Сконструйований новий дифтерійний антигенний препарат на основі полімерних мікросфер зі стабільними біохімічними властивостями. Препарат отриманий в лиофилизированном вигляді, термін зберігання становить 3 роки. Постановка реакції агломерації об'ємної (РАО) із застосуванням отриманого диагностикума проводиться мікрометодом в планшетах для імунологічних реакцій вітчизняного виробництва. результати серологічної реакції чіткі, стабільні, демонстративні, легко що враховуються за рахунок яскравого забарвлення препарату. Облік проводиться через 1,5-2 ч. Для оцінки іммунологічекого статусу проведено порівняльний аналіз сироваток крові вакцинованих осіб різних вікових груп з використанням двох серологічних методів (РНГА і РАО). Показана можливість використання розробленого полімерного дифтерійного антигенного препарату в системі установ санітарно-епідемічної служби.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Симонова І. Р., Безуглова Е. В., Терентьєв О. М., Наркевич А. Н., Кочеткова А. П.


Construction of a Polymer Antigenic Diagnostic Preparation and the Possibility of its Adaptation to the Assessment of Antitoxic Diphtheria Immunity

A new diphtheria antigenic preparation was constructed on the basis of polymer microspheres with stable biochemical characteristics. The preparation is produced as a lyophilized form with 3-years shelf life. The voluminous agglomeration reaction (VAR) was carried out with the diagnostic preparation using the principle of micro-technique on the home-made immunologic test worksheets. The results of serologic analyses were clear-cut, stable, demonstrative, easily seen due to the bright coloring of the preparation. They were registered in an hour and a half or in two hours. To assess the immunologic status, a comparative analysis of the blood sera was made for vaccinated persons of different age groups using two serologic test procedures (IHA and VAR). The constructed diphtheria antigenic polymer preparation is presented as a promising drug to be used in the system of sanitary-epidemiologic facilities.


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2007


    Журнал: Проблеми особливо небезпечних інфекцій


    Наукова стаття на тему 'Конструювання полімерного антигенного діагностичного препарату і можливість його застосування для оцінки дифтерійного антитоксичну імунітету'

    Текст наукової роботи на тему «Конструювання полімерного антигенного діагностичного препарату і можливість його застосування для оцінки дифтерійного антитоксичну імунітету»

    ?УДК 613.931: 616-097

    І.Р.Сімонова, Е.В.Безуглова, А.Н.Терентьев, А.Н.Наркевіч, А.П.Кочеткова, С.З.Валіева

    КОНСТРУЮВАННЯ ПОЛІМЕРНОЇ антигенів ДІАГНОСТИЧНОГО ПРЕПАРАТУ ТА МОЖЛИВІСТЬ ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ОЦІНКИ ДИФТЕРІЙНОГО антитоксичну імунітету

    Ростовський-на-Дону науково-дослідний протичумний інститут

    Сконструйований новий дифтерійний антигенний препарат на основі полімерних мікросфер зі стабільними біохімічними властивостями. Препарат отриманий в лиофилизированном вигляді, термін зберігання становить 3 роки. Постановка реакції агломерації об'ємної (РАО) із застосуванням отриманого диагностикума проводиться мікрометодом в планшетах для імунологічних реакцій вітчизняного виробництва. Результати серологічної реакції чіткі, стабільні, демонстративні, легко що враховуються за рахунок яскравого забарвлення препарату. Облік проводиться через 1,5-2 ч. Для оцінки іммунологічекого статусу проведено порівняльний аналіз сироваток крові вакцинованих осіб різних вікових груп з використанням двох серологічних методів (РНГА і РАО). Показана можливість використання розробленого полімерного дифтерійного антигенного препарату в системі установ санітарно-епідемічної служби.

    Ключові слова: дифтерія, анатоксин, полімерні мікросфери, серологічні реакції.

    Епідемічна обстановка в Росії по дифтерії (в 90-ті роки) супроводжувалася високими темпами зростання захворюваності (з 1990 по 1995 рік у 13 разів), загальною інфікованістю токсигенними бактеріями (47,5 на 100 тис. Населення), високою смертністю [1, 5 ].

    Токсичні форми перебігу інфекції, високі показники летальності, відмічені у дітей до

    2 років і дорослих старше 40, які не щеплені від дифтерії, зумовили необхідність проведення повної вакцинації населення. З 1995 р імунізація населення набула масового характеру, різко зросли обсяги лабораторно-діагностичних досліджень [2, 3, 7].

    До теперішнього часу основним методом оцінки поствакцинального імунітету (визначення рівня антитоксичних антитіл) залишається реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з використанням антигенного еритроцитарного диагностикума, в значно меншій мірі - імуно-ферментний метод, що пов'язано з дорогим апаратурним оснащенням і реагентами для ІФА [4] . Комерційний еритроцитарний препарат випускається в рідкому вигляді з терміном зберігання протягом 1 року. Нестабільність і нестандартні властивості еритроцитарного (біологічного) носія є підставою для розробки стабільного, демонстративного препарату, що застосовується в прискореному, простому в постановці методі, що дозволяє виконувати масові діагностичні дослідження в короткі терміни з високим ступенем відтворюваності результатів [8, 9].

    З огляду на, що зберігається напружену обстановку по дифтерії в Росії, нами розроблений дифтерійний антигенний діагностичний препарат на основі носія зі стандартними властивостями для серологічного обстеження і визначення рівня антитоксичних антитіл в сироватках крові хворих і контролю вакцинації населення.

    матеріали та методи

    Методом дисперсійного полімеризації акролеина отримані і використані для конструірова-

    ня діагностичного препарату частки сферичної форми (ПА-мікросфери) діаметром (2 ± 0,5) мкм, забарвлені в бузково-рожевий колір з реакційними альдегідними групами на поверхні для ковалентного приєднання імуноглобулінів або антитіл [6].

    У технології отримання дифтерійного полімерного диагностикума в якості антигену застосовували комерційний очищений концентрований дифтерійний анатоксин з концентрацією 320 Ь17ш1 (1,1 мг білка в 1 мл), виробництво НВО «Біомед» ім. І.І.Мечникова. Сенсибилизирующей дозу анатоксину розраховували на сухий носій. Використовували наступні сенсибилизирующие дози: 96,0 Lf (0,3 мг / мл), 192,0 Lf (0,65 мг / мл),

    384,0 Lf (1,3 мг / мл), 768,0 Lf (2,6 мг / мл).

    Для іммобілізації анатоксину на сферичних мікрочастинках використовували буферні розчини різних значень pH середовища (від 7,0 до 9,3.)

    Іммобілізацію дифтерійного анатоксину проводили наступним чином: 100 мг носія (1 мл суспензії мікросфер) поміщали в центріфужний стакан і двічі відмивали 0,1 М карбонатних буфером по 10 мл pH 9,2 + 0,1 при (3000 + 100) об / хв в протягом (10 + 2) хв. Відмитий носій суспендованих в 1,5 мл 0,1 М карбонатного розчину, до суспензії додавали 1,5 мл вказаного буферного розчину, що містить 384 Lf (1,3 мг / мл) дифтерійного анатоксину і, перемішуючи, залишали для контакту протягом 2 ч при температурі (20 + 2) ° С.

    Після 16-18-годинного контакту при температурі (7 + 2) ° С до суспензії додавали 2 мл 1,0% розчину желатози на 0,9% розчині хлориду натрію і залишали при постійному перемішуванні протягом 2 годин при температурі (20 + 2 ) ° С. Після цього суспензію диагностикума центрифугировали і тричі відмивали 0,9% розчином хлориду натрію при (3000 + 100) об / хв протягом (5 + 2) хв. Відмитий осад суспендують в 8 мл 0,1% розчину желатози на 0,9% розчині хлориду натрію і визначали активність і специфічність отриманого рідкого препарату.

    Для ліофілізації диагностикума застосовували

    3% желатозу-сахарозний середу висушування.

    Активність і специфічність препарату оцінювали в реакції агломерації об'ємної (РАО) мікрометодом в планшетах для імунологічних реакцій (виробництво «Медполимер», Санкт-Петербург) в обсязі 50 мкл 1% розчину нормальної кролячої сироватки (НКР).

    Як «позитивного» контролю використовували комерційну противодифтерийную сироватку (виробництво АТВТ «Біомед» ім. І.І.Меч-ників, сер. 54), починаючи з розведення 1: 100 (0,1 МО / мл), і антитоксин дифтерійний очищений ферментолиз і специфічної сорбції (виробництво НВО «Біомед», Перм, сер. 42), починаючи з розведення 1: 1000 (0,5 МО / мл).

    Як «негативного» контролю використовували негативні сироватки людини і гетероло-гічної кінські сироватки, починаючи з розведенні 1:20.

    Сироватки досліджували в кількості 50 мкл методом 2-кратного послідовного титрування, починаючи з розведенні 1:10 (з попередніми прогріванням при 56 ° С 30 хв). Потім в кожну лунку додавали по 25 мкл суспензії диагностикума в робочому розведенні. Після додавання диагностикума вміст лунок перемішували погойдуванням планшета і залишали при температурі (20 + 2) ° С на

    1,5-2 ч. Для контролю диагностикума на відсутність спонтанної агломерації в 2-3 лунки вносили тільки НКР і диагностикум без досліджуваної сироватки.

    Облік реакції виробляли наступним чином: за позитивний результат брали кольоровий яскраво-рожевий агломерат, що вистилає всі дно лунки з чітко окресленими краями. У разі негативного результату диагностикум випадав в вигляді колечка або точкового осаду в центрі лунки.

    У роботі використовували комерційний еритро- цітарная дифтерійний антигенний диагностикум, рідкий, сер. 75, 89.

    Результати та обговорення

    Іммобілізацію дифтерійного анатоксину на частинках носія здійснювали в діапазоні pH від

    7,0 до 9,3 при використанні буферних розчинів різної молярности. Оптимальне значення pH дорівнювала 9,0-9,2 карбонатного буферного розчину з концентрацією 0,1 моль / л.

    При використанні різних сенсибилизирующих доз оптимальної виявилася доза, рівна 384 Lf (1,3 мг / мл) дифтерійного анатоксину на 100 мг носія. Встановлено, що при сенсибилизирующих дозах від 384 Lf (1,3 мг / мл) до 768 Lf (2, б мг / мл) на 100 мг носія активність диагно-стікума змінювалася незначно (малюнок).

    В якості реагенту, що блокує вільні альдегідні групи, що залишилися на поверхні сферичних частинок після контакту дифтерійного анатоксину з носієм, використовували розчин же-латози 1% концентрації.

    Діагностичний препарат в рідкому вигляді зазвичай зберігали 7-10 днів при температурі (6 + 4) ° С без зміни його активності та специфічності.

    З метою підвищення стабільності властивостей ді-агностікум отриманий в лиофилизированном вигляді, використовуючи желатозу-сахарозний середу висушуючи-

    0, б5 мл 1,3 мл 2, б мл

    (192,0 Lf) (384,0 Lf) (7б8,0 Lf)

    Залежність активності дифтерійного антигенного полімерного диагностикума від сенсибилизирующей дози анатоксину.

    По осі абсцис - сенсибілізуюча доза анатоксину в 1 мл (Lf) на 100 мг носія; по осі ординат - розведення контрольної протидифтерійної сироватки

    ня (3% желатози + 3% сахарози). Сухий дифтерійний антигенний полімерний препарат в ампулах має вигляд пористої таблетки сіреневаторозового кольору, легко розчинної (протягом 1 хв) при додаванні 15 мл 0,9% розчину хлориду натрію. Термін зберігання ліофілізованого диаг-ностікума - 3 роки (термін спостереження). Протягом трьох років контролювали розчинність, активність і специфічність трьох серій препарату через 6 міс., 1, 2 і 3 роки. Тривалість зберігання не впливала на фізичний стан (розчинність), активність і специфічність діагностичного препарату.

    Специфічна активність отриманого нами діагностикумів склала 1: 6400 з комерційної протидифтерійної сироваткою (сер. 54), починаючи з розведення 1: 100. З антитоксином дифтерійним очищеним ферментолиз і специфічної сорбції (виробництво НВО «Біомед», Перм, сер. 42), що містить 500 МО / мл, активність склала

    2,5-10 ^ МО / мл.

    Специфічна активність комерційного дифтерійного еритроцитарного антигенного диагностикума (виробництво АТВТ «Біомед» ім. І.І.Меч-ників) з контрольної протидифтерійної сироваткою сер. 54, починаючи з розведення 1: 100, склала 1: 6400 для сер. 89 і 1 3200 для сер. 75.

    Специфічність дифтерійного антигенного полімерного диагностикума досліджували, використовуючи такі гетерологічние сироватки: протиправцеву, кашлюку, туляремійную, О-хо-Лерна, легіонеллезную, Q-Риккетсіозних, шигел-корисної поливалентную, ешеріхіозной групову і поливалентную, іерсініозной поливалентную, Лептоспірозний типоспецифічними (міні, ціноп- тери, Аустраліс, Помона, канікола), сироватку людини негативну, починаючи з розведенні 1:20.

    Для дослідження ступеня напруженості імунітету до дифтерії з Центру держсанепіднагляду Ростова-на-Дону отримана 181 сироватка вакцинованих осіб різних вікових груп населення з результатами РНГА (еритроцитарний антигенний диагностикум, сер. 75).

    У роботі застосовувалися одночасно два дифтерійних діагностичних препарату: еритроцит-

    Визначення рівня антитоксичних антитіл в серонегатівних сироваткових зразках двома серологічними методами: РНГА і РАО

    Номер сиво- Ротко Дата народження Ревакцинація Титр РНГА Титр РА (п = 3)

    перша друга третя сер. 75 сер. 89

    1997 01.03.93 - - +20 320 320

    1889 17.10.82 - - +40 160 160

    1896 21.01.83 - - + 10 80 80

    1895 26.02.83 - - +40 160 160

    1890 05.03.83 - - +40 160 160

    1892 08.06.83 - - +40 160 160

    1894 16.09.83 - - +40 320 160

    1830 01.05.89 - - + 40 80 160

    1987 15.05.90 + + - 20 160 80

    1796 27.05.90 + + + 40 160 80

    1923 01.01.95 - - - 20 80 60

    1807 18.03.95 + + - 40 80 160

    1775 17.04.95 + + - 40 320 320

    1755 13.10.98 + - - 40 160 320

    Примітка. п - число повторностей досвіду.

    тарний антигенний диагностикум (сер. 89) і полімерний антигенний сухий трьох серій (5, 7, 8). Результати представлені при постановці реакцій в трьох повторностях. Діагностичний титр реакції агломерації - 1:80. При дослідженні 181 сироватки вакцинованого контингенту сироваткові зразки були розподілені на 5 вікових груп відповідно до плану ревакцинації.

    Порівняння специфічної активності еритро-цітарная дифтерійного антигенного препарату (двох серій) і полімерного дифтерійного антигенного диагностикума на 114 сироваткових зразках показало, що в ряді випадків чутливість нашого препарату була вище на 2-3 дворазових розведення (в 17% випадків для сер. 89, в 36% - для сер. 75). З 114 досліджених сироваток виявлено 5 серонегативного (з титрами в РНГА і РАО нижче діагностичного: 1: 20-1: 40) від осіб різного віку: 3 сироватки - група 17-18 років, 1-11 років, 1-7 років.

    При дослідженні 181 сироватки людей, вакцинованих в різні терміни, особливий інтерес викликають показники антитіл у групи осіб (14 чол.) Серонегативних в РНГА (еритроцитарний діагности-кум сер. 75) (таблиця). При порівняльному дослідженні ступеня напруженості імунітету двома серологічними методами встановлено, що в РНГА з еритроцитарних антигенних препаратом сер. 75 (дані Центру держсанепіднагляду Ростова-на-Дону) в 14 випадках титр реакції був нижче діагностичного (1: 20-1: 40). При дослідженні цих же сироваток в РНГА з еритроцитарних препаратом сер. 89 і в РАО з полімерним діагностикумів титри реакції були вище діагностичного (1: 80-1: 320), таблиця. Ці результати підтверджують дані про нестабільність властивостей біологічного еритроцитарного носія і діагностичних препаратів на його основі від серії до серії, що може в подальшому призвести до невиявлених діагностичного титру і подальшої необгрунтованої ревакцинації.

    Результати аналізу 67 сироваткових зразків вікової групи старше 35 років показали, що число серонегативних осіб в даній групі становить 46,3% (31 сироватка). З них 3-кратну ревакцинацію отримали 45,2% (14 сироваткових зразків), дворазову - 36,1% (11), одноразову -

    18,7% (6). Із загальної кількості серонегатівних результатів (38), виявлених в РНГА, в 7 випадках в РАО визначили діагностичний титр і вище, що дозволяє в даному випадку говорити про більш високої чутливості методу з використанням полімерного препарату.

    На підставі результатів досліджень вважаємо перспективним застосування розробленого нами полімерного дифтерійного антигенного диагно-стікума для визначення ступеня напруженості імунітету поряд з аналогічним еритроцитарних препаратом.

    Таким чином, відпрацьовані умови іммобілізації дифтерійного анатоксину на полімерних сферичних частинках носія. Розроблено дифтерійний полімерний антигенний діагностикумів. Діагностичний препарат отриманий в ліофілізованої-ном вигляді. Стабільність властивостей диагностикума зберігається протягом 3 років, на відміну від ерітроцітар-ного комерційного рідкого з терміном зберігання 1 рік. За активністю полімерний диагностикум відповідає комерційному еритроцитарного, а в деяких випадках перевершує його. Розроблений дифтерійний препарат використовували в лабораторіях практичної охорони здоров'я для визначення рівня антитоксичних антитіл в сироватках вакцинованого контингенту різних вікових груп населення поряд з препаратами для РНГА.

    СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

    1. Васильєва К.Г., Лаврюков С.Я. // Журн. епідеміо-МИОЛ. та інф. бол. - 1998. - № 2. - С. 25-27. - 2. Запорожець Т. С., Беседнова М.М., Г Ажа А. К. та ін. // Журн. епідеміологічн-ол. та інф. бол. - 1998. - № 2. - С. 30-33. - 3. Луник І.Г. Колективний імунітет до дифтерії у населення Приморського краю в період масової імунізації: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 1999. - 4. Мазурова І.К., Мельник В.Г., Комбарова С.Ю. Лабораторна діагностика дифтерійній інфекції. Керівництво. - М .: Інформаціонноіздательскій центр Госкомсанепіднадзора Росії. - 1995. -5. Маркіна С.С., Максимова Н.М., Богатирьова Е.Я. та ін. // ЗНіСО. - 1998. - № 2. - С. 4-8. - 6. Наркевич А.Н., Безуглова Є.В., Кочеткова О.П. та ін. Спосіб отримання носія імуноглобулінів. - А.С. № 1443578 від 8.08.1988. -7. Парфьонова Є.В., Прокопов Н.В., Черкасов В.Р. // ЖМЕІ. - 1994. - № 6. - С. 97-99. - 8. Про заходи щодо стабілізації та зниження захворюваності на дифтерію. Наказ МОЗ та МП РФ, ГКСЕН РФ N 297/112 від 30.10.1995. - М. - 1995. - 9. Фікс Л.І., Іноземцева Л.В., Мусіна Л.Т. та ін. // ЖМЕІ. -1995. - № 6. - С. 73-74.

    I.R.Simonova, E.V.Bezuglova, A.N.Terentiev, A.N.Narkevich, A.P.Kochetkova, S.Z.Valieva

    Construction of a Polymer Antigenic Diagnostic Preparation and the Possibility of its Adaptation to the Assessment of Antitoxic Diphtheria Immunity

    Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute

    A new diphtheria antigenic preparation was constructed on the basis of polymer microspheres with stable biochemical characteristics. The preparation is produced as a lyophilized form with 3-years shelf life. The voluminous agglomeration reaction (VAR) was carried out with the diagnostic preparation using the principle of micro-technique on the home-made immunologic test worksheets. The results of serologic analyses were clear-cut, stable, demonstrative, easily seen due to the bright coloring of the preparation. They were registered in an hour and a half or in two hours. To assess the immunologic status, a comparative analysis of the blood sera was made for vaccinated persons of different age groups using two serologic test procedures (IHA and VAR). The constructed diphtheria antigenic polymer preparation is presented as a promising drug to be used in the system of sanitary-epidemiologic facilities.

    Key words: diphtheria, anatoxin polymeric microspheres, serologic reactions.

    nocTynu ^ a 17.09.06.


    Ключові слова: ДИФТЕРІЯ /анатоксин /ПОЛІМЕРНІ МІКРОСФЕРИ /СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦІЇ /DIPHTHERIA /ANATOXIN POLYMERIC MICROSPHERES /SEROLOGIC REACTIONS

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити