізів МПД контрольних тварин з введенням фізіологічного розчину світіння не визначалася, що виключало аутолюмінесценцію.

    Клітинна трансплантологія і тканинна інженерія Том VIII, № 2, 2013

    оригінальні дослідження

    33

    Висота, чисельна щільність хондроцитов (ЧПХ) і рентгенологічна щільність хрящової тканини дорсальної частини ФК МПД Сот-ім на 30-е добу. дослідження

    Група Висота ФК, мм ЧПХ, 1 / мм2 КТ-щільність, HU

    І 1,13 ± 0,020 1121 ± 26,97 62 ± 15,7

    М 0,56 ± 0,047 395 ± 31,25 -180 ± 24,7

    I 0,55 ± 0,034 369 ± 30,21 -146 ± 37,9

    II 0,57 ± 0,032 400 ± 46,44 -214 ± 45,9

    III 0,7 ± 0,0320 * 1389 ± 39,40 ** -17 ± 11,9 **

    IV 0,63 ± 0,036 497 ± 36,62 ** -64 ± 12,5 **

    Примітка: І - інтактні тварини; М - модельна група (тварини на 60-е добу. Після моделювання пошкодження); ФК - фіброзне кільце; * - різниця статистично значуща при порівнянні з модельною групою; ** - різниця статистично значуща при порівнянні з модельною групою, контрольними групами I і II.

    Обговорення

    На сьогоднішній день з літературних джерел відомо, що в залежності від ступеня дегенеративних змін в МПД трансплантація ММСК може надавати стабілізуючу дію, зупиняючи прогресію патологічного процесу без індукції репаративного процесу [14]. Але слід зазначити, що в подібних дослідженнях введення ММСК здійснювалося у вигляді суспензії ін'єкційним способом, що, можливо, не дозволяло клітинам в повній мірі проявити свій терапевтичний потенціал [15].

    Наші дослідження in vivo показали, що локальне введення КрММСК справляє стимулювальний ефект на процеси регенерації в дегенеративно зміненої хрящової тканини МПД, якісно впливаючи на їх перебіг. Так, якщо в ФК тварин з природним ходом репаративного процесу і введенням фізіологічного розчину переважав «синтетичний компонент» регенерації, то в групах з трансплантацією ММСК - проліферативний. Найбільш виражений стимулюючий ефект введення КрММСК надавало на чисельну щільність хондроцитов і денситометричний показник хрящової тканини, в меншій мірі впливаючи на висоту ФК МПД СОУ | _уі. Це може бути обумовлено відсутністю прямої кореляції між досліджуваними показниками і вимагає подальшого вивчення на більш віддалених термінах спостереження.

    Репаративний ефект ММСК при дегенеративно-дистрофічні пошкодження хрящової тканини МПД, мабуть, як і в разі суглобового хряща, обумовлений як паракринной, так і мітотичної активністю трансплантованих клітин. ММСК в процесі культивування синтезують широкий спектр цитокінів та хемокінів, в тому числі і одні з найпотужніших антиапоптотических, анаболічних

    ЛІТЕРАТУРА:

    1. Boos N., Weissbach S., Rohrbach H. et al. Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in Basic Science. Spine 2002; 27: 2631-44.

    2. Hoy D., Brooks P., Blythc F. et al. The epidemiology of low back pain. Best Pract. Res. Clin. Rheumat. 2010 року; 24: 769-81.

    3. Hohaus C., Ganey T.M., Minkus Y. et al. Cell transplantation in lumbar spine disc degeneration disease. Eur. Spine J. 2008; 17: 492-503.

    4. Visage C.L., Kim S.W., Tateno K. et al. Interaction of human mesenchymal stem cells with disc cells: changes in extracellular matrix biosynthesis. Spine 2006; 31: 2036-42.

    і мітогенних стимуляторів хондрорепараціі - інсуліноподібний фактор росту-1 і трансформуючий фактор росту b [16, 17].

    Виживання трансплантованих ММСК і їх міграцію в пошкоджену хрящову тканину МПД наочно показують експерименти з використанням попередньо мічених флуоресцентним барвником РКН-26 клітин. Результати люмінесцентної мікроскопії узгоджуються з даними робіт з дослідження виживаності трансплантованих в МПД алогенних ММСК в межах терміну спостереження [14, 18]. Більш низька інтенсивність люмінесценції і меншу кількість світних елементів в разі введення кріоконсервованих клітин можуть бути пов'язані зі зниженням їх проліферативної активності після циклу заморожування-розморожування. Проте, за даними гістоморфометріческіх і КТ-досліджень КрММСК зберігають здатність стимулювати репаративний процес в дегенеративно зміненої хрящової тканини МПД.

    висновки

    Терапія алогенними КрММСК кісткового мозку справила стимулюючий ефект на репаративний хондрогенез в дегенеративно зміненому МПД. Після місцевого введення на тривимірному носії як нативні, так і крММСК виживають до 30 діб. в зоні трансплантації і частково мігрують в хрящову тканину диска. Однак отримані нами результати вказують на меншу вираженість позитивного ефекту КрММСК в порівнянні з нативними клітинами.

    Подяки

    Автори висловлюють подяку і зберігають пам'ять про ініціатора і натхненника цієї роботи акад. НАНУ Грищенко В.І.

    5. Richardson S., Walker R., Parker S. et al. Differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus cells using a novel co-culture technique. Euro. Cells Mat. 2005; 10 (II): 56.

    6. Mamidi M.K., Nathan K.G., Singh G. et al. Comparative

    cellular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells during continues passaging and after successive cryopreservation. J. Cell Biochem. 2012; 113:

    3153-64.

    7. Адамс Р. Методи культури клітин для біохіміків. М .: Світ; тисячу дев'ятсот вісімдесят три.

    Клітинна трансплантологія і тканинна інженерія Том VIII, № 2, 2013

    34

    оригінальні дослідження

    8. Pazzaglia U.E., Andrini L., Di Nucci A. The effects of mechanical forces on bones and joints. Experimental study on the rat tail. J. Bone Joint Surg. Br. 1997; 79: 1024-30.

    9. Wallace P.K., Muirhead K.A. Cell tracking 2007: Додати a proliferation of probes and applications. Immunol. Invest. 2007; 36: 527-61.

    10. Волкова О.В., Єлецький Ю.К. Основи гістології з гістологічної технікою. М .: Медицина; 1982.

    11. Автандилов Г.Г. Медична морфометрія. Керівництво. М .: Медицина; 1990.

    12. Council of Europe [France]. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Strasbourg, 18.III.1986, http: //conventions.coe. int / treaty / en / Treaties / Word / 123.doc.

    13. Ірьянов Ю.М., Силантьєва Т.А. Сучасні уявлення про гістологічних аспектах репаративної регенерації кісткової тканини [огляд літератури). Клітинні джерела репаративного остеогенезу. Гетерогенність клітинної популяції в області травматичного пошкодження кістки. Геній ортопедії 2007; 2: 111-16.

    14. Ho G., Leung V.Y.L., Cheung K.M. C. Effect of severity of intervertebral disc injury on mesenchymal stem cell-based regeneration. Connect. Tiss. Res. 2008; 49: 15-21.

    15. Michalek A.J., Buckley M.R., Bonassar L.J. et al. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine J. 2010 року; 10: 1098-105.

    16. Salazar K.D., Lankford S.M., Brody A.R. Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF- b1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2009 року; 297: L1002-11.

    17. Togel F., Hu Z., Weiss K. et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2005; 289: F31-42.

    18. Hiyama A., Mochida J., Iwashina T. Transplantation of mesenchymal stem cells in a canine disc degeneration model. J. Orthop. Res. 2008; 26 (5): 589-600.

    надійшла 21.05.13

    Клітинна трансплантологія і тканинна інженерія Том VIII, № 2, 2013


    Ключові слова: міжхребцевих дисків /Дегенеративно-дистрофічних ПОШКОДЖЕННЯ /хрящової тканини /Мультипотентні мезенхимной стромальні клітини /кріоконсервування /КЛІТИННА ТЕРАПІЯ /INTERVERTEBRAL DISK /DEGENERATIVE DAMAGE /CARTILAGINOUS TISSUE /MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS /CRYOPRESERVATION /CELL THERAPY

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити