Представники роду Vibrio cholerае відрізняються структурою липополисахарида, зокрема його О-полісахаридних ланцюгів (О-антиген), що визначає серологічну специфічність вібріонів. в даний час для отримання препарату липополисахарида використовується водно-фенольний метод. проте дана методика відноситься до жорстких хімічних методів, призводить до зміни вихідної молекулярної організації биополимера, порушуючи його структуру і біологічні властивості. сучасні технології при розробці діагностичних препаратів для іммуносуспензіонной реакції агломерації об'ємної дозволяють отримувати синтетичні носії з різними реакційними групами на поверхні частинок, здатними зв'язувати антигени / антитіла. Мета дослідження створення холерного антигенного діагностикумів на основі липополисахарида Vibrio cholerae О1 серогрупи. Матеріали та методи. Як сенсітіна використаний липополисахарид, отриманий за допомогою авторської модифікації методу ферментативної очищення з клітинних оболонок холерного вібріона з використанням ультразвукової дезінтеграції. Результати та обговорення. Отриманий сенсітін містить невеликі домішки білка (1,5%) і нуклеїнових кислот (0,1%). Діагностичний препарат характеризується високою аналітичною чутливістю в реакції агломерації об'ємної з холерними комерційними і експериментальними кролячими сироватками до Vibrio cholerae О1 серогрупи (1: 640 1: 5120) і аналітичної специфічністю (диагностикум не взаємодіє з гетерологічними сироватками, з сироватками до збудників гострих кишкових інфекцій, а також з сироватками здорових донорів). сконструйований диагностикум полімерний холерний антигенний, призначений для виявлення антитіл до холерного ліпополісахаридом в сироватках крові хворих, що перехворіли, підозрілих на захворювання або вакцинованих людей.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Ларіонова Л. В., Сімакова Д.І., Наркевич А. Н., Архангельська І. В., Шубін Г. Г.


Construction of Polymeric Antigenic Diagnosticum Based on Vibrio cholera О1 Lipopolysaccharide

Representatives of the genus Vibrio cholerae differ in the structure of lipopolysaccharide, in particular, its O-polysaccharide chains (O-antigen), which determines the serological specificity of vibrios. Currently, the water-phenolic method is used to obtain the lipopolysaccharide preparation. However, this technique relates to harsh chemical methods, leads to a change in original molecular organization of biopolymer, violating its structure and biological properties. Modern technologies in the development of diagnostic kits for the immunosuspension reaction of volume agglomeration allow for obtaining synthetic carriers with different reaction groups on the particle surface capable to bind antigens / antibodies. The aim of this study was to construct cholera antigenic polymeric diagnostic kit based on the lipopolysaccharide of Vibrio cholerae O1 serogroup. Materials and methods. The lipopolysaccharide was used as a sensitizer obtained through the author's modification of enzymatic purification from the cell membranes of Vibrio cholerae using ultrasonic disintegration. Results and discussion. The resulting sensitin contains small impurities of protein (1.5%) and nucleic acids (0.1%). Diagnosticum is characterized by high analytical sensitivity in agglomeration reaction with commercial and experimental rabbit serum to Vibrio cholerae O1 serogroup (1: 640 1: 5120) and analytical specificity (the diagnosticum does not interact with heterologous sera, with serums to pathogens of acute intestinal infections, as well as with sera from healthy donors). A polymeric antigenic cholera diagnosticum designed to detect antibodies to lipopolysaccharide of Vibrio cholerae in the blood serum of patients who were ill, suspected of the disease or vaccinated people has been constructed.


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2019


    Журнал: Проблеми особливо небезпечних інфекцій


    Наукова стаття на тему 'КОНСТРУЮВАННЯ діагностикумів ПОЛІМЕРНОЇ ХОЛЕРНОГО антигенів НА ОСНОВІ ліпополісахаридом VIBRIO CHOLERA О1 серогрупи'

    Текст наукової роботи на тему «КОНСТРУЮВАННЯ діагностикумів ПОЛІМЕРНОЇ ХОЛЕРНОГО антигенів НА ОСНОВІ ліпополісахаридом VIBRIO CHOLERA О1 серогрупи»

    ?DOI: 10.21055 / 0370-1069-2019-4-67-72

    УДК 616.932: 616-07

    Л.В. Ларіонова, Д.І. Сімакова, О.М. Наркевич, І.В. Архангельська, Г.Г. Шубін

    КОНСТРУЮВАННЯ діагностикумів ПОЛІМЕРНОЇ ХОЛЕРНОГО антигенів НА ОСНОВІ ліпополісахаридом VIBRIO CHOLERAE О1 серогрупи

    ФКУЗ «Ростовський-на-Дону науково-дослідний протичумний інститут», Ростов-на-Дону, Російська Федерація

    Представники роду Vibrio cholerае відрізняються структурою липополисахарида, зокрема його О-полісахаридних ланцюгів (О-антиген), що визначає серологічну специфічність вібріонів. В даний час для отримання препарату липополисахарида використовується водно-фенольний метод. Однак дана методика відноситься до жорстких хімічних методів, призводить до зміни вихідної молекулярної організації биополимера, порушуючи його структуру і біологічні властивості. Сучасні технології при розробці діагностичних препаратів для іммуносуспензіонной реакції агломерації об'ємної дозволяють отримувати синтетичні носії з різними реакційними групами на поверхні частинок, здатними зв'язувати антигени / антитіла. мета дослідження - створення холерного антигенного диагностикума на основі липополисахарида Vibrio cholerae О1 серогрупи. матеріали та методи. Як сенсітіна використаний ліпополіса-харід, отриманий за допомогою авторської модифікації методу ферментативної очищення з клітинних оболонок холерного вібріона з використанням ультразвукової дезінтеграції. результати і обговорення. Отриманий сенсітін містить невеликі домішки білка (1,5%) і нуклеїнових кислот (0,1%). Діагностичний препарат характеризується високою аналітичною чутливістю в реакції агломерації об'ємної з холерними комерційними і експериментальними кролячими сироватками до Vibrio cholerae О1 серогрупи (1: 640 - 1: 5120) і аналітичної специфічністю (диагностикум не взаємодіє з гетерологічними сироватками, з сироватками до збудників гострих кишкових інфекцій, а також з сироватками здорових донорів). сконструйований диагностикум полімерний холерний антигенний, призначений для виявлення антитіл до холерного ліпопо-лісахаріду в сироватках крові хворих, що перехворіли, підозрілих на захворювання або вакцинованих людей.

    Ключові слова: Vibrio cholerae, липополисахарид, полімерні мікросфери, діагностикумів, аналітична чутливість, аналітична специфічність.

    Корреспондирующий автор: Ларіонова Людмила Володимирівна, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її..

    Для цитування: Ларіонова Л.В., Сімакова Д.І., Наркевич А.Н., Архангельська І.В., Шубін Г Г Конструювання диагностикума полімерного холерного антигенного на основі липополисахарида Vibrio cholerae О1 серогрупи. Проблеми особливо небезпечних інфекцій. 2019; 4: 67-72. DOI: 10.21055 / 0370-1069-20194-67-72

    L.V. Larionova, D.I. Simakova, A.N. Narkevich, I.V. Arkhangel'skaya, G.G. Shubin

    Construction of Polymeric Antigenic Diagnosticum Based on Vibrio cholerae О1 Lipopolysaccharide

    Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Russian Federation

    Abstract. Representatives of the genus Vibrio cholerae differ in the structure of lipopolysaccharide, in particular, its O-polysaccharide chains (O-antigen), which determines the serological specificity of vibrios. Currently, the water-phenolic method is used to obtain the lipopolysaccharide preparation. However, this technique relates to harsh chemical methods, leads to a change in original molecular organization of biopolymer, violating its structure and biological properties. Modern technologies in the development of diagnostic kits for the immuno-suspension reaction of volume agglomeration allow for obtaining synthetic carriers with different reaction groups on the particle surface capable to bind antigens / antibodies. The aim of this study was to construct cholera antigenic polymeric diagnostic kit based on the lipopolysaccharide of Vibrio cholerae O1 serogroup. Materials and methods. The lipopolysaccharide was used as a sensitizer obtained through the author's modification of enzymatic purification from the cell membranes of Vibrio cholerae using ultrasonic disintegration. Results and discussion. The resulting sensitin contains small impurities of protein (1.5%) and nucleic acids (0.1%). Diagnosticum is characterized by high analytical sensitivity in agglomeration reaction with commercial and experimental rabbit serum to Vibrio cholerae O1 serogroup (1: 640 - 1: 5120) and analytical specificity (the diagnosticum does not interact with heterologous sera, with serums to pathogens of acute intestinal infections, as well as with sera from healthy donors). A polymeric antigenic cholera diagnosticum designed to detect antibodies to lipopolysaccharide of Vibrio cholerae in the blood serum of patients who were ill, suspected of the disease or vaccinated people has been constructed.

    Keywords: Vibrio cholerae, lipopolysaccharide, polymeric microspheres, diagnosticum, analytical sensitivity, analytical specificity.

    Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

    Corresponding author: Lydmila V. Larionova, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її..

    Citation: Larionova L.V., Simakova D.I., Narkevich A.N., Arkhangel'skaya I.V., Shubin G.G. Construction of Polymeric Antigenic Diagnosticum Based on Vibrio cholerae О1 Lipopolysaccharide. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2019; 4: 67-72. (In Russian). DOI: 10.21055 / 03701069-2019-4-67-72

    Received 22.07.19. Revised 24.10.19. Accepted 28.11.19.

    Удосконалення лабораторної діагностики холери, в тому числі створення нових препаратів, які дозволяють виявляти протихолерні антитіла в сироватках крові хворих, підозрілих на захворювання або вакцинованих людей, є одним з перспективних напрямків дослідження. Відомо, що представники виду Vibrio cholerae відрізняються структурою липополисахарида (ЛПС), а саме його О-полісахаридних ланцюгів (О-антигену), що визначають серологічну специфічність вібріонів. ЛПС є великим структурним компонентом клітинної оболонки грамнегативних бактерій (в тому числі і холерного вібріона), з його дією на організм пов'язують об'єктивні клінічні прояви інтоксикації [1, 2]. У зв'язку з цим актуальним є створення нових діагностичних препаратів для виявлення протихолерних антитіл до ліпополісахаридів [3, 4].

    При дослідженні ролі ЛПС в патогенезі різних захворювань важливим етапом є його виділення з бактеріальної клітини збудника. в даний час розроблені і запропоновані різні методики виділення та очищення ЛПС, що дозволяють визначати його біологічну функцію, хімічну структуру і серологическую активність. в літературі наводяться способи виділення ЛПС з бактеріальних клітин сальмонел і псевдомонад [5], а також чумного мікроба [6, 7]. Найбільш широке застосування має водно-фенольний спосіб отримання ЛПС [8, 9]. використання фенолу в різних варіантах відноситься до жорстких хімічних методів виділення ендотоксину і призводить до зміни вихідної молекулярної організації биополимера, порушуючи його структуру і біологічні властивості. При цьому необхідно відзначити високу токсичність і хімічну агресивність самого фенолу, що є обмежуючим фактором при отриманні великих кількостей ЛПС. Щадні методи отримання ЛПС засновані на попередньому руйнуванні або лизисе бактерій з подальшою депротеініза-цією лизата протеазами і нуклеазами.

    Для виявлення протихолерних антитіл в сироватках хворих, підозрілих на захворювання холерою, і вакцинованих людей раніше застосовувалися еритроцитарні діагностикуми. Властивості біологічних носіїв залежать від генетичних особливостей і віку донора, сезону, умов утримання тварини і т.д., що обумовлює нестандартність і нестабільність еритроцитарного носія. протягом декількох років широко обговорювалося питання про заміну еритроцитарного носія полімерними латексами. все більше застосування знаходять реакції з використанням діагностичних препаратів на основі полімерних мікросфер. Сучасні технології дозволяють отримувати синтетичні носії різних розмірів з реакційними групами на поверхні частинок, здатних фіксувати антигени / антитіла, що сприяє отриманню стандартних і стабільних діагностичних препаратів. Іммуносуспензіонная реакція

    агломерації об'ємна (РАО), що проводиться при використанні латексних діагностикумів, є доступним і простим в технічному відношенні методом, оскільки не вимагає наявності спеціального обладнання, є одностадійної реакцією і може бути застосована в польових умовах [10, 11, Наказ Росспоживнагляду № 1116 від 01.12. 2017 «Про заходи щодо вдосконалення моніторингу за збудниками інфекційних та паразитарних хвороб»].

    Мета роботи - конструювання диагностикума полімерного холерного антигенного на основі ліпо-полісахариду Vibrio cholerae О1 серогрупи.

    матеріали та методи

    поліклональні кролячі сироватки до культурам V. cholerae Classical 1395, V. cholerae О139 16064, V. cholerae El Tor 2044, V. cholerae El Tor 13020 отримували за двома схемами. Перша схема включала в себе п'ять ін'єкцій добової культури V. cholerae, обеззараженной кип'ятінням протягом 30 хв, з інтервалами в 4 діб з збільшуються концентраціями (від 25-107 м.к. до 1-109 м.к.). Перша ін'єкція проводилася внутрішньовенно, наступні - підшкірно. Через 7 діб після останньої ін'єкції перевіряли титр анти-ЛПС антитіл і проводили тотальне знекровлення.

    Друга схема включала в себе попереднє підшкірне введення «тактовно» протягом 3 днів в кількості 0,3 мл, на 4 день внутрішньовенно вводили 25-107 м.к. добової культури V. cholerae, обеззараженной кип'ятінням протягом 2 ч. з 9 по 11 діб підшкірно вводили 25-107 м.к. з неповним ад'юван-те; на 16, 17 і 18 діб - 50-107 м.к. з неповним ад-ЮВАНТ; на 23, 24, 25 діб - 75-107 м.к. з неповним ад'ювантом; на 30-32 добу - 1-109 м.к. з неповним ад'ювантом. через 7 діб після останньої ін'єкції перевіряли титр анти-ЛПС антитіл і проводили забір крові.

    Всі експерименти з тваринами виконувалися відповідно до законодавства Російської Федерації [Наказ Міністерства охорони здоров'я РФ № 199н «Про затвердження Правил належної лабораторної практики» від 01.04.2016 р, ГОСТ 33215-2014 «Керівництво з утримання та догляду за лабораторними тваринами. Правила обладнання приміщень і організація процедур », ГОСТ 33216-2014« Керівництво з утримання та догляду за лабораторними тваринами. Правила утримання і догляду за лабораторними гризунами та кроликами »] і Директивою європейського парламенту і ради Європейського союзу з охорони тварин, що використовуються в наукових цілях [Директива 2010/63 / EU]. Експерименти здійснювали відповідно до СП 1.3.3118-13. Для отримання нормальних людських сироваток отримано інформовану згоду.

    Для дослідження чутливості і специфічності отриманого експериментального діа-гностікума використовували комерційні та екс-

    періментальние протихолерні сироватки. Аналітичну чутливість оцінювали за допомогою комерційних сироваток: сироватка діагностична холерна 01 адсорбована суха для реакції аглютинації (РА), серія 83, 87 (ФКУЗ РосНІПЧІ «Мікроб», і експериментальна кроляча протихолерні сироватка до V. cholerae 01 (ФКУЗ Ростовський-на-Дону протичумний інститут).

    Аналітичну специфічність оцінювали, використовуючи комерційні сироватки: сироватка діагностична холерна не01 групи 0139 адсорбована кроляча для реакції аглютинації (РА) на склі, серія 86 (ФКУЗ РосНІПЧІ «Мікроб»); «Сироватка сальмонельозна адсорбована 0-полівалентна основних груп ABCDE для РА (ПЕТСАЛ®)», серія 04111 (ФГУП СПбНІІВС); «Сироватка діагностична шигел-корисної адсорбована полівалентна до Shigella flexneri I-VI для РА (АГН0ЛЛА®)», серія 69-1113 (ФГУП СПбНІІВС); «Сироватка діагностична ешеріхіозной ОКА полівалентна суха для РА», серія 6010214 (ВАТ «Біомед»), (ФБУН НІІМЕ ім. Пастера); експериментальні кролячі сироватки до V. cholerae 0139 16064 та V. cholerae non01 / non0139-02, V. cholerae non01 / non0139-05, V. cholerae non01 / non0139-022 (ФКУЗ Ростовський-на-дону протичумний інститут), сироватки крові, отримані від здорових донорів.

    липополисахарид виділяли за авторською модифікації методу R.P. Darveau і R.T.W. Hancock (1983 р) з клітинних оболонок холерного вібріона з подальшою ферментативної очищенням від домішок білків і нуклеїнових кислот. в препараті ЛПС визначали білок за Лоурі [12], нуклеїнові кислоти - по Спіріну [13]. Електрофорез отриманого препарату проводили за методикою U.K. Laemmli в 15% ПААГ-SDS гелі [14]. Навантаження препарату на лунку становила 1,5 мкг. Для виявлення ЛПС гелі фарбували сріблом, використовуючи комерційний набір «Bio-Rad Silver Stain» відповідно до вказівок інструкції.

    Поліакролеіновий мікросферіческая носій отримували шляхом синтезу монодисперсних полімерних мікросфер з альдегідними групами в умовах одномоментно протікає анионной і радикальної полімеризації акролеина в водно-лужному середовищі. Фарбування частинок сферичної форми розміром (1,2 ± 0,1) мкм виробляли внесенням барвника «тіанін» в полімеризації суміш в процесі синтезу. Після полімеризації носій відмивали дистильованою водою при температурі 100 ° С. В ході сенсибілізації сферичного носія холерним ЛПС 50 мг відмивали 0,1 М карбонатних буфером рН 9,2 і центрифугували при 3000 g при кімнатній температурі протягом 15 хв. 0садок сфер суспендованих в 8 мл карбонатного буфера рН (9,2 ± 0,1) і нагрівали до температури 60 ° С протягом 15 хв на водяній бані. Прогрітий препарат ЛПС в ЗФР ​​рН (7,2 ± 0,1) вносили в суспензію носія, інкубували при

    температурі 60 ° С протягом 2 год на електромагнітної мешалке, поміщали в холодильник на 16-18 год. Після холодової експозиції до суміші додавали 1 мл 1% розчину желатози; інкубували протягом 2 ч на електромагнітної мешалке при кімнатній температурі; відмивали тричі ЗФР рН (7,2 ± 0,1); потім суспендованих в 4 мл 0,1% розчину желатози. В результаті проведених досліджень отримано діа-гностікум полімерний холерний антигенний на основі липополисахарида Vibrio cholerae 01 сіро-групи з робочим розведенням 1: 7.

    Для підвищення стабільності властивостей і збільшення терміну зберігання розробленого діагностичного препарату підібрані оптимальні умови його ліофілізації.

    Рідкий препарат центрифугировали, осад полімерного диагностикума суспендованих в 3% желатозу-сахарозному середовищі висушування. Перед ліо-філізаціей проводили попереднє заморожування рідкого діагностичного препарату охолодженням в рідкому азоті при температурі -196 ° С протягом 1-2 хв. Потім флакони з експериментальним препаратом витримували в низькотемпературному шафі для глибокого заморожування при температурі -30 ° С протягом 16 год. Ліофілізація проводили в апараті для ліофільного висушування «POWER DRY PL 900» ( «Termascientific») при вакуумному підігріві протягом 15 год. В процесі ліофілізації в камері висушування автоматично підтримувалося тиск 0,067 hPа. Препарати висушували до кінцевої температури в камері висушування при 22 ° С, після цього флакони закривали гумовими пробками, завальцовивается в середовищі осушеного стерильного повітря при нормальному атмосферному тиску і зберігали в холодильнику при температурі 4 ° С.

    Перед постановкою РАО ліофілізований нормальну кролячу сироватку (НКС) розчиняли в 5 мл ЗФР рН (7,2 ± 0,1), отримуючи розведення 1: 100. ліофілізований диагностикум суспендованих в 3,5 мл ЗФР, отримуючи розведення 1: 7. Контрольну холерну сироватку, ліофілізований з розведення 1:10, розчиняли в 1 мл ЗФР, отримуючи розведенні 1:10.

    для постановки РАО в кожну лунку 96-ямкового планшета з «і» подібними лунками для імунологічних реакцій вносили 50 мкл НКР в розведенні 1: 100. Потім в першу лунку кожного ряду вносили 50 мкл досліджуваної сироватки і двократно титровали до кінця ряду. диагностикум в робочому розведенні вносили в обсязі 25 мкл в кожну лунку і залишали при кімнатній температурі. для контролю спонтанної аглютинації в дві лунки вносили 50 мкл НКР і 25 мкл робочого розведення диагностикума. Облік результатів здійснювали через 2-2,5 год. За позитивний результат брали кольоровий блакитний агломерат, що вистилає всі дно лунки рівномірно або агломерат, що вистилає дно лунки з чітко окресленими краями. У негативних випадках і в контролі утворювалося компактне колечко або точка в центрі лунки.

    Результати та обговорення

    В ході дослідження отримані поліклональ-ні кролячі сироватки до культурам V. cholerae Classical 1395, V. cholerae О139 16064, V. cholerae El Tor 2044, V. cholerae El Tor 13020, знешкоджених двома методами - шляхом кип'ятіння протягом 30 хв і 2 год для подальшого дослідження чутливості діагностичного препарату. Різний температурний режим знешкодження бактеріальних мас перед імунізацією кролів може впливати на збільшення титру анти-ЛПС антитіл, що дозволяє вибрати контрольну сироватку для визначення чутливості розробленого діагностичного препарату. результати визначення титрів антитіл в експериментальних сироватках до V. cholerae Classical 1395 V. cholerae El Tor 13020, V. cholerae El Tor 2044, V. cholerae О139 16064, отриманих за двома різними схемами, в об'ємної реакції агломерації з відповідними культурами холерного вібріона відображені в табл. 1.

    Результати дослідження сироваток в РАО показали, що час кип'ятіння істотно не впливає на збільшення кількості антитіл.

    Ліофілізований препарат ЛПС, отриманий ферментативним методом з клітинних оболонок, являє собою білі пластівці, при розчиненні в дистильованої воді або ЗФР рН (7,2 ± 0,1) утворюють гомогенну, злегка опалесцирующую суспензію. При дослідженні чистоти препарату показано присутність невеликих домішок білків і нуклеїнових кислот: 1,5% білка за Лоурі і 0,1% нуклеїнових кислот. Електрофоретичне дослідження показало, що препарат ЛПС представлений смугами з молекулярної масою 12-23 кДа.

    Для конструювання диагностикума полімерного холерного антигенного на основі ліпополіса-харіда Vibrio cholerae О1 серогрупи сенсибілізованими полімерні мікросфери препаратом ЛПС в карбонатному буфері рн 9,2 в дозі 450 мкг на 50 мг сферичного носія.

    Таблиця 1 / Table 1

    Визначення титрів антитіл в експериментальних кролячих сироватках

    Determination of antibody titer in experimental rabbit sera

    Штам, до якого отримана сироватка The strain to which the serum is obtained Титр в РАО Схема 1 The titer in volume agglomeration reaction Scheme 1 Титр в РАО Схема 2 The titer in volume agglomeration reaction Scheme 2

    V. cholerae Classical 1395 1: 640 1: 640

    V. cholerae El Tor 13020 1: 1280 1: 2560

    V. cholerae El Tor 2044 1: 640 1: 640

    V. cholerae О139 16064 1: 1280 1: 2560

    При оцінці робочих характеристик розроблюваного діагностичного препарату оцінювали аналітичну чутливість і специфічність. Аналітична чутливість є мінімальна кількість антигену, яке можна визначити за допомогою диагностикума. Аналітична специфічність відображає здатність діагностикумів визначати специфічний антиген в зразку [15].

    Аналітичну чутливість і специфічність розробленого діагностичного препарату вивчали в реакції агломерації об'ємної (табл. 2). Титри антитіл в експериментальних кролячих сироватках визначені з відповідними культурами V. cholerae Classical 1395, V. cholerae El Tor 13020 в об'ємної реакції аглютинації, титри антитіл в комерційних сироватках діагностичних холерних агглютинирующих були вказані в інструкціях по застосуванню.

    Результати дослідження аналітичної чутливості сконструйованого диагностикума полімерного холерного антигенного на основі ліпопо-лісахаріда Vibrio cholerae О1 серогрупи показали його високу чутливість. титри антитіл комерційних холерних кінських і експериментальних кролячих сироваток в РАО з представленим діагностикумів склали від 1: 640 до 1: 5120.

    Таблиця 2 / Table 2

    Результати дослідження аналітичної чутливості експериментального диагностикума The results of the study of the analytical sensitivity of experimental diagnosticum

    Сироватка Serum Титр в PA Titer in agglutination reaction Титр в PAO Titer in volume agglomeration reaction

    Комерційна сироватка діагностична холерна 01 адсорбована суха для реакції аглютинації (РА) (серія 83) Commercial diagnostic choiera O1 serum, adsorbed, dry, for agglutination reaction (AR) (series 83) 1: 800 1: 1280

    комерційна сироватка діагностична холерна о1 адсорбована суха для реакції аглютинації (РА) (серія 87) Commercial diagnostic choiera O1 serum, adsorbed, dry, for agglutination reaction (AR) (series 87) 1: 2000 1: 5120

    Кроляча експериментальна сироватка до V. cholerae 01 13020 Rabbit experimental serum to V. cholerae O1 13020 1: 640 1: 640

    Кроляча експериментальна сироватка до V. cholerae 01 dassical 1395 Rabbit experimental serum to V. cholerae O1 dassical 1395 1: 640 1: 640

    Нормальна кроляча сироватка Normal rabbit serum - Негативно Negative

    Результати дослідження аналітичної специфічності диагностикума в РАО представлені в табл. 3.

    Показано високу специфічність розробленого діагностикуми. Діагностичний препарат не давав позитивні реакції в РАО як з комерційними, так і з експериментальними кролячими гетероло-гічної холерними сироватками, не реагував з сироватками здорових донорів, а також з сироватками, призначеними для діагностики збудників гострих кишкових інфекцій. Встановлений титр 1:20 в реакції з сироваткою комерційної сальмо-неллезной адсорбированной О-полівалентної основних груп ABCDE є не специфічною і не впливає на результати досліджень сироваток.

    При створенні діагностичного препарату наступним етапом дослідження є розрахунок діагностичної чутливості і специфічності, що дозволяють визначити діагностичний титр диагностикума [16].

    Таким чином, сконструйований диагностикум полімерний холерний антигенний на основі ліпопо-лісахаріда Vibrio cholerae 01 серогрупи. Препарат липополисахарида виділяли за авторською модифікації методу R.P. Darveau і R.E. Hancock (1983 р) з клітинних оболонок холерного вібріона, використовуючи

    ферментативний метод очищення від домішок білків і нуклеїнових кислот. виділення ЛПС з клітинних оболонок холерного вібріона дозволило скоротити кількість протеїнази, РНКази, ДНКази. При дослідженні чистоти отриманого препарату показано присутність невеликих домішок (1,5% білка і 0,1% нуклеїнових кислот). Електрофоретичний аналіз показав, що препарат ЛПС представлений S-формою з молекулярної масою 12-23 кДа і використаний в якості сенсітіна. При використанні експериментальних кролячих і комерційних холерних діагностичних сироваток встановлена ​​аналітична чутливість сконструйованого препарату в титрах від 1: 640 до 1: 5120. Специфічність вивчали на панелі гетерологічних сироваток, а також сироваток здорових донорів.

    для визначення діагностичного титру діа-гностікума полімерного холерного антигенного на основі липополисахарида Vibrio cholerae О1 сіро-групи необхідне продовження вивчення його діагностичних характеристик на панелі парних сироваток, отриманих від хворих на холеру людей з підтвердженим діагнозом.

    конфлікт інтересів. Автори підтверджують відсутність конфлікту фінансових / нефінансових інтересів, пов'язаних з написанням статті.

    Таблиця 3 / Table 3

    результати дослідження специфічності експериментального диагностикума The results of the study of the analytical specificity of experimental diagnosticum

    Сироватки Sera Титр в РА Titer in agglutination reaction Титр в РАО Titer in volume agglomeration reaction

    Комерційна сироватка діагностична холерна не О1 групи О139 адсорбована кроляча для реакції аглютинації (РА) на склі (серія 86) Commercial diagnostic cholera non-O1, O139 serum, adsorbed, rabbit, for agglutination reaction (AR) on the slide (series 86) 1 : 800 Негативно Negative

    Кроляча експериментальна до штаму V. cholerae О139 16064 Rabbit experimental serum to V. cholerae O139 strain 16064 1: 2560 Негативно Negative

    Кроляча експериментальна сироватка до V. cholerae nonО1 / nonО139-О2 серогрупи Rabbit experimental serum to V. cholerae non-O1 / non-O139-O2 serogroup 1: 640 Негативно Negative

    Кроляча експериментальна сироватка до V. cholerae nonО1 / nonО139-ПРО5 серогрупи Rabbit experimental serum to V. cholerae non-O1 / non-O139-O5 serogroup 1: 1280 Негативно Negative

    Кроляча експериментальна сироватка до V. cholerae nonО1 / nonО139-О22 серогрупи Rabbit experimental serum to V. cholerae non-O1 / non-O139-O22 serogroup 1: 640 Негативно Negative

    Сироватка діагностична шигеллезной адсорбована полівалентна до Shigella flexneri I-VI (серія 69-1113) Diagnostic Shigella serum, adsorbed, polyvalent to Shigella flexneri I-VI (series 69-1113) 1: 640 Негативно Negative

    Сироватка діагностична ешеріхіозной ОКА полівалентна (серія 623-0914) Diagnostic Escherichia serum OKA, polyvalent (series 623-0914) 1: 640 Негативно Negative

    Сироватка сальмонельозна адсорбована О-полівалентна основних груп ABCDE (серія 23-0714) Salmonella serum, adsorbed, O-polyvalent, of the main groups ABCDE (series 23-0714) 1: 640 1:20

    Нормальна людська сироватка № 1 Normal human serum No 1 - Негативно Negative

    нормальна людська сироватка № 2 Normal human serum No 2 - Негативно Negative

    нормальна людська сироватка № 3 Normal human serum No 3 - Негативно Negative

    нормальна людська сироватка № 4 Normal human serum No 4 - Негативно Negative

    Нормальна людська сироватка № 5 Normal human serum No 5 - Негативно Negative

    Список літератури

    1. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology,

    fenetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol. iolecul. Biol. Rev. 1998; 62 (4): 1301-14. PMID: 9841673. PMCID: PMC98947.

    2. Гюлазян H.M., Біла О.Ф Малов В.А., Пак С.Г., Волчакова Є.В. Ліпополісахариди / ендотоксини грамотрица-них бактерій: роль в розвитку інтоксикації. Епідеміологія та інфекційні хвороби. 2014; 19 (2): 11-6.

    3. Leung DT, Uddin T., Xu P., AktarA., Johnson RA, Rahman MA, Alam MM, Bufalo MK, Eckhoff G., Wu-Freeman Y., Yu Y., Sultana T., Khanam F., Saha A., Chowdhury F., Khan AI, Charles RC, LaRocque RC, Harris JB, Calderwood SB, Covac P., Qadri F., Ryan ET Immune responses to the O-specific polysaccharide antigen in children who received a killed oral cholera vaccine compared to responses following natural cholera infection in Bangladesh. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20 (6): 780-8. DOI: 10.1128 / CVI.00035-13.

    4. Uddin T., Aktar A., ​​Xu P., Johnson RA, Rahman MA, Leung DT, Afrin S., Akter A., ​​Alam MM, Rahman A., Chowdhuty F., Khan AI, Bhuiyan TR, Bufano MK , Rashu R., Yu Y., Wu-Freeman Y., Harris JB, LaRocque RC, Charles RC, Covac P., Calderwood SB, Ryan ET, Qadri F. Immune responses to O-spesific polysaccharide and lipopolysaccharide of Vibrio cholerae O1 Ogawa in adult Bangladeshi recipients of an oral killed vaccine and comparison to responses in patients with cholera. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2014; 90 (5): 873-81. DOI: 10.4269 / ajtmh.13-0498.

    5. Darveau R.P., Hancock R.E. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella thyphimurium strains. J. Bacteriol. 1983; 155 (2): 831-8. PMID: 6409884. PMCID: PMC217756.

    6. Полуніна Т.А., Гусєва Н.П., Кузьміченко І.А., Девдаріані З.Л., Задново С.П., Степанов А.В., Кірєєв М.Н. Спосіб отримання липополисахарида збудника чуми. Патент РФ № 2483112, опубл. 27.05.2013г.

    7. Марков Є.Ю., Миколаїв В.Б. Спосіб отримання бактеріальних ліпополісахаридів. Патент РФ № 2051969, опубл. 10.01.1996 р Бюлл. № 1.

    8. Westphal V.O., Luderitz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bacterien mit Phenol / Wasser. Zeitschrift fur Naturforschung B. 1952; 7 (3): 148-55. DOI: 10.1515 / znb-1952-0303.

    9. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A New method for the extraction of R lipopolysaccharides. Eur. J. Biochem. 1969; 9 (2): 245-9. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1969.tb00601.x.

    10. Ломов Ю.М., Терентьєв О.М., Карбишев Г.Л. Перспективи створення препаратів для індикації збудників ОНІ та інших актуальних інфекцій. В кн .: Матеріали IX з'їзду Всеросійського науково-практичного товариства епідеміологів, мікробіологів та паразитологів. М .: ТОВ «Санепідмедіа»; 2007; С. 60-1.

    11. Онищенко Г.Г., Кутирев В.В., редактори. Лабораторна діагностика небезпечних інфекційних хвороб. Практичний посібник. изд. 2-е, перероблене і доповнене. М .: ЗАТ «Шико»; 2013. 560 с.

    12. Lowry O.H., Rosebrough N.J. Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193Й): 265-75.

    13. Визначення нуклеїнових кислот за методом Спіріна в імунобіологічних лікарських препаратах. ОФС. 1.7.2.0018.15 (загальна фармакопейна стаття). [Електронний ресурс]. URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-2-0018-15-opre-delenie-nukleinovyh-kislot-po-metodu-spirina-v-immunobiolog-icheskih-lekarstvennyh-preparatah/ofs-1- 7-2-0018-15-opredelenie-nukleinovyh-kislot-po-metodu-spirina-v-immunobiologicheskih-lekarstvennyh-preparatah / (дата звернення 15.06.2019).

    14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly ofhead of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5. DOI: 10.1038 / 227680a0 /.

    15. Ramamurthy T., Das B., Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Sack D.A. Diagnostic techniques for rapid detection of Vibrio cholerae O1 / O139. Vaccine. 2019; pii: S0264-410X (19) 31020-5. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2019.07.099.

    16. Власов В.В. Епідеміологія: навчальний посібник для вузів. М .: «ГЕОТАР-МЕД»; 2006. 462 с.

    References

    1. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology,

    fenetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol. iolecul. Biol. Rev. 1998; 62 (4): 1301-14. PMID: 9841673. PMCID: PMC98947.

    2. Gyulazayn N.M., Belaya O.F., Malov V.A., Pak S.G., Volchakova E.V. [Lipopolysaccharides / endotoxins of gram-negative bacteria: role in intoxication development]. Epidemiologiya i

    Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2014;

    1 (2) '3.1Leung DT, Uddin T., Xu P., Aktar A., ​​Johnson RA, Rahman MA, Alam MM, Bufalo MK, Eckhoff G., Wu-Freeman Y., Yu Y., Sultana T. , Khanam F., Saha A., Chowdhury F., Khan AI, Charles RC, LaRocque RC, Harris JB, Calderwood SB, Covac P., Qadri F., Ryan ET Immune responses to the O-specific polysaccharide antigen in children who received a killed oral cholera vaccine compared to responses following natural cholera infection in Bangladesh. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20 (6): 780-8. DOI: 10.1128 / CVI.00035-13.

    4. Uddin T., Aktar A., ​​Xu P., Johnson RA, Rahman MA, Leung DT, Afrin S., Akter A., ​​Alam MM, Rahman A., Chowdhuty F., Khan AI, Bhuiyan TR, Bufano MK , Rashu R., Yu Y., Wu-Freeman Y., Harris JB, LaRocque RC, Charles RC, Covac P., Calderwood SB, Ryan ET, Qadri F. Immune responses to O-spesific polysaccharide and lipopolysaccharide of Vibrio cholerae O1 Ogawa in adult Bangladeshi recipients of an oral killed vaccine and comparison to responses in patients with cholera. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2014; 90 (5): 873-81. DOI: 10.4269 / ajtmh.13-0498.

    5. Darveau R.P., Hancock R.E. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella thyphimurium strains. J. Bacteriol. 1983; 155 (2): 831-8. PMID: 6409884. PMCID: PMC217756.

    6. Polunina T.A., Guseva N.P., Kuz'michenko I.A., Devdariani Z.L Zadnova S.P., Stepanov A.V., Kireev M.N. [Method for the production of lipopolysaccharide of plague agent]. RF Patent No 2483112, published on May 27, 2013.

    7. Markov E.Yu., Nikolaev V.B. [Method for the production of bacterial lipopolysaccharides]. RF Patent No 2051969, published on January 10, to6. Bulletin No 1.

    8. Westphal V.O., Luderitz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bacterien mit Phenol / Wasser. Zeitschrift fur Naturforschung B. 1952; 7 (3): 148-55. DOI: 10.1515 / znb-1952-0303.

    9. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A New method for the extraction of R lipopolysaccharides. Eur. J. Biochem. 1969; 9 (2): 245-9. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1969.tb00601.x.

    10. Lomov Yu.M., Terent'ev A.N., Karbyshev G.L. [Prospects of creation of preparations for indication of particularly dangerous infections agents and other relevant infections]. In: [Proceedings of the IX Assembly of the All-Russian Scientific-and-Practical Society of Epidemiologists, Microbiologists, and Parasitologists]. Moscow: "Sanepidemiya" LLC; 2007. P. 60-1.

    11. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous infectious Diseases. Practice Guidelines]. 2nd edition, revised and updated. Moscow: CJSC "Shiko"; 2013. 560 p.

    12. Lowry O.H., Rosebrough N.J. Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1): 265-75.

    13. [Determination of nucleic acids in immunobiological drugs, using Spirin's methodology. General Monograph 1.7.2.0018.15]. (Cited 15 June 2019). [Internet]. Available from: https://pharma-copoeia.ru/ofs-1-7-2-0018-15-opredelenie-nukleinovyh-kislot-po-metodu-spirina-v-immunobiologicheskih-lekarstvennyh-preparatah/ ofs-1-7 -2-0018-15-opredelenie-nukleinovyh-kislot-po-metodu-spirina-v-immunobiologicheskih-lekarstvennyh-preparatah /.

    14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5. DOI: 10.1038 / 227680a0 /.

    15. Ramamurthy T., Das B., Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Sack D.A. Diagnostic techniques for rapid detection of Vibrio cholerae O1 / O139. Vaccine. 2019; pii: S0264-410X (19) 31020-5. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2019.07.099.

    16. Vlasov V.V. [Epidemiology: Learning Guide for Higher Educational Institutions]. Moscow: "GEOTAR-MED"; 2006. 462 p.

    Authors:

    Larionova L.V., Simakova D.I., Narkevich A.N., Arkhangel'skaya I.V., Shubin G.G. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M.Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation. E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її..

    Про авторів:

    Ларіонова Л.В., Сімакова Д.І., Наркевич А.Н., Архангельська І.В., Шубін Г.Г. Ростовський-на-Дону науково-дослідний протичумний інститут. Російська Федерація, 344002, Ростов-на-Дону, вул. М.Горького, 117/40. E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її..

    Надійшла 22.07.19. Відправлена ​​на доопрацювання 24.10.19.

    Прийнята до публ. 28.11.19.


    Ключові слова: VIBRIO CHOLERA /ліпополісахаридом /ПОЛІМЕРНІ МІКРОСФЕРИ /діагностикумів /АНАЛІТИЧНА ЧУТЛИВІСТЬ /АНАЛІТИЧНА СПЕЦИФІЧНІСТЬ /LIPOPOLYSACCHARIDE /POLYMERIC MICROSPHERES /DIAGNOSTICUM /ANALYTICAL SENSITIVITY /ANALYTICAL SPECIFICITY

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити