розроблено систему внутрішнього контролю (ВК) проходження ПЛР на основі фрагмента гена миші, вбудованого в вектор. Створена система ВК дозволила вибрати метод виділення ДНК з біопріманок, що не інгібує процес ампліфікації при діагностиці Phytophthora sp. при діагностиці збудника кільцевої гнилі картоплі було показано, що розроблений ВК в режимі ПЛР «В реальному часі» виявився більш інформативним, ніж при використанні в якості ВК мітохондріального гена рослини-господаря.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Мазурін Євген Сергійович, Копина Марія Борисівна, Шероколава Наталія Олександрівна


Controlling the reliability of results received during laboratory testing for phytosanitary purposes when molecular diagnostic methods are used

An internal PCR control system based on a mouse gene fragment cloned into a vector was developed. The created internal control system allowed for choosing a method for DNA extraction from bio-baits which does not inhibit the amplification process when Phytophthora sp. is being diagnosed. During the process of diagnosing the pathogen of the ring rot of potato, it was shown that the developed internal control in real-time PCR turned out to be more informative than the mitochondrial gene of a host plant used for that purpose.


Область наук:
  • Біотехнології в медицині
  • Рік видавництва діє до: 2012
    Журнал: Вісник Російського університету дружби народів. Серія: Агрономія і тваринництво

    Наукова стаття на тему 'Контроль достовірності результатів фітосанітарної експертизи при використанні молекулярних методів діагностики'

    Текст наукової роботи на тему «Контроль достовірності результатів фітосанітарної експертизи при використанні молекулярних методів діагностики»

    ? ЗАХИСТ РОСЛИН

    до: онтроль достовірності результатів

    фітосанітарної експертизи при використанні молекулярних методів діагностики

    Е.С. Мазурін1, 2, М.Б. Копіна2, Н.А. Шероколава2

    'Кафедра генетики, рослинництва і захисту рослин Російський університет дружби народів вул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Росія, 117198

    2ФГБУ «Всеросійський центр карантину рослин» вул. Прикордонна, 32, сел. Биково, Раменський р-н, Московська обл ,. Росія, 140150

    Розроблено систему внутрішнього контролю (ВК) проходження ПЛР на основі фрагмента гена миші, вбудованого в вектор. Створена система ВК дозволила вибрати метод виділення ДНК з біопріманок, що не інгібує процес ампліфікації при діагностиці Phytophthora sp. При діагностиці збудника кільцевої гнилі картоплі було показано, що розроблений ВК в режимі ПЛР «в реальному часі» виявився більш інформативним, ніж при використанні в якості ВК мітохондріального гена рослини-господаря.

    Ключові слова: ПЛР, внутрішній контроль, діагностика, карантинні організми.

    Сучасні уявлення про систематики організмів, поліморфізм популяції конкретних видів нерозривно пов'язані з вивченням генома. Використання різних модифікацій молекулярно-генетичних методів дозволяє точно ідентифікувати шкідливі організми не тільки до роду або виду, але в окремих випадках навіть до раси. Найбільшого поширення в даний час отримала полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), різні модифікації якої є необхідною умовою для діагностики карантинних видів бактерій, вірусів і фітоплазми [5; 6].

    До головних достоїнств ПЛР відносяться висока чутливість і специфічність діагностики.

    Але при недотриманні правил організації лабораторії головне достоїнство ПЛР може бути, навпаки, істотним недоліком.

    Так, здатність ПЛР ампліфікувати всього кілька молекул ДНК в пробі дозволяє виявляти латентну інфекцію. Але в той же час ПЛР може давати хибнопозитивний результат з ДНК, що знаходиться не в зразку, а в приміщенні або на обладнанні.

    Проблеми такого роду вирішуються грамотною організацією приміщень, в яких проводиться ПЛР-аналіз, і системою негативних контролів, використовуваних при кожній постановці ПЛР.

    Іншою проблемою застосування молекулярних методів діагностики в фіто-санітарної карантинної експертизи є неоднорідність досліджуваного матеріалу.

    Найчастіше експертизу проходять різні частини рослин: корені, листя, стебла, насіння, а також чисті культури грибів, бактерій або екземпляри комах.

    Відомий той факт, що ПЛР блокується в присутності певних речовин: ферментів, ароматичних сполук, спиртів, фенолів.

    Кількість інгібіторів в рослинному матеріалі сильно залежить від пори року, сорти рослин і термінів доставки зразків на експертизу. Інгібітори ПЛР не дозволяють отримати позитивний результат навіть в присутності ДНК цільового організму. Такі результати прийнято називати помилково негативні.

    Вирішення цієї проблеми полягає в розробці позитивного внутрішнього контролю ПЛР, який показує вплив речовин, що містяться в зразку, на ефективність ампліфікації. Така реакція повинна проходити навіть в негативному контролі.

    В якості мішені для позитивного внутрішнього контролю (ВК) найчастіше використовують ген цитохромоксидази [11; 13] і рибосомні гени 18Б гККА [10: 13] рослин-господарів, в яких діагностується шкідливий організм.

    Як ВК при діагностиці галових нематод [7] було запропоновано використовувати плазміду, яка несе ген зеленого флуоресцентного білка ОБР [9]. До ОБР плазмиде були підібрані праймери і зонд, що дозволяють проводити мультиплексную діагностику двох видів галових нематод з використанням внутрішнього позитивного контролю.

    На вітчизняному ринку є набори для діагностики ряду фітопато-генів методом Р ^ Ь-РСЯ. До складу цих наборів входить система ВК в кожній пробірці. Внутрішній контроль складається з плазмідної вектора і зонда. Вектор містить вставку, що відрізняється від специфічного фрагмента, але має на кінцях ділянки, компліментарні специфічним праймерів [4].

    Використання в якості позитивного внутрішнього контролю генів рослин-господарів дає нестабільні результати, так як варіює концентрація мішені. Технології, які використовуються в діагностичних наборах, є комерційною таємницею. Тому основною метою нашої роботи була розробка власної системи внутрішнього позитивного контролю і перевірка достовірності проведення діагностики карантинних організмів методом класичної ПЛР і ПЛР «в реальному часі».

    Матеріали та методи. Для розробки ВК було вибрано дві мішені. Одна з них була в геномі бактерій, інша в геномі миші. У випадку з використанням бактеріальної ДНК праймери були специфічні до гену 16Б гККА більшості бактерій [2]. Додавати саму мішень для ВК не було потрібно, так як ДНК бактерій присутня навіть в автоклавуватися воді [3].

    Даний ВК контроль був використаний при діагностиці збудника опіку плодових культур з комерційним набором (Loewe, Німеччина).

    Для розробки внутрішнього контролю з ДНК миші був використаний фрагмент гена 1700042G15Rik (www.ncbi.nlm.nih.gov) некодирующей РНК. Послідовність цього гена сильно відрізнялася від послідовності карантинних шкідливих організмів.

    Підбір праймерів і зондів проводили за допомогою програми Primer 3 і Primer Express v.3.0. Отриманий продукт ампліфікації був очищений за допомогою колонок (Fermentas, США) і клонований за стандартною методикою.

    Отриманий амплікон лігували в вектор pTZ57R / T (Fermentas, США) і клонували в клітинах Escherichia coli (штам DH10Р).

    Біло-блакитну селекцію клонів проводили на середовищі LB з додаванням Х-GAL, IPTG та ампіциліну згідно з інструкцією виробника (Fermentas, США). Виросли білі колонії перевіряли на наявність вставки методом ПЛР і секвеніруют-ням з використанням праймерів M13pUC і М13pUC5 (Fermentas, США).

    Після отримання плазмід з вставкою підбирали їх оптимальну концентрацію в класичній ПЛР при детекції вірусу шарки сливи з праймерами Р2 / Р1 за стандартною методикою [5].

    Умови ампліфікації були оптимальні для діагностики вірусу шарки сливи.

    Концентрацію ДНК вимірювали на спектрофотометрі NanoDrop 2000. Для постановки ПЛР «в реальному часі» з одночасним проходженням ВК до вставки були підібрані праймери і зонд, мічений барвником R6G (Синтол, Москва).

    Виділення ДНК проводили з листя малини - біопріманок, заражених Phytophthora cactorum за методикою С.Є. Головіна [1]. ДНК виділяли різними способами: з використанням наборів Проба-ГС (ДНК-Технологія, Москва), ДНК-екстра- (Синтол, Москва), сорбіт-ГМО-А (Синтол, Москва), сорбіт-С (Синтол, Москва), з використанням методики ChL + СТАВ (http://pcr-rus.narod.org.ua/ protocols.html), LiCl 8М + СТАВ з додаванням 100 мкл LiCl після етапу інкубації, 2хChL + СТАВ з додаванням хлороформу на 50% більше після етапу інкубації, з використанням методики до набору «Loewe» Phytophthora fragaria [8] і згідно з інструкцією виробника до набору «Loewe» Phytoplasma. ПЛР проводили спільно з праймерами Yph1F_Yph2R [12], амплифицируют продукт розміром 370 п.о. всіх видів Phytophthora sp.

    Умови ампліфікації були оптимальні для діагностики Phytophthora sp.

    Для клонованого фрагмента гена 1700042G15Rik підбирали праймери і пробу, мічену з 5'-кінця джерелом флуоресценції R6G і з -кінця - гасителем RTQ2 (Синтол, Москва).

    Розроблений нами ВК був використаний при діагностиці кільцевої гнилі за методикою W. Schaad (1999) [11] в зразках картоплі, що проходить фітосані-тарну експертизу.

    Для порівняння був використаний ВК до гену цитохромоксидази картоплі (COX), запропонований авторами [11].

    ПЛР «в реальному часі» проводили на ампліфікаторі iCycler IQ 5 (BioRad, США).

    Оптимізовано концентрації праймерів, проби і плазміди таким чином, щоб за звичайних умов ампліфікації (без інгібування) значення порогового циклу (Ct) було в межах 25-26 циклів.

    Результати та обговорення. В результаті проведеної роботи була оптимізована методика проведення ПЛР при діагностиці Erwinia amylovora методом класичної ПЛР з ВК до гену 16S rRNA більшості бактерій.

    У серії проведених експериментів було показано, що праймери, які використовуються в роботі, приводили до невідтворюваних результатів. В окремих реакціях ВК ампліфікувати дуже слабо, в інших випадках занадто сильно. Це залежало від виду рослини, сорту і якості пробоподготовки, що, в кінцевому рахунку, впливало на кількість бактеріальної ДНК в екстракті. Використання ВК до гену 16S rRNA більшості бактерій виявився непридатним для діагностики збудника опіку плодових культур.

    Для розробки ВК з використанням гена миші були сконструйовані 4 пари праймерів, з яких пара Mus 714F_ Mus 714R була визнана найбільш підходящою. Для цієї пари праймерів була визначена оптимальна температура відпалу (рис. 1).

    1 234 56 789 10 11 12 M

    Мал. 1. Електрофореграма продуктів ампліфікації фрагмента ДНК гена 1700042G15Rik миші з праймерами Mus 714F_ Mus 714R (розмір продукту 714 п.о.) при різній температурі відпалу:

    доріжка № 1 - 47,8 ° С; доріжка № 2 - 48,3 ° С; доріжка № 3 - 49,5 ° С; доріжка № 4 - 51,4 ° С; доріжка № 5 - 53,7 ° С; доріжка № 6 - 56,4 ° С; доріжка № 7 - 59,1 ° С; доріжка № 8 - 61,7 ° С; доріжка № 9 - 64,1 ° С; доріжка № 10 - 66,1 ° С; доріжка № 11 - 67,4 ° С; доріжка № 12 - 68,0 ° С

    Як видно з рис. 1, температура відпалу в межах 53,7-64,1 ° С дозволяла ампліфікувати продукт ПЛР хорошої якості розміром 714 п.о. Зазначений вище інтервал температур відпалу праймерів відповідає широкому колу програм ампліфікації для різних карантинних об'єктів.

    Можна припустити, що розроблений ВК буде універсальним для діагностики методом класичної ПЛР багатьох об'єктів при проведенні оптимізації параметрів ампліфікації в кожному конкретному випадку.

    Оптимізація концентрації отриманої плазміди при детекції вірусу куля-ки сливи представлені на рис. 2. Було показано, що плазміди в концентрації 0,1 нг / реакцію було досить для ампліфікації ВК, і вона не заважала проведенню специфічної ампліфікації з геном білка оболонки (СР) вірусу шарки сливи. Кінцева концентрація кожного з праймерів для ВК при цьому становила 0,4 мкМ.

    1 234М56 78 9

    Мал. 2. Електрофореграма продуктів ампліфікації гена білка оболонки (СР) вірусу шарки сливи (243 п.о.) і гена 1700042015І1< миші (714 п.о.) при різній концентрації плазміди:

    доріжка № 1 - 100 нг; доріжка № 2 - 50 нг; доріжка № 3 - 20 нг; доріжка № 4 - 10 нг; доріжка № 5 - 5 нг; доріжка № 6 - 1,0 нг; доріжка № 7 - 0,5 нг; доріжка № 8 - 0,1 нг; доріжка № 9 - 0 нг

    Результати класичної ПЛР з виділенням ДНК різними способами із заражених біопріманок представлені на рис. 3.

    Як видно з рис. 3, в більшості зразків спостерігалося пригнічення ПЛР.

    Незважаючи на те, що все біопріманкі були заражені Ph. cactorum, штаби розміром 370 п.о. були відсутні при виділенні ДНК деякими способами.

    Ампліфікації ВК також не спостерігалося, що свідчить про наявність ін-гібірованія і отриманні помилково негативні результати в доріжках № 1-14.

    Виділення ДНК з використанням протоколів до набору «Loewe» Phyto-phthora fragariae і до набору «Loewe» Phytoplasma дозволили отримати достовірні дані про зараження біопріманок фітофторозом.

    Використання ВК є необхідною умовою при проведенні експертизи біопріманок.

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 М 10 11 12 13 14 М 15 16 17 1819 20

    Мал. 3. Електрофореграма продуктів ампліфікації з праймерами Yph1F_Yph2R (370 п.о.) і Вк при різних методах виділення ДНК з біопріманок:

    доріжки 1, 2 - ChL + CTAB; 3, 4 - LiCl 8М + СТАВ; 5, 6 - 2хСІ1_ + СТАВ; 7, 8 - «ДНК-екстра-»;

    9, 10 - «Проба ГС»; 11, 12 - «сорбіт-ГМО-А»; 13, 14 - «сорбіт-С»; 15, 16 - «Loewe» Phytophthora fragariae;

    17, 18 - «Loewe» Phytoplasma; 19 - вода; 20 - позитивний контроль

    Для виключення помилково негативні результати при проведенні ПЛР «в реальному часі» проводили порівняння роботи двох систем ВК при діагностиці збудника кільцевої гнилі картоплі. Результати даної роботи представлені в табл.1.

    Таблиця 1

    Контроль ефективності ПЛР «в реальному часі» при діагностиці збудника кільцевої гнилі картоплі з використанням двох систем ВК

    Шифр зразка Значення порогових циклів (Ct)

    ВК COX [11] ВК до гену миші

    511 N / A * N / A

    513 N / A N / A

    516 N / A N / A

    518 N / A N / A

    523 N / A N / A

    735 22,4 25,8

    736 24,9 26,2

    737 26,1 25,6

    738 24,1 26,2

    744 23,5 26,1

    здоровий екстракт картоплі 21,5 26,6

    заражений екстракт картоплі 25,6 26,4

    Коефіцієнт варіації,% ** 10,1 0,37

    Примітки: * N / A - відсутність сигналу флуоресценції на 40-му циклі ампліфікації. "" 'Статистична обробка проведена для варіантів, в яких не спостерігалося пригнічення ампліфікації.

    Як видно з табл. 1, в зразках 511, 513, 516, 518, 523 спостерігалося інгібі-вання ПЛР, що підтверджувалося даними при використанні двох систем ВК. В інших зразках інгібування ПЛР відсутнє.

    При використанні ВК СОХ можна було спостерігати варіювання Ct в межах 22-26 циклів, тоді як при використанні гена миші варіювання спостерігалося в межах 25-26 циклів. При порівнянні коефіцієнтів варіації видно, що більш відтворювані результати були отримані при використанні гена миші в якості ВК.

    Отримані дані дозволяють припустити, що розроблена система ВК може виявляти незначне пригнічення в зразках, що також важливо при проведенні фітосанітарної експертизи.

    Висновки. Розроблена нами система ВК з штучно внесеним вектором, що містить ген миші, дозволила виключати помилково негативні результати в класичній ПЛР і ПЛР «в реальному часі». Випробування розробленого ВК в ПЛР «в реальному часі» дозволило отримати більш однорідні результати, які, в свою чергу, можуть дозволити виявляти навіть незначний вплив побічних продуктів виділення ДНК на ефективність ампліфікації.

    ЛІТЕРАТУРА

    [1] Головін С.Є. Методичні вказівки з діагностики та обліку хвороб коренів і стебел суниці та малини, що передаються через грунт. - M .: ВСТІСП, 2001..

    [2] Джалилов Ф.С., Мазурін Е.С., Ігнатов О.М. Удосконалення методики діагностики зараженості насіння капусти збудником судинного бактеріозу. - Збірник праць міжнародної науково-практичної конференції «Агротехнології XXI століття». - М .: РГАУ-МСХА їм. К.А. Тімірязєва, 2007. - С. 73-75.

    [3] Мазурін Е.С. Методи діагностики збудника судинного бактеріозу капусти і заходи захисту: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - М., 2009.

    [4] Рязанцев Д.Ю., Абрамов Д.Д., Дробязіна П.Є. та ін. Діагностика ряду фітопатогенів методом полімеразної ланцюгової реакції з флуоресцентною детекцією результатів за допомогою діагностичних наборів виробництва ТОВ «АгроДіагностіка». Методичні вказівки. - М., 2009.

    [5] Diagnostic protocols for regulated pest. Plum Pox potyvirus // Bulletin OEPP / EPPO. - 2004. - Vol. 34. - P. 247-256.

    [6] Diagnostic protocol for Pantoea stewartii subsp. stewartii // Bulletin OEPP / EPPO. - 2006. - Vol. 36. - P. 111-115.

    [7] Diagnostic protocol for Meloidogyne chitwoodi and Meloidogyne falla // Bulletin OEPP / EPPO. - 2009. - PM 7/41 (2). - Vol. 39. - P. 5-17.

    [8] Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. Life technolog. inc. - 1990. - V. 12. - P. 13-15.

    [9] Klerks M.M., Zijlstra C., van Bruggen A.H.C. Comparison of real-time PCR methods for detection of Salmonella entenca and Escherichia coli 0157: H7 and quantification using a general internal amplification control // Journal of Microbiological Methods. - 2004. - Vol. 59. - P. 337-349.

    [10] Pastrik K.H., Elphinstone J.G., Pukall R. Sequence analysis and detection of Ralstonia sola-nacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control // European Journal of Plant Pathology. - 2002. - Vol. 108. - P. 831-842.

    [11] Schaad W., Berthier-Schaad Y., Sechler A., ​​Knorr D. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system // Plant Disease. - 1999. - Vol. 83. - P. 1095-1100.

    [12] Schena L., Duncan J.M., Cooke D.E.L. Development and application of a PCR-based "molecular tool box" for the identification of Phytophthora species damaging forests and natural ecosystems // Plant Pathol. - 2007. - Vol. 57. - P. 64.

    [13] Weller S.A., Elphinstone J.G., Smith N.C., Boonham N., Stead D.E. Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - P. 2853-2858.

    BecTHHK Py ^ H, cepua Агрономін u ^ ueomHoeodcmeo, 2012, № 3

    controlling the reliability of results received during laboratory testing for phytosanitary purposes when molecular diagnostic methods are used

    E.S. Mazurin1, 2, M.B. Kopina2,

    2

    N.A. Sherokolava

    department of genetics, crop production and plant protection Peoples 'Friendship University of Russia

    Miklucho-Maklay str., 8/2, Moscow, Russia, 117198

    2All-Russian Plant Quarantine Center

    Pogranichnaya, 32, Bykovo, Ramenskoe, Moscow region, 140150, Russia

    An internal PCR control system based on a mouse gene fragment cloned into a vector was developed. The created internal control system allowed for choosing a method for DNA extraction from bio-baits which does not inhibit the amplification process when Phytophthora sp. is being diagnosed. During the process of diagnosing the pathogen of the ring rot of potato, it was shown that the developed internal control in realtime PCR turned out to be more informative than the mitochondrial gene of a host plant used for that purpose.

    Key words: PCR, internal control, diagnostics, quarantine organisms.


    Ключові слова: ПЛР / ВНУТРІШНІЙ КОНТРОЛЬ / ДІАГНОСТИКА / Карантинні організми / PCR / INTERNAL CONTROL / DIAGNOSTICS / QUARANTINE ORGANISMS

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити