Висока генетична мінливість вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1) призводить до по стояв появи нових генетичних варіантів, до числа яких належить рекомбінантний вірус CRF63_02A1, широко поширений на території Сибірського федерального округу Росії. нами вивчена інтеграли CRF63_02A1 ВІЛ-1, що каталізує вбудовування вірусної ДНК в геном инфициро ванній клітини. Проведено дизайн консенсусної послідовності, отриманий препарат рекомбінантної ін тегрази і охарактеризована її ДНК-зв'язує і каталітична активність. стабільність комплексу інтеграли CRF63_02A1 з ДНК-субстратом така ж, як у комплексів Інтеграза підтипів А і В, проте ско кість його освіти істотно вище. Більш високими виявилися швидкості та ефективності реакцій, каталізуються цієї інтегразою: 3'-процесингу і перенесення ланцюга. Це може бути пов'язано з характерними для інтеграли CRF63_02A1 амінокислотними замінами в N-кінцевому домені, що відіграє важливу роль в мультімерізаціі ферменту і його зв'язуванні з ДНК-субстратом. Встановлено також, що мутації лікарські жавної стійкості Q148K / G140S і G118R / E138K істотно знижують каталітичну активність інтеграли CRF63_02A1 і її чутливість до інгібітору інтеграції ралтегравіра. При цьому найбільш сильне зниження чутливості забезпечує подвійна мутація Q148K / G140S.

Анотація наукової статті з хімічних наук, автор наукової роботи - Агапкина Ю.Ю., Пустоварова М.А., Корольов С.П., Зирянова Д.П., Івлєв В.В.


Consensus Integrase of a New HIV-1 Genetic Variant CRF63_02A1

The high genetic variability of the human immunodeficiency virus (HIV-1) leads to a constant emergence of new genetic variants, including the recombinant virus CRF63_02A1, which is widespread in the Siberian Federal District of Russia. We studied HIV-1 CRF63_02A1 integrase (IN_CRF) catalyzing the incorporation of viral DNA into the genome of an infected cell. The consensus sequence was designed, recombinant integrase was obtained, and its DNA-binding and catalytic activities were characterized. The stability of the IN_CRF complex with the DNA substrate did not differ from the complex stability for subtype A and B integrases; however, the rate of complex formation was significantly higher. The rates and efficiencies of 3'-processing and strand transfer reactions catalyzed by IN_CRF were found to be higher, too. Apparently, all these distinctive features of IN_CRF may result from specific amino acid substitutions in its N-terminal domain, which plays an important role in enzyme multimerization and binding to the DNA substrate. It was also found that the drug resistance mutations Q148K / G140S and G118R / E138K significantly reduce the catalytic activity of IN_CRF and its sensitivity to the strand transfer inhibitor raltegravir. Reduction in sensitivity to raltegravir was found to be much stronger in the case of double-mutation Q148K / G140S.


Область наук:

  • хімічні науки

  • Рік видавництва: 2019


    Журнал: Acta Naturae (російськомовна версія)


    Наукова стаття на тему 'Консенсусна інтеграли нового генетичного варіанту CRF63_02A1 ВІЛ-1'

    Текст наукової роботи на тему «Консенсусна інтеграли нового генетичного варіанту CRF63_02A1 ВІЛ-1»

    ?ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ

    УДК 577.151.45: 578.287

    Консенсусна інтеграли нового генетичного варіанту CRF63_02A1 ВІЛ-1

    Ю. Ю. Агапкіна1,2, М. А. Пустоварова1,2, С. П. Королев1,2, Д. П. Зирянова3, В. В. Івлев3, А. В. Тотменін3, Н. М. Гашнікова3, М. Б. Готтіх1,2 *

    Московський державний університет ім. М.В. Ломоносова, хімічний факультет, 119991, Москва, Ленінські гори 1, стор. 3

    2Научно-дослідний інститут фізико-хімічної біології ім. А.Н. Білозерського Московського державного університету ім. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленінські гори 1, стор. 40

    Державний науковий центр вірусології та біотехнології «Вектор» Росспоживнагляду,

    630559, Кольцово Новосибірської обл.

    * E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Надійшла до редакції 12.10.2018

    Прийнята до друку 21.01.2019

    РЕФЕРАТ Висока генетична мінливість вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1) призводить до постійного появи нових генетичних варіантів, до числа яких належить рекомбінантний вірус CRF63_02A1, широко поширений на території Сибірського федерального округу Росії. Нами вивчена інтеграли CRF63_02A1 ВІЛ-1, що каталізує вбудовування вірусної ДНК в геном інфікованої клітини. Проведено дизайн консенсусної послідовності, отриманий препарат рекомбінантної ін-тегрази і охарактеризована її ДНК-зв'язує і каталітична активність. Стабільність комплексу інтеграли CRF63_02A1 з ДНК-субстратом така ж, як у комплексів Інтеграза підтипів А і В, проте швидкість його утворення істотно вище. Більш високими виявилися швидкості та ефективності реакцій, каталізуються цієї інтегразою: З'-процесингу і перенесення ланцюга. Це може бути пов'язано з характерними для інтеграли CRF63_02A1 амінокислотними замінами в N-кінцевому домені, що відіграє важливу роль в мультімерізаціі ферменту і його зв'язуванні з ДНК-субстратом. Встановлено також, що мутації лікарської стійкості Q148K / G140S і G118R / E138K істотно знижують каталітичну активність інтеграли CRF63_02A1 і її чутливість до інгібітору інтеграції ралтегравіра. При цьому найбільш сильне зниження чутливості забезпечує подвійна мутація Q148K / G140S.

    КЛЮЧОВІ СЛОВА вірус імунодефіциту людини, генетичний варіант CRF63_02A1, інтеграли, інгібітор перенесення ланцюга, мутації лікарської стійкості.

    СПИСОК СКОРОЧЕНЬ ВІЛ-1 - вірус імунодефіциту людини типу 1; ІН - інтеграли; ІН_CRF - консенсусна інтеграли генетичного варіанту CRF63_02A1 ВІЛ-1; ІН_А - консенсусна інтеграли підтипу А ВІЛ-1 штами FSU-A; ІН_В - інтеграли підтипу В ВІЛ-1 штами HXB-2; CRF - циркулюючі рекомбінантні форми ВІЛ-1; URF - унікальні рекомбінантні форми ВІЛ-1; IC50 - концентрація інгібітора, переважна активність ферменту на 50%; FC - зміна величини IC50 мутантних білків у порівнянні з диким типом; ОТ-ПЦР - полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією; ДСН -додецілсульфат натрію; ПААГ - поліакріламідний гель; DTT - дітіотреїтолу.

    ВСТУП

    Вірус імунодефіциту людини першого типу (ВІЛ-1) має високу генетичною мінливістю, що призводить до існування різних його підтипів, що циркулюють рекомбінантних форм (СRF) і унікальних рекомбінантних форм (URF) [1]. Широке різноманітність генетичних варіантів ВІЛ-1 формується за рахунок високої швидкості

    реплікації, схильності до рекомбінації і помилок в роботі зворотної транскриптази [2-4]. Різні підтипи ВІЛ-1 мають певний географічний розподіл. На території колишнього СРСР переважає підтип А [5, 6], але присутні і різні СRF [7-9]. З 2010-2012 рр. на територіях країни з найбільшими темпами розвитку епідемії - Кемеровської, Новосибірської, Томської обла-

    стей, Алтайського краю - домінує генетичний варіант CRF63_02A1 [10-12], який через свого швидкого поширення потребує поглибленого вивчення.

    Важливим етапом дослідження нової форми вірусу є характеристика його ферментів, один з яких - інтеграли (ІН), каталізує вбудовування вірусної ДНК в геном зараженої клітини [13]. У клінічній практиці використовують три інгібітора ІН: ралтегравір, елвітегравіра і долутегравір [14], до яких, однак, розвивається стійкість вірусу [15, 16]. Відомо, що як мутації лікарської стійкості, так і механізми їх виникнення у вірусів різних підтипів можуть відрізнятися [тисячі сімсот двадцять дві]. У зв'язку з цим актуально вивчення впливу природного поліморфізму ІН на її властивості.

    У даній роботі охарактеризована ІН генетичного варіанту CRF63_02A1 ВІЛ-1 ^^ CRF) і проведено її порівняння з ІН ВІЛ-1 підтипу А (ІН_А), також широко поширеного на території Росії. Робота включає вивчення впливу структурних відмінностей між ферментами на їх ДНК-зв'язує і каталітичну активність. Вивчено також вплив мутацій стійкості до застосовуваних на практиці інгібіторів інтеграції на каталітичну та ДНК-зв'язує активності ІН_CRF, а також на її чутливість до інгібітору ралтегравіра.

    ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

    Дизайн консенсусної послідовності M ^ CRF

    Підтип ВІЛ-1 визначали з використанням філогенетичного, рекомбінаційного аналізу як описано раніше [10, 11, 23]. Консенсусна послідовність ІН створена з використанням програмного забезпечення BioEdit (Ibis Biosciences, США).

    РНК ВІЛ-1 виділяли з використанням набору РеалБест ДельтаМаг ВГВ / ВГС / ВІЛ (АТ «Вектор-Бест», Росія) з 250 мкл двох клінічних зразків плазми крові пацієнтів, інфікованих вірусом, у якого ген ІН має максимальну схожість з розрахованої консенсусної нуклеотидной послідовністю гена ІН_CRF. Кодують ІН фрагменти ДНК розміром 878 п.н., доповнені сайтами рестрикції для подальшого клонування, отримували за допомогою ЗТ-ПЛР, використовуючи комерційний набір LongRange 2Step RT-PCR (Qiagen, США).

    Отримання вектора для експресії ІН_CRF

    Фрагменти ДНК, що кодують ІН_CRF, вбудовували в плазміду pCR_2.1Topo з використанням комерційного набору TOPO® TA Cloning® Kit

    (PCR ™ 2.1-TOPO®, Thermo Fisher Scientific Inc., США). Плазмідну ДНК з плазмід pCR_2.1Topo_ ІН, по 30 мкг для кожного зразка ВІЛ-1, виділяли за допомогою комерційного набору Plasmid Purification Mini Kit (Qiagen, США). За результатами секвенування гена ІН обрана плазмида pCR_2.1Topo_ІН_CRF *, яка містить послідовність ІН, що відрізняється від консенсусної двома амінокислотними замінами, для субклонірованія в експресуючий вектор pET_15b, в структуру якого входить гистидинового таг (His-tag) (Novagen, США).

    Вектор pET_15b_ІН_CRF з консенсусної послідовністю ІН_CRF отримували, послідовно вводячи мутації, що призводять до амінокислотним замін I32V і I259V в вектор pET-15b_ІН_CRF *. Конструкції, що кодують ІН з замінами Q148K / G140S і G118R / E138K, отримували сайт-спрямованим мутагенезу плазми-ди pET_15b_ІН_CRF з використанням набору QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies, США).

    Плазмида pET_15b, що містить ген консенсусної ІН_А, люб'язно надана М.Г. Бєлікової-Ісагулянц (НДІ вірусології ім. Д. І. Івановського, Росія).

    Отримання рекомбінантних білків

    Препарати білків ІН_А і ІН_CRF з конс-Сусне послідовностями і з мутаціями Q148K / G140S і G118R / E138K виділяли з клітин штаму-продуцента Rosetta (DE3) Escherichia coli і очищали згідно [24, 25]. Білки аналізували методом електрофорезу в 12% ПААГ за Леммлі з подальшим фарбуванням SimplyBlueTM SafeStain (Invitrogen, США).

    олігодезоксирибонуклеотиди

    Олігодезоксирибонуклеотиди U5B (5'-GTGTGGA-AAATCTCTAGCAGT-3 '), U5B із залишком Флу-оресцеіна на 5'-кінці (5'-Fl-U5B), U5B-2 (5'-GTGTGGAAAATCTCTAGCA-3') і U5A (5 '-ACTGCTAGAGATTTTCCACAC-3'), що формують ДНК-субстрати ІН, і все праймери ( «ДНК-синтез», Росія).

    Радіоактивну 32Р-мітку вводили на 5'-кінець олігонуклеотидів U5B і U5B-2 і формували ДНК-субстрати ІН як описано в [25].

    Аналіз ДНК-зв'язуючої активності інтеграли

    Вивчення швидкості зв'язування ІН з ДНК-субстратом методом поляризації флуоресценції проводили на Спектрофлуориметр Cary Eclipse (Varian, США) за методикою [26]. Дуплекс 5'-Fl-

    U5B / U5A (10 нМ) змішували з 100 нМ ІН в 200 мкл буфера А (20 мМ HEPES (pH 7.2), 10 мМ DTT, 7.5 мМ MgCl2) і вимірювали значення поляризації флуоресценції флуоресцеїну (X = 492 нм, к = 520 нм ) через певні проміжки часу при 25 ° С. Будували криву залежності зміни поляризації флуоресценції від часу і визначали константу швидкості зв'язування (k) ІН з субстратом відповідно до рівняння [IN / DNA] = [DNA] 0 х (1 - e-kon>t) [27].

    Визначення Kd комплексу ІН з субстратом проводили методом DRaCALA (Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay) [28]. Дуплекс 5'-32P-U5B / U5A (5 нМ) інкубували з ІН в концентрації від 0 до 500 нМ в 10 мкл буфера А протягом 20 хв при 25 ° С. За 5 мкл суміші наносили на нітро-целюлозний мембрану Amersham ™ HybondTM-ECL. Мембрану візуалізували на приладі Typhoon FLA 9500 PhosphorImager (Molecular Dynamics, США).

    Визначення каталітичної активності інтеграли

    Для реакції З'-кінцевого процесингу 5 нМ дуплекс 5'-32P-U5B / U5A інкубували з 100 нМ ІН в буфері А як описано в [25]. ДНК брали в облогу і аналізували електрофорезом в 20% денатурує ПААГ. Гель візуалізували на приладі Typhoon FLA 9500 PhosphorImager (Molecular Dynamics, США). За співвідношенням інтенсивностей випромінювання смуг, відповідних U5B і U5B-2, визначали ефективність процесингу з використанням програми Quantity One 4.6.6. (Bio-Rad Laboratories, США).

    При аналізі кінетики накопичення продуктів З'-процесингу реакційну суміш інкубували при 37 ° С від 5 хв до 7 ч, будували графіки залежності ефективності реакції від часу, визначали початкову швидкість реакції по куту нахилу початкового ділянки кривої (~ 60 хв).

    Залежність ефективності З'-процесингу від концентрації субстрату визначали, варіюючи концентрацію ДНК (0; 2.5; 4; 10; 20; 50; 100 нМ). Будували графіки залежності ефективності реакції від концентрації субстрату, визначали максимальну швидкість реакції (V) і константу Міхаеліса (KM).

    Для реакції перенесення ланцюга 10 нМ ДНК-дуплекс [5'-32P] -U5B-2 / U5A інкубували з 100 нМ ІН в буфері А протягом 2 і 4 ч при 37 ° С. Виділення і аналіз продуктів реакції проводили як описано вище.

    Інгібування перенесення ланцюга

    Реакцію перенесення ланцюга проводили як описано вище протягом 2 ч в присутності зростаючих

    концентрацій інгібітору (ралтегравір, Santa Cruz Biotechnology Inc., США). За результатами трьох незалежних експериментів визначали значення IC.

    РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

    Дизайн консенсусної послідовності MH_CRF і отримання білка

    Послідовності гена ІН отримані з 324 зразків ВІЛ-1, виділених на територіях Сибірського (250) і Уральського (74) федеральних округів Росії від ВІЛ-інфікованих, які не отримували Антіріо-тровірусную терапію. Філогенетичний аналіз показав, що вибірка вірусних послідовностей, включених в дослідження, містила генетичні варіанти підтипів А (24.3%) і В (3.3%), а також рекомбінантні форми CRF63_02A1 (55.3%) і різні URF, утворені в результаті вторинної рекомбінації вірусів CRF63_02A1 і підтипу А (6.7%).

    Проведено множинне вирівнювання ідентифікованих нуклеотиднихпослідовностей ІН_CRF, трансляція, побудова амінокислотної консенсусної послідовності і її вирівнювання з послідовностями ІН підтипів А і В (рис. 1). Виявлено мутації, характерні для цього ге-новаріанта вірусу: E11D (в 93.8% випадків), K14R (81.3%), S24N (100%) і M50I (75%). Заміна L74I, специфічна для ІН_А, знайдена лише в 4% випадків ІН_CRF.

    Серед досліджених послідовностей ВІЛ-1 відібраний варіант, послідовність ІН у якого максимально близька до консенсусної ІН_CRF ВІЛ-1. Напрацювання цільового фрагмента ДНК ІН_CRF і послідовні клонування дозволили отримати експресуючий вектор pET- ^ b ^ H ^^ RF *, введення замін I32V і I259V в який призвело до отримання вектора pET- ^ b ^ M ^^ RF з консенсусної послідовністю ІН. На його основі отримані конструкції, що містять мутації лікарської стійкості, - G118R / E138K і Q148K / G140S. Отримані вектори використовувалися для Прокар-ної експресії білків з подальшим очищенням на Ni-NTA-агарозе. Ступінь чистоти одержаних препаратів ІН не менше 90% (рис. 2).

    Характеристика ДНК-зв'язуючої активності MH_CRF

    Ретровірусних інтегрази в процесі функціонування зв'язуються з кінцями вірусної ДНК, а потім взаємодіють з клітинної ДНК, причому останнім взаємодія не є специфічним до послідовності [29]. Рекомбінантна ІН ВІЛ-1 зазвичай має однакову спорідненість до ДНК-дуплекс

    ІН_CRF63_02A1

    ІН_А

    ІН В

    ІН_CRF63_02A1

    ІН_А

    ІН_В

    ІН_CRF63_02A1

    ІН_А

    ІН_В

    ІН_CRF63_02A1

    ІН_А

    ІН_В

    ІН_CRF63_02A1

    ІН_А

    ІН_В

    FLDGIDKAQE FLEGIDKAQE FLDGIDKAQE

    HGQVDCSPGI HGQVDCSPGI HGQVDCSPGI

    11 14

    DHERYHSNWR EHEKYHSNWK EHEKYHSNWR N

    WQLDCTHLEG WQLDCTHLEG WQLDCTHLEG

    i] 3 119

    CRF63_02A1 LLKLAGRWPV KVVHTDN G PN

    А LLKLAGRWPV KVVHTDN G PN

    У LLKLAGRWPV KTVHTDN G SN

    24 32

    AMANDFNLPP IVAKEIVASC AMASDFNLPP IVAKEIVASC AMASDFNLPP VVAKEIVASC кінцевий домен

    72

    KIILVAVHVA SGYIEAEVIP KVIIVAVHVA SGYIEAEVIP KVILVAVHVA SGYIEAEVIP

    138 н

    FTSSAVKAAC WWANIQQI: ElG FTSSAVKAAC WWAMIQQEFG FTSTTVKAAC WWAGIKQEinG

    DKCQLKGEAI DKCQLKGEAM DKCQLKGEAM

    AETGQETAYF

    AETGQETAYF AETGQETAYF

    0 148

    IPYNPQS IPYNPQS IPYNPQS

    QGV QGV QGV

    VESMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG IGGYSAGERI VESMNKELKK IIGQVREQAE HLKTAVQMAV FIHHFKRKGG IGGYSAGERI IESMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG IGGYSAGERI

    IDIIATDIQT IDIIATDIQT VDIIATDIQT

    259

    IQDNNDIKVV IQDNNDIKVV IQDNSDIKVV

    KELQKQITKI QHFRVYYRDS RDPIWKGPAK LLWKGEGAVV KELQKQIIKI QHFRVYYRDS RDPIWKGPAK LLWKGEGAVV KELQKQITKI QNFRVYYRDS RDPVWKGPAK LLWKGEGAVV

    PRRKAKIIRD YGKQMAGDDC VASRQDED PRRKAKIIRD YGKQMAGDDC VASRQDED PRRKAKIIRD YGKQMAGDDC VASRQDED

    Мал. 1. Амінокислотні послідовності ІН_CRF, ІН_А і ІН_В. Амінокислотні залишки, характерні для ІН_CRF, виділені жирним шрифтом і підкреслені, для інших підтипів підкреслені; прямокутниками показані амінокислоти, мутації яких призводять до появи лікарської стійкості вірусу, червоним кольором - амінокислоти каталітичного домену

    різної структури [30]. Ми оцінювали здатність ІН_CRF пов'язувати 21-ланки ДНК-субстрат, що представляє собою кінцеву послідовність ділянки U5 LTR вірусної ДНК. Паралельно проводили експерименти з ІН_А.

    Стабільність комплексів визначали методом DRaCALA (Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay) [28], раніше успішно використаним для характеристики комплексів ІН_В з ДНК [31]. Значення Kd комплексів ІН / ДНК виявилися порівнянними в разі ІН_CRF і ІН_А (рис. 3A і табл. 1), а також ІН_В [32].

    Кінетику зв'язування ІН з субстратом вивчали за допомогою методу поляризації флуоресценції. Як ДНК-субстрату використовували флуоресцентно мічений дуплекс 5'-Fl-U5B / U5A. Швидкість зв'язування ДНК у ІН_CRF виявилася вищою, ніж у ІН_А, константи швидкості зв'язування (к) у них розрізнялися в 2.8 рази (рис. 3Б і табл. 1). При цьому константа швидкості зв'язування k для ІН_А (0.24 хв-1) близька до значення, отриманого раніше для ІН_В (0.18 хв-1) [27].

    Послідовності ІН підтипів А і В ВІЛ-1 відрізняються 16 амінокислотними залишками, з яких 11 знаходяться в каталітичному, два - в С-кінцевому і три - в N-кінцевому домені, причому останні три заміни синонімічні: D3E, R20K, V31I (рис. 1). ІН_CRF відрізняється від ІН_А

    MW, кДа

    250

    170

    130 mm

    100 mm

    70 mm

    55 -

    35 mm

    25 mm

    15

    Мал. 2. Поділ препаратів консенсусної ІН_CRF і її мутантних форм G118R / E138K і Q148K / G140S електрофорезом в ДСН-ПААГ по Леммлі. 1 - ІН_CRF; 2 - ІН_А; 3 - ІН_CRF ^ 1 ^ / Е138К); 4 - ІН_CRF ^ 148К ^ 140б); MW - маркер молекулярних мас

    і ІН_В 4 унікальними амінокислотними замінами Е1Ш, K14R, S24N і М501 в ^ кінцевому домені (рис. 1). З огляду на, що швидкості зв'язування ДНК-субстрату з ІН_А і ІН_В можна порівняти, а з ІН_CRF істотно розрізняються, можна припустити,

    2

    3

    4

    [ІН], нМ

    Час, хв

    Мал. 3. Порівняння ДНК-зв'язуючих активностей ІН_CRF і ІН_А. Наведено середні значення як мінімум трьох незалежних вимірювань, при яких стандартне відхилення не перевищувало 15%. А - залежність концентрації комплексу ІН / ДНК-субстрат від концентрації ІН. Б - кінетика зміни поляризації флуоресценції ДНК-субстрату при зв'язуванні Сін CRFіІН А

    що на цю швидкість впливає головним чином структура N-кінцевого домену ІН. Цей домен визначає мультімерной стан ІН, важливе для її каталітичної активності [33], і бере участь у зв'язуванні ІН з ДНК-субстратом (вірусної ДНК) [3436]. У структурі ІН_CRF в першу чергу звертають на себе увагу заміни S24N і M50I. Наявність амидной групи в Asn і розгалуженої ланцюга Ile може впливати на межсуб'едінічние взаємодії при утворенні каталитически активного стану ІН. Крім цього, К14 безпосередньо контактує з вірусною ДНК і відіграє важливу роль в процесі мультімерізаціі ІН [35, 37]. У ІН_CRF в положенні 14 замість Lys знаходиться Arg. Хоча обидві ці амінокислоти позитивно заряджені, залишок Arg більш об'ємний, менш гідрофобний і володіє більш високим pKa, ніж Lys [38, 39]. Для Arg також характерна делокализация позитивного заряду

    Таблиця 1. ДНК-зв'язує і каталітична активність ІН CRFіІН А

    характеристика ІН_А

    Kd, нМ d '23 ± 6 25 ± 7

    k, хв-1 * on '0.69 ± 0.09 0.24 ± 0.02

    Відносна ефективність З'-процесингу,% ** 100 71

    V0 (З'-процесинг), пмоль / хв * 19.3 ± 2.1 9.8 ± 2.3

    V, пМ / хв * max '' 26 ± 1 16 ± 1

    Km, нМ * 2.6 ± 0.3 4.6 ± 0.8

    Vmax / KMXl0 ^ хв-1 * 10 ± 1 3.5 ± 0.6

    Відносна ефективність перенесення ланцюга,% ** 100 77

    V0 (перенесення ланцюга), пмоль / хв * 11.4 ± 3.2 6.5 ± 2.8

    Примітка. Наведено середні значення як мінімум трьох незалежних вимірювань зі стандартним відхиленням. * Р < 0.05.

    "Ефективність реакції через 300 хв щодо ефективності реакції для консенсусної ІН_CRF, прийнятої за 100%.

    по гуанідинового угрупованню і можливість освіти множинних водневих зв'язків в різних напрямках [40, 41], що може сприяти зв'язуванню ДНК-субстрату.

    Таким чином, амінокислотні заміни, в силу природного поліморфізму властиві ІН_CRF, не позначаються на стабільності її комплексу з ДНК-субстратом, але при цьому істотно впливають на швидкість його утворення.

    Характеристика каталітичної активності ІН_CRF

    У процесі реплікації вірусу ІН здійснює дві послідовні реакції: З'-кінцевий процесинг, при якому відбувається відщеплення динуклеотид GT з З'-решт вірусної ДНК, і перенесення ланцюга, який полягає у встановленні процессірованной вірусної ДНК в клітинну ДНК. Обидві ці реакції можна імітувати in vitro за стандартними методиками [25]. Для проведення реакції З'-процесингу як аналог вірусної ДНК використаний стандартний дуплекс [5'-32P] -U5B / U5A, радіоактивно мічений по 5'-кінця процессіруемой ланцюга U5B, яка в результаті реакції перетворювалася в продукт, укорочений на два нуклеотиду. В реакції перенесення ланцюга в якості і субстрату, і мішені використовувався дуплекс [5'-32P] -U5B-2 / U5A, в якому

    ь

    т

    з а

    о г

    н в н і

    і з

    т з

    до е

    е ц

    ф ф о р п

    -3 '

    40

    20

    Л

    - ІН_CRF63_02A1 ИН А

    100 200 300 Час, хв

    400

    Мал. 4. Залежність ефективності реакції 3'-про-цессінга, катализируемой ІН_СкР і ІН_А, від часу. Наведено середні значення як мінімум трьох незалежних вимірювань, при яких стандартне відхилення не перевищувало 15%

    ІН_CRF63_02A1 ІН_А

    I-

    200

    т

    300

    1

    400

    Час, хв

    - ІН ІН С1 * Р63 02А1 ІН А

    300 360 хв хв

    300 360 хв хв

    0

    0

    Б

    ланцюг і5В вже була вкорочена на два нуклеотиду (і5В-2).

    Вивчення кінетики З'-процесингу показало, що ІН_CRF ефективніше і швидше процесує свій субстрат, ніж ІН_А (рис. 4, табл. 1). З метою більш детального з'ясування причин збільшення ефективності реакції були визначені кінетичні параметри реакції З'-процесингу: Км і

    Виявилося, що Км для ІН_CRF в 1.8 рази нижче, а V в 1.6 рази вище, ніж для ІН_А (табл. 1). Отже, для ІН_CRF характерна більш висока швидкість З'-процесингу, але досягається вона при більш низьких значеннях концентрації субстрату. Відповідно параметр каталітичної ефективності ^^ / К ^) для ІН_CRF виявився майже втричі вище, ніж для ІН_А (табл. 1). Ми вважаємо, що така висока активність ІН_CRF не може пояснюватися тільки більш високою швидкістю зв'язування субстрату (рис. 3), тим більше що константи дисоціації комплексів з ДНК у обох ферментів практично однакові. Як уже згадувалося раніше, ^ кінцевий домен ІН відповідає за її мультімерной стан, яке змінюється при зв'язуванні ІН з ДНК-субстратом [42, 43], в результаті чого формується каталитически активний фермент-субстратної комплекс. Можливо, присутні в ^ кінцевому домені ІН_CRF амінокислотні заміни сприяють утворенню такого комплексу, стимулюючи тим самим більш ефективне протікання реакції.

    При вивченні реакції перенесення ланцюга визначали ефективність і швидкість реакції, а також характер утворених продуктів, що відображає місце вбудовування субстрату в ДНК-мішень.

    Мал. 5. Характеристика реакції перенесення ланцюга, що каталізує ІН_СкР і ІН_А. Л - кінетика реакції перенесення ланцюга. Наведено середні значення як мінімум трьох незалежних вимірювань, при яких стандартне відхилення не перевищувало 15%. Б - продукти реакції перенесення ланцюга в разі ІН_СкР і ІН_А (електрофоретичний аналіз продуктів реакції через 300 і 360 хв)

    Ефективність і швидкість перенесення ланцюга знову виявилися вище у ІН_CRF, а характер продуктів був однаковим (рис. 5). ІН_А і ІН_В розрізнялися характером продуктів перенесення ланцюга [25]. Різні профілі продуктів цієї реакції можуть спостерігатися, якщо по-різному формується комплекс ІН з ДНК-мішенню, в яку відбувається вбудовування субстрату. У зв'язуванні ДНК-мішені беруть участь каталітичний і особливо С-кінцевий домен ІН [36], які у ІН_А і ІН_CRF мають близьку структуру і істотно відрізняються від ІН_В (рис. 1). Таким чином, в комплексі з ІН_CRF ДНК-мішень розташовується аналогічним з ІН_А чином, але відрізняється від розташування в комплексі ДНК з ІН_В.

    ТОМ 11 № 1 (40) 2019 | АСТА ИАТіІАЕ | 19

    Таблиця 2. ДНК-зв'язує і каталітична активність, а також стійкість до ралтегравіра ІН_CRF, ІН_А, їх мутантних форм Q148K / G140S, G118R / E138K

    Характеристика ІН CRF ІН А

    консенсус Q148K / G140S G118R / E138K Консенсус Q148K / G140S * G118R / E138K

    До нМ 2З ± 6 28 ± 9 25 ± 5 25 ± 7 Н.О. н.о.

    У0 (З'-процесинг), пмоль / хв 19.З ± 2.1 2.7 ± 0.4 5.6 ± 1.2 9.8 ± 2.З 2.6 ± 0.1 2.6 ± 0.4

    Відносна ефективність З'-процесингу,% 100 22 З1 100 25 24

    Відносна ефективність перенесення ланцюга,% 100 27 22 100 20 2З

    Ралтегравір 1С50, нМ 7 ± 2 500 ± 50 50 ± З 5 ± 2 400 ± 150 7 ± З

    FC 1 71 7 1 80 1.4

    Примітка. Наведено середні значення як мінімум трьох незалежних вимірювань зі стандартним відхиленням. Н.О. - значення не визначалися. * За даними [25].

    Вплив мутацій лікарської стійкості на активність ІН_CRF і її чутливість до ралтегравіра

    Дані про мутації, що забезпечують його лікарську стійкість, що вивчається нами генетичного варіанту вірусу відсутні, тому ми ввели до складу ІН мутації стійкості до застосовуваних сьогодні інгібіторів інтеграції, відомим для інших підтипів ВІЛ-1. Як мутацій стійкості до ралтегравіра і елвітегравіра були обрані первинна мутація Q148K і компенсаторна до неї вторинна G140S [44, 45]. У разі до-лутегравіра обрані мутації G118R і Е138К [46, 47]. Отримано варіанти ІН_CRF, що містять подвійні заміни Q148K / G140S і G118R / E138K (рис. 2), і досліджено ефективність зв'язування ДНК-субстрату і залежність ефективності -кінці-вого процесингу від концентрації ІН і часу. Виявилося, що введені мутації не впливали на стабільність фермент-субстратного комплексу, але істотно знижували каталітичну активність ферментів (табл. 2). При цьому в разі ІН_CRF з замінами Q148K / G140S втрата активності була більш істотною, ніж у ферменту з замінами G118R / E138K. Початкова швидкість З'-процесингу для мутантних ІН знижувалася в 7.1 і 3.4 рази відповідно в порівнянні з вихідним ферментом. Раніше було показано зниження каталітичної активності ІН_А в реакції З'-процесингу при введенні мутацій Q148K / G140S і G118R / E138K, проте воно було однаковим для обох пар мутацій (в З.8 рази) [25].

    Заміни Q148K / G140S і G118R / E138K істотно знижували і ефективність реакції перенесення ланцюга, що каталізує ІН_CRF (табл. 2), як і в разі ІН_А [25]. Зниження було кілька сильніше в слу-

    чаї пари мутацій G118R / E138K, ніж Q148K / G140S: в 4.6 і З.7 рази відповідно. Цікаво, що в разі ІН_В заміни G118R / E138K вкрай незначно впливали на ефективність переносу ланцюга [25]. Сильний негативний ефект цих мутацій у разі як ІН_CRF, так і ІН_А, пов'язаний, очевидно, з природним поліморфізмом S119P (рис. 1), що призводить до більш жорсткої конформації активного центру і зниженої здатності обох Інтеграза адаптуватися до мутації G118R. Можливо, саме жорстка конформація активного центру обмежує здатність ІН_CRF і ІН_А, несучих заміни G118R / E138K, пов'язувати ДНК-мішень, що виражається в різкому зменшенні кількості продуктів перенесення ланцюга для мутантів G118R / E138K (рис. 6 і [25]). Мутації Q148K / G140S не викликають змін в характері продуктів цієї реакції в порівнянні з вихідною ІН (рис. 6).

    Ми також вивчили чутливість ІН_CRF і її мутантів Q148K / G140S і G118R / E138K до ін-гібірованію ралтегравіра, який застосовується в терапії ВІЛ-інфікованих в Російській Федерації. Виявлено, що ІН_CRF ефективно відзначено зниження ралтегравіра (табл. 2), значення 1С50 близько до значень, отриманих раніше для ІН_А і ІН_В [25]. Введення мутацій стійкості Q148K / G140S, виявлених у інших підтипів вірусу, призводило до виникнення стійкості і ІН_CRF. Ми спостерігали 70-кратне збільшення значення 1С, що узгоджується з отриманими раніше даними для ІН_А [25]. Мутації G118R / E138K також знижували чутливість ІН_CRF до ралтегравіра, проте не так значно ^ С = 7, табл. 2). Слід зазначити, що в разі ІН_А з мутаціями G118R / E138K практично не спостерігалося зниження чутливості до ралтегравіра [25].

    12 3 4

    Мал. 6. Електрофоретичний аналіз продуктів реакції перенесення ланцюга, що каталізує ІН_СкР (доріжка 2) і її мутантами G118R / E138K (доріжка 3) і Q148K / G140S (доріжка 4) (час реакції 300 хв). Доріжка 1 - контроль без додавання ІН. Над гелем вказана ефективність реакції

    ВИСНОВОК

    У даній роботі вперше виділена і охарактеризована рекомбинантная ІН ВІЛ-1 нового генетичного варіанту CRF63_02A1, стрімко поширюється на території Сибіру. встановлено,

    що ІН_CRF швидше і ефективніше, ніж ІН підтипу А, каталізує реакції З'-процесингу і перенесення ланцюга. Очевидно, високі швидкості обох реакцій забезпечуються як більш швидким зв'язуванням ДНК-субстрату, так і більш високою каталітичної ефективністю, характерними для ІН_CRF. Мабуть, всі ці зміни пояснюються амінокислотними замінами Е1Ш, K14R і S24N, М501, розташованими в ^ кінцевому домені ІН_CRF, який грає важливу роль в мультімерізаціі ферменту і зв'язуванні вірусної ДНК. При цьому через відсутність значущих відмінностей в каталітичних і С-кінцевих доменах ІН_CRF і ІН_А набір продуктів перенесення ланцюга, що характеризує спосіб позиціонування ДНК-мішені в активному центрі фермент-субстратного комплексу, у цих ферментів не змінюється.

    Отримані результати дозволяють припустити, що стійкість генетичного варіанту ВІЛ-1 CRF63_02A1 до вживаного інгібітору інтеграції ралтегравіра в першу чергу може розвиватися по шляху виникнення мутацій Q148K / G140S, як це описано для інших підтипів [48]. Введення цих мутацій до складу ІН_CRF призвело до 70-кратного зростання стійкості до дії інгібітора в порівнянні з вихідним ферментом. Мутації G118R / E138K збільшували стійкість ІН_CRF до ралтегравіра всього в 7 разів. •

    Робота підтримана Російським науковим фондом (грант № 16-15-10238).

    СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

    1. Foley B., Leitner T., Apetrei C., Hahn B., Mizrachi I., Mullins J., Rambaut A., Wolinsky S., Korber B. Theoretical Biology and Biophysics Group. Los Alamos: Los Alamos National Laboratory, 2013. https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ HIV / CRFs / CRFs.html

    2. Onafuwa-Nuga A., Telesnitsky A. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2009. V. 73. № 3. P. 451-480.

    3. Li G., Piampongsant S., Faria N.R., Voet A., Pineda-Pena A.C., Khouri R., Lemey P., Vandamme A.M., Theys K. // Retrovirol-ogy. 2015. V. 12. P. 18.

    4. Hemelaar J. // Trends Mol. Med. 2012. V. 18. № 3. Р. 182-192.

    5. Diez-Fuertes F., Cabello M., Thompson M.M. // Infect. Genet. Evol. 2015. V. 33. P. 197-205.

    6. Foley B.T., Leitner T., Paraskevis D., Peeters M. // Infect. Genet. Evol. 2016. V. 46. P. 150-158.

    7. Bobkova M. // AIDS Rev. 2013. V. 15. № 4. Р. 204-212.

    8. Baryshev P.B., Bogachev V.V., Gashnikova N.M. // Russia Arch. Virol. 2012. V. 157. № 12. P. 2335-2341.

    9. Baryshev P.B., Bogachev V.V., Gashnikova N.M. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2014. V. 30. № 6. P. 592-597.

    10. Gashnikova N.M., Bogachev V.V., Baryshev P.B., Totmenin A.V., Gashnikova M.P., Kazachinskaya A.G., Ismailova T.N.,

    Stepanova S.A., Chernov A.S., Mikheev V.N. // Russia AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2015. V. 31. № 4. P. 456-460.

    11. Gashnikova N.M., Zyryanova D.P., Astakhova E.M., Ivlev V.V., Gashnikova M.P., Moskaleva N.V., Aikin S.S., Bulatova T.N., Pustylnikov S.V., Bocharov E.F., Totmenin A.V. // Arch. Virol. 2017. V. 162. № 2. P. 379-390.

    12. Kazennova E., Laga V., Lapovok I., Glushchenko N., Neshu-maev D., Vasilyev A., Bobkova M. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2014. V. 30. № 8. P. 742-752.

    13. Krishnan L., Engelman A. // J. Biol. Chem. 2012. V. 287. № 49. P. 40858-40866.

    14. Lennox J.L. // Curr. Opin. HIV AIDS. 2012. V. 7. № 5. P. 409-414.

    15. Quashie P.K., Mesplede T., Wainberg M.A. // Curr. Opin Infect. Dis. 2013. V. 26. № 1. P. 43-49.

    16. Anstett K., Brenner B., Mesplede T., Wainberg M.A. // Ret-rovirology. 2017. V. 14. № 1. P. 36.

    17. Maiga I., Malet I., Soulie C., Derache A., Koita V., Amellal B., Tchertanov L., Delelis O., Morand-Joubert L., Mouscadet J.F., et al. // Antivir. Ther. 2009. V. 14. № 1. P. 123-129.

    18. Brenner B.G., Lowe M., Moisi D., Hardy I., Gagnon S., Cha-rest H., Baril J.G., Wainberg M.A., Roger M. // J. Med. Virol. 2011. V. 83. № 5. P. 751-759.

    19. Bar-Magen T., Donahue D.A., McDonough E.I., Kuhl B.D., Faltenbacher V.H., Xu H., Michaud V., Sloan R.D., Wainberg M.A. // AIDS. 2010. V. 24. № 14. P. 2171-2179.

    20. Quashie P.K., Oliviera M., Veres T., Osman N., Han Y.S., Has-sounah S., Lie Y., Huang W., Mesplede T., Wainberg M.A. // J. Virol. 2015. V. 89. № 6. P. 3163-3175.

    21. Depatureaux A., Mesplede T., Quashie P., Oliveira M., Moisi D., Brenner B., Wainberg M. // J. Int. AIDS Soc. 2014. V. 17. № 4. P. 19738.

    22. Depatureaux A., Mesplede T., Quashie P., Oliveira M., Moisi D., Plantier J.C., Brenner B., Wainberg M.A. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2015. V. 70. № 1. P. 9-15.

    23. Gashnikova N.M., Astakhova E.M., Gashnikova M.P., Bocha-rov E.F., Petrova S.V., Pun'ko O.A., Popkov A.V., Totmenin A.V. // Biomed. Res. Int. 2016. V. 2016. Article ID 2496280.

    24. Leh H., Brodin P., Bischerour J., Deprez E., Tauc P., Brochon J.C., LeCam E., Coulaud D., Auclair C., Mouscadet J.F. // Biochemistry. 2000. V. 39. № 31. P. 9285-9294.

    25. Шадріна О.А., Зацепін Т.С., Агапкина Ю.Ю., Ісагулянц М.Г., Готтих М.Б. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 1. P. 43-52.

    26. Deprez E., Barbe S., Kolaski M., Leh H., Zouhiri F., Auclair C., Brochon J.C., Le Bret M., Mouscadet J.F. // Mol. Pharmacol. 2004. V. 65. № 1. P. 85-98.

    27. Smolov M., Gottikh M., Tashlitskii V., Korolev

    S., Demidyuk I., Brochon J.C., Mouscadet J.F., Deprez E. // FEBS J. 2006. V. 273. № 6. P. 1137-1151.

    28. Donaldson G.P., Roelofs K.G., Luo Y., Sintim H.O., Lee V.T. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. № 7. е48.

    29. Khan E., Mack J.P., Katz R.A., Kulkosky J., Skalka A.M. // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. № 4. P. 851-860.

    30. Agapkina J., Smolov M., Barbe S., Zubin E., Zatsepin T., Deprez E., Le Bret M., Mouscadet J.-F., Gottikh M. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 17. P. 11530-11540.

    31. Agapkina J., Yanvarev D., Anisenko A., Korolev S., Vep-salainen J., Kochetkov S., Gottikh M. // Eur. J. Med. Chem. 2014. V. 73. P. 73-82.

    32. Shadrina O., Krotova O., Agapkina J., Knyazhanskaya E., Korolev S., Starodubova E., Viklund A., Lukashov V., Magnani M., Medstrand P., et al. // Biochimie. 2014. V. 102. P. 92-101.

    33. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 24. P. 13659-13664.

    34. Lesbats P., Engelman A.N., Cherepanov P. // Chem. Rev. 2016. V. 116. № 20. P. 12730-12757.

    35. Zhao Z., McKee C.J., Kessl J.J., Santos W.L., Daigle J.E., Engelman A., Verdine G., Kvaratskhelia M. // J. Biol. Chem. 2008. V. 29. № 283. № 9. P. 5632-5641.

    36. Passos D.O., Li M., Yang R., Rebensburg S.V., Ghirlando R., Jeon Y., Shkriabai N., Kvaratskhelia M., Craigie R., Lyumkis

    D. // Science. 2017. V. 355. № 6320. P. 89-92.

    37. McKee C.J., Kessl J.J., Shkriabai N., Dar M.J., Engelman A., Kvaratskhelia M. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 46. P. 31802-31812.

    38. Sokalingam S., Raghunathan G., Soundrarajan N., Lee S.G. // PLoS One. 2012. V. 7. № 7. e40410.

    39. Mant C.T., Kovacs J.M., Kim H.M., Pollock D.D., Hodges R.S. // Biopolymers. 2009. V. 92. № 6. P. 573-595.

    40. Dougherty D.A. // J. Nutr. 2007. V. 137. P. 1504S-1508S.

    41. Chan D.I., Prenner E.J., Vogel H.J. // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1758. P. 1184-1202.

    42. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet J.F., Auclair C., Hawkins M.E., Brochon J.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 18. P. 10090-10095.

    43. Guiot E., Carayon K., Delelis O., Simon F., Tauc P., Zubin

    E., Gottikh M., Mouscadet J.F., Brochon J.C., Deprez E. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 32. P. 22707-22719.

    44. Malet I., Delelis O., Valantin M.A., Montes B., Soulie C., Wirden M., Tchertanov L., Peytavin G., Reynes J., Mouscadet J.-F., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. V. 52. № 4. P. 1351-1358.

    45. Nakahara K., Wakasa-Morimoto C., Kobayashi M., Miki S., Noshi T., Seki T., Kanamori-Koyama M., Kawauchi S., Suyama A., Fujishita T., et al. // Antiviral Res. 2009. V. 81. № 2. P. 141-146.

    46. ​​Quashie P.K., Mesplede T., Han Y.S., Veres T., Osman N., Hassounah S., Sloan R.D., Xu H.T., Wainberg M.A. // Antimicrob. Agents Chemother. 2013. V. 57. № 12. P. 6223-6235.

    47. Wainberg M.A., Han Y.S. // J. Virus Erad. 2015. V. 1. № 1. P. 13-16.

    48. Malet I., Gimferrer Arriaga L., Artese A., Costa G., Parrotta L., Alcaro S., Delelis O., Tmeizeh A., Katlama C., Valantin M.A. // J. Antimicrob. Chemother. 2014. V. 69. № 8. P. 2118-2122.


    Ключові слова: HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS /CRF63_02A1 GENETIC VARIANT /INTEGRASE /STRAND TRANSFER INHIBITOR /DRUG RESISTANCE MUTATIONS /ВІРУС ІМУНОДЕФІЦИТУ ЛЮДИНИ /ГЕНЕТИЧНИЙ ВАРІАНТ CRF63_02A1 /Інтеграза /ІНГІБІТОР ПЕРЕНЕСЕННЯ ЦЕПИ /МУТАЦІЇ ЛЕКАРСТВЕННОЙ СТІЙКОСТІ

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити