В огляді розглянуті різні покоління антісмигсловик олігонуклеотидів (немодифіковані олігонуклеотиди, фосфоротіатние олігомери, 2'-0-метил і 2'-0-метокси-етил модифікації олігомерів, фосфородіамідат морфолінового олігомери і малі интерферирующие РНК), Можливі механізми їх дії, їх використання для профілактики і лікування небезпечних і особливо небезпечних вірусних інфекційних захворювань. При розробці засобів екстреної профілактики і лікування небезпечних і особливо небезпечних вірусних інфекційних захворювань людини найбільш широке застосування знайшли фосфородіамідат морфолінового олігомери і малі интерферирующие РНК. Зроблено вихід, що подальше удосконалення препаратів на основі антісмигсловик олігонуклеотидів можна забезпечити шляхом поліпшення структури останніх і пошуку нових хімічних модифікацій.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Петров Олександр Анатолійович, Лебедєв Віталій Миколайович, Сизикова Тетяна Євгенівна, Плеханова Тамара Михайлівна, Борисевич Сергій Володимирович


Analysis of Use of Antisense Oligonucleotides for Prevention and Treatment of Hazardous and Extremely Hazardous Viral Infectious Diseases

The article describes different generations of antisense oligonucleotids (unmodified oligonucleotids, phosphorothioate oligomers, 2'-0-methyl and 2'-0-methoxy-ethyl modification of oligomers, phosphordiamidate morpholine oligomers and small interfering RNAs), The possible mechanism of their action, their use for prevention and treatment of hazardous and extremely hazardous viral infectious diseases. Phosphordiamidate morpholine oligomers and small interfering RNAs are most widely used in the development of emergency prevention and treatment of hazardous and extremely hazardous viral infectious diseases. The authors conclude, that further improvement of medications based on antisense oligonucleotids may be achieved by improving the structure of the latter and carrying out the search for new chemical modifications.


Область наук:
  • фундаментальна медицина
  • Рік видавництва: 2019
    Журнал: Антибіотики і хіміотерапія

    Наукова стаття на тему 'АНАЛІЗ ЗАСТОСУВАННЯ антисмислового олігонуклеотиду ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ТА ЛІКУВАННЯ НЕБЕЗПЕЧНИХ І ОСОБЛИВО НЕБЕЗПЕЧНИХ ВІРУСНИХ інфекційних захворювань'

    Текст наукової роботи на тему «АНАЛІЗ ЗАСТОСУВАННЯ антисмислового олігонуклеотиду ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ТА ЛІКУВАННЯ НЕБЕЗПЕЧНИХ І ОСОБЛИВО НЕБЕЗПЕЧНИХ ВІРУСНИХ інфекційних захворювань»

    ?DOI: 10.24411 / 0235-2990-2019-10045

    Аналіз застосування антисмислових олігонуклеотидів

    для профілактики і лікування небезпечних і особливо небезпечних вірусних

    інфекційних захворювань

    А. А. ПЕТРОВ, В. Н. ЛЕБЕДЄВ, Т. Є. Сизикова, Т. М. ПЛЕХАНОВА, * С. В. БОРИСЕВИЧ

    48 Центральний науково-дослідний інститут Міністерства оборони Російської Федерації, Сергієв Посад

    Analysis of Use of Antisense Oligonucleotides for Prevention

    and Treatment of Hazardous and Extremely Hazardous Viral Infectious Diseases

    A. A. PETROV, V. N. LEBEDEV, T. E. SIZIKOVA, T. M. PLEKHANOVA, S. V. BORISEVICH

    48th Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad

    В огляді розглянуті різні покоління антисмислових олігонуклеотидів (немодифіковані олігонуклеотиди, фосфоротіатние олігомери, 2'-0-метил і 2'-0-метокси-етил модифікації олігомерів, фосфородіамідат морфоліно-ші олігомери і малі интерферирующие РНК), можливі механізми їх дії, їх використання для профілактики і лікування небезпечних і особливо небезпечних вірусних інфекційних захворювань. При розробці засобів екстреної профілактики і лікування небезпечних і особливо небезпечних вірусних інфекційних захворювань людини найбільш широке застосування знайшли фосфородіамідат морфолінового олігомери і малі интерферирующие РНК. Зроблено висновок, що подальше удосконалення препаратів на основі антисмислових олігонуклеотидів можна забезпечити шляхом поліпшення структури останніх і пошуку нових хімічних модифікацій.

    Ключові слова: антисмислового олігонуклеотиди, фосфородіамідат морфолінового олігомери, малі интерферирующие РНК, профілактика, лікування.

    The article describes different generations of antisense oligonucleotids (unmodified oligonucleotids, phosphorothioate oligomers, 2'-0-methyl and 2'-0-methoxy-ethyl modification of oligomers, phosphordiamidate morpholine oligomers and small interfering RNAs), the possible mechanism of their action, their use for prevention and treatment of hazardous and extremely hazardous viral infectious diseases. Phosphordiamidate morpholine oligomers and small interfering RNAs are most widely used in the development of emergency prevention and treatment of hazardous and extremely hazardous viral infectious diseases. The authors conclude, that further improvement of medications based on antisense oligonucleotids may be achieved by improving the structure of the latter and carrying out the search for new chemical modifications.

    Keywords: antisense oligonucleotides, phosphordiamidate morpholine oligomers, small interfering RNAs, prevention, treatment.

    Антисмислового олігонуклеотиди є олігонуклеотиди, комплементарні РНК-мішені, при зв'язуванні з нею змінюють її функції. Можливими механізмами дії антисмислових олігонуклеотидів є зупинка трансляції або зміна процесингу РНК або прискорення руйнування РНК за допомогою ендогенних ферментів (РНК-інтерференція). Здатність вирусспецифических антисмислових олігонуклеотидів пригнічувати ріст збудника вірусної природи в результаті інтерференції трансляції вірусних РНК була вперше встановлена ​​в 1978 р [1, 2]. З того часу було досягнуто значного прогресу в області модифікації олігонуклеотидів, їх стабільності, аффинности і можливості доставки в клітини.

    © Колектив авторів, 2019

    Адреса для кореспонденції: 141306, Московська область, м Сергієв Посад-6, вул. Жовтнева, д. 11. ФГБУ «48 ЦНДІ» МО РФ

    Використання антисмислових олігомерів дає можливість здійснити нову перспективну технологію лікування вірусних і бактеріальних інфекцій, вже продемонструвала значні результати при випробуваннях в культурі клітин і на нижчих приматів.

    За період з 1978 року по теперішній час було розроблено кілька поколінь модифікованих олігонуклеотидів. Проведені дослідження були спрямовані на поліпшення таких характеристик, як резистентність до дії нуклеаз, афінність до геномної нуклеїнової кислоти збудника, здатність до входу в клітини і інших прикладних фармакологічних характеристик.

    При характеристиці антисмислових оліго- мерів необхідно виділити немодифіковані-ні олігонуклеотиди і модифіковані антисмислового олігонуклеотиди 1-111 поколінь і интерферирующие РНК.

    Таблиця 1. Результати оцінки прямого зв'язування miРНК з геномами різних РНК-вірусів

    Вірус (сімейство) miPHK Фенотипическое прояви Джерело

    EEE (Alphavirus) miR-142-3p Зниження рівня трансляції та реплікації геномної РНК мієліт-нових клітин, сироваткового а / в ИНФ, підвищення вірулентності 6

    PFV-1 (Retrovirus) miR-32 Зниження рівня трансляції вірус-специфічних білків 9

    HTLV-1 (Retrovirus) miR-28-3p Зниження рівня трансляції в Т-клітинах, трансмісії від людини до людини 10

    HIV (Retrovirus) miR-28-5p, miR-150, miR-223, miR-382 Зниження рівня реплікації вірусу. Підвищення латентності Т-клітин 11

    Orthomyxovirus miR-323, miR-491, miR-485, miR-654, Зниження рівня трансляції білка РВ1 (компонент комплексу РНК-залежною РНК-полімерази, необхідний

    miR-3145 для реплікації вірусів) 12

    EV71 (Enterovirus) Let-7c, miR-296-5p, miR-23b Зниження рівня матричного білка. Зниження реплікації вірусу, рівня білків УР1 і УР3. Зниження вірусної трансляції та реплікації 8, 13, 14

    Таблиця 2. Результати оцінки змін в експресії клітинних miРНК після інфекції РНК-яку воно містить-ми вірусами

    Вірус miPHK Білок-мішень Фенотипічні прояви Джерело

    EV71 Enterovirus | miR-146a TRAF6, IRAK1, Зниження рівня ІНФ a /? 15-17

    imiR-141 SOS1, elF4E Підвищення рівня апоптозу

    Денге | miR-146a TRAF6 Те ж 18

    Японського енцефаліту imiR-146a TRAF6 Зниження рівня ІНФ a /? 19

    Грипу | miR-548an NS1-зв'язуючий білок Зниження рівня апоптозу 20

    Хендра imiR-146a RNF11 Підвищення рівня репродукції вірусу 21

    Примітка. RAK1 - інтерлейкін 1 рецептор асоційована киназа; SOS - фактор 1 обміну гуаніну; TRAF6 рецептор туморнекротіческого фактора асоційованого білком 6; elF4E - еукаріотичний фактор регуляції транскрипції; | - підвищення, | - зниження рівня відповідної miPHK.

    Механізм дії немодифікованих олігонуклеотидів як антисмислових олігомерів наочно демонструє вивчення властивостей мікро РНК (ш1РНК), які представляють собою не кодують РНК, що регулюють багато процесів в клітинах за допомогою зміни рівня виділяється білка в результаті зв'язування з інформаційними РНК (шРНК) і впливають таким чином на ефективність трансляції [3]. ш1РНК також можуть впливати на реплікацію і патогенез РНК-утримуючи-щих вірусів за допомогою прямого зв'язування з РНК геномом або в результаті вірусіндуціро-ванних змін до транскрісоме господаря. Пряме зв'язування ш1РНК з вірусними геномами веде до розвитку противірусного ефекту внаслідок селективного тиску на ш1РНК-зв'язуючі ділянки в межах вірусного генома. В останні кілька років зросла кількість досліджень по ідентифікації ш1РНК як модулюючого фактора в процесі вірусної інфекції. Дослідження ш1РНК важливі для створення ефективних противірусних препаратів і засобів генної терапії [3]. ш1РНК розташовані головним чином в межах інтронів, що кодують і не кодують РНК клітини-господаря. ш1РНК зв'язуються з відповідними сайтами зв'язування в межах шРНК і вірусних геномів [4].

    Сайти зв'язування ш1РНК в межах вірусних геномів зазвичай розташовані в районі 5 'і 3' нетрансльовані регіонів [5, 6], однак недавно вони були виявлені в регіоні, що кодує ви-

    РУСН білки [7, 8]. Збільшення числа сайтів зв'язування miPHK в межах вірусного З'-Некодині-рующего регіону з повною комплементарностью хазяйської miPHK призводить до пригнічення реплікації вірусу in vitro. Цей процес посилюється, коли два сайти зв'язування miPHK розділяє інтервал довжиною 15-35 нуклеотидів. miPHK розпізнають послідовність, що включає 2-8 нуклеотидів розташованих у 5'-кінця відповідної mPHK. Результати, отримані при зв'язуванні miPHK з геномами різних PHK-вірусів, що відносяться до різних сімейств, представлені в табл. 1, свідчать про те, що безпосереднім результатом зв'язування miPHK з mPHK різних PHK-со-тримають вірусів є зниження рівня трансляції та реплікації геномної PHK.

    Дані щодо зміни рівня експресії клітинних miPHK після інфекції різними PHK-вмісними вірусами, представлені в табл. 2, свідчать про те, що підвищення експресії клітинних miPHK після інфекції PHK-вмісними вірусами призводить до зниження рівня HHO a / в і підвищенню рівня апоптозу. Для клітин, інфікованих вірусом Хендра, підвищення рівня реплікації miPHK (miR-146a), спостерігається на тлі підвищення рівня репродукції вірусу [21].

    ^ Модифіковані PHK за своєю природою в біологічних системах є нестабільними, так як піддаються впливу різних рибонуклеаз. Для застосування оліго- нуклеотидів в якості антисмислових препара-

    тов, необхідно провести їх модифікацію, націлену головним чином на підвищення стійкості до розщеплення нуклеазами, при збереженні можливості комплементарного зв'язування з РНК-мішенями. Для цих цілей використовується кілька різних хімічних методів.

    Перше покоління антисмислових олігомерів містило фосфоро-тіоатние модифікації (заміну незв'язаного кисню на сірку в фосфодіе-ФІРН зв'язку). Дана заміна дозволила підвищити резистентність олигомера до дії нуклеаз.

    Друге покоління антисмислових олігоме-рів містило подальшу модифікацію нукле-озід рібознофосфатних зв'язків шляхом включення 2'-О-метилу і 2'-О-метоксіетил. Модифіковані таким чином олігомери не розщеплюються РНК-азой Н.

    В даний час серед 2'-модифікацій найбільшу результативність показує 2'-0-ме-токсіетіл (2'МОЕ) модифікація [22]. 2'MOE підвищує температуру плавлення нуклеїнової кислоти (2 ° C на одну заміну) і значно підвищує стійкість до нуклеаз. Також така заміна зменшує неспецифічне зв'язування з білками, що може знизити токсичність. Крім того, 2'М0Е-олігонуклеотиди можуть бути використані для підтримки різноманітності антисмислових механізмів. 2'М0Е-модифіковані олігонуклеотиди є найбільш ефективними (як in vitro, так і в клінічних випробуваннях) представниками антисмислових олігомерів другого покоління. З 2'М0Е-модифікований-них антисмислових препаратів для проведення клінічних випробувань представлені міравір-сен RG-101, що представляє собою aGalNAc-кон'югований 2 '- М 0Е-модифікований олигонуклеотид, призначений для лікування пацієнтів, інфікованих вірусом гепатиту С (в даний час препарат проходить II фазу клінічних випробувань), препарати ARC-520 і ARB-1467 (проходять II фазу клінічних випробувань), препарат I0NIS-HBV-LRx (проходить I фазу клінічних випробувань). Три останніх препарату призначені для лікування інфікованих вірусом гепатиту С [22].

    Третє покоління олігомерів містить різні хімічні модифікації, які підвищують стабільність, аффинность і біодоступність. Це фосфородіамідат морфолінового олігомери, які отримують заміною рибози в нуклеозидами морфолінового кільцем і фосфоро-діамідних замість фосфородіефірних зв'язків.

    Нову групу антисмислових олігомерів представляють интерферирующие РНК, в тому числі і малі интерферирующие РНК (siPHK).

    Загальним недоліком всіх антисмислових олігомерів є їх залежна від дози, що вводиться токсичність.

    Потенційну токсичність антисмислових олігомерів можна розділити на гібридизаційним-залежну і гібридизаційним-незалежну. Гібридизаційним-залежна токсичність пояснюється гибридизацией з РНК, які не є мішенями використовуваних антисмислових олігомерів. Таку токсичність можна звести до мінімуму шляхом оптимального вибору РНК-мішені на етапі доклінічних випробувань. Гібридизується-ционно-залежну токсичність, пов'язану з впливом на сторонню мету, можна зменшити в результаті виявлення мішені з малим числом незбіжних підстав. Імовірність взаємодії зі сторонніми мішенями і розщеплення їх, в разі активації РНК-ази Н зростає для більш коротких олігонуклеотидів з високоаффіннимі модифікаціями [22].

    Дані за властивостями антисмислових оліго- мерів різних поколінь, представлені в табл. 3, свідчать про те, що антисмислового олігомери різних поколінь відрізняються від немодифікованих олігонуклеотидів хімічною модифікацією і механізмом дії, підвищеною стабільністю при введенні в макроорганізм і більш високу противірусну активність.

    При розробці засобів екстреної профілактики і лікування небезпечних і особливо небезпечних вірусних інфекційних захворювань людини найбільш широке застосування знайшли фосфородіамідат морфолінового олігомери (РМО) і малі интерферирующие РНК.

    РМО, специфічні до генам структурних білків вірусу Ебола, інгібували репродукцію збудника in vitro (множинність інфікування БОЮ / клітина) [24]. Результати, представлені в табл. 4, свідчать про те, що, комбінація 3-х РМО не робить синергічний ефект на уповільненні репродукції вірусу в клітинах Vero Е6 в порівнянні з використанням монопрепаратов РМО.

    Комбінація PMO, специфічних до генам VP24, VP35 і L, захищала білих мишей і морських свинок, інфікованих вірусом Ебола, при введенні з профілактичної (до інфікування) та екстреної профілактики схемами. Хоча гризуни (миші і морські свинки) НЕ моделюють ВГЛ у людини і нижчих приматів, ці моделі застосовують для скринінгу нових препаратів, що безпосередньо впливають на реплікацію вірусу.

    При експериментальної інфекції морських свинок встановлена ​​залежність частки тих, хто вижив тварин від часу введення РМО. При введенні за 24 год до інфікування 10 мг кожного виду РМО на тварину виживаність склала 17%, через 24 год і 96 год після інфікування, відповідно, 33 і 67%.

    І

    «в

    се Е

    ^ Я

    ; 3 й

    & S

    if

    J I

    а

    е

    5 з

    І Й

    ^ 8 8

    u В про g ft а

    л S М К

    . про

    ? $

    Г S

    про

    4 про

    5

    S га

    М га

    л До

    S

    та ^ ч

    га й

    8 §

    ft g

    и н

    м- про

    ? і

    S е

    • е 2

    про

    ft U S До

    ч до 2

    3

    cs

    Е Н

    м про

    а й

    S й

    Ь Я

    * S Й "

    S «га га

    про До До S

    • е f

    cs га

    Й Я

    R СО

    U (Я

    ю ?

    ° ?

    (D Д

    S g

    S ft

    а з

    л про

    СО і

    СЯ м

    «3

    Про М

    S н

    1 3

    2 S

    і S

    до

    про з Я про ft

    Цн і

    g К ^

    8 Е X

    fthflQ

    а

    s. ^

    4 1 H

    У ^ o ra -

    >. 4

    S Л

    про ft

    t *

    про g S я й я? g S н

    g S

    ft л

    про я

    га р

    Я S

    про про

    га М

    ^ о

    S ^

    Е К до a

    8 J ft s

    0 ^

    До <N

    g °

    до ч

    1 13

    S

    I Про

    »й

    ? 2

    СО 3

    я до

    ft Я

    Про ft Про

    про 8

    про «

    Про g

    га «

    ft про

    Ч до

    про ?

    ft &

    про про

    U

    я до

    Й

    "Про л К

    ^ Й

    в -е

    К о

    про -е

    S про

    до

    Рч

    «

    про

    до

    &

    Й

    5 до ^ к о 5

    6 a ° ?

    РЗ &

    і "

    W СО S Про

    ч о

    rs

    га ^

    До

    ГЧ Рн

    s

    5 Е4 S m ^ До

    a s = S?

    К о cs ю | S

    про я

    л

    ч

    ^^.

    про

    Q

    про U «

    g S й

    ? "Рн Про

    |g 8 * ^^

    До S

    я ^

    СО ^

    ts 2

    g

    до і

    IS i§ "У il

    ft е §

    ft ts

    і я

    я ia

    «J S3

    CQ Ж

    fq? a a ^

    ?H H S ra

    про

    До .

    Ч про ^ Е9

    h ° «a

    о з S5 ^ 2? 3 ч ю

    «Я

    sS s

    х ю про про

    W

    ч _ Ч до

    -До

    ем

    «

    про До

    л s га

    cs н 8 ?

    га

    S ft

    про

    й до

    ^ a

    U S

    a s >. л до ft

    про •&

    ft

    до щ До їм

    При введенні з профілактичної схемою (до інфікування тварин) зазначені олігомери захищали 75% (3 з 4) макак резусів, інфікованих свідомо летальною дозою (1х103 БОЮ) вірусу Ебола-Заїр [25]. При введенні комбінації 3-х PMO, специфічних по відношенню до генам вірусних білків VP35, VP24 і L вірусу Ебола, макакам резус, інфікованим вірусом Ебола (1000 БОЮ на тварину) за схемою екстреної профілактики (+1, +3, +4, + 6, +8 добу після інфікування в дозі 12,5 мг), 50% тварин вижили. Середній термін життя до загибелі нелікованих тварин достовірно збільшився в порівнянні з контролем (12,5 і 8,3 доби, відповідно).

    Ш специфічність дії PMO, специфічних по відношенню до генам структурних білків вірусу Ебола, вказує той факт, що використання PMO, специфічних по відношенню до генам структурних білків VP35, VP24 і L вірусу Марбург, не робило захисного ефекту.

    Позитивно заряджені фосфо-родіамідатние морфолінового олігоме-ри (PMO plus) є новою модифікацією даного препарату, що містить Піперазинові зв'язку в молекулярній структурі. PMO plus, мають своєю мішенню ген білка VP24, інгібують трансляцію цього білка in vitro і захищають мишей від летальної дози вірусу Ебола. Ш морських свинках, інфікованих вірусом Ебола, показано, що поєднання PMO plus, специфічних до генам VP35 і VP24 більш ефективно в порівнянні з PMO plus тільки до VP24 [24].

    T. K. Warren et al. [24] провели вивчення захисної ефективності комбінацій PMO plus до генам VP24 і VP35 вірусу Ебола (AVI-6002) Наявні і вірусу Марбург (AVI-6003) на макаках резус і яванських макаках, інфікованих, відповідно, штамом Kіквіт вірусу Ебола, і штамом Mусоке вірусу Марбург. Инфицирующая доза становить 1000 БОЮ на тварину. Препарати AVI-6002 і AVI-6003 вводили через 30-60 хв після інфікування. Результату, наведені в табл. 5, свідчать, що препарати AVI-6002 і AVI-6003 надають специфічну захисну дію. (PMO plus) при введенні в різних дозах через 30-60 хв після інфікування, захищають > 60% (5/8) макак

    Таблиця 4. Результати оцінки вірусінгібірующей активності РМО, специфічних до генам структурних білків вірусу Ебола [24]

    Вид РМО Концентрація Ингибирование зростання вірусу по відношенню

    РМО мкМ до контролю (без внесення препаратів), відсоток на час п. І.

    24 ч 48 ч 72 ч

    PMO VP24 20 73 50 80

    PMO VP35 90 40 60

    PMO L 80 60 55

    Комбінація з 3-х PMO по 20 кожного 88 70 60

    Таблиця 5. Результати вивчення захисної ефективності комбінацій PMO plus до генам VP24 і VP35 виру-

    сов Ебола і Марбург [24]

    Тварини Вірус AVI-6002 Доза мг / кг (ви1жіваніе n / N) AVI-6003 Доза мг / кг (ви1жіваніе n / N)

    Макаки резус Ебола 4 (0/4) -

    16 (1/4) -

    28 (3/5) -

    40 (3/5) 40 (4/4)

    Яванские макаки Марбург 7,5 (3/5) -

    15 (3/5) -

    30 (4/4) _30 (4/4)

    резусів від летальної дози вірусу Ебола-Заїр і 100% яванських макак від летальної дози вірусу Марбург. PMO plus можуть бути рекомендовані для екстреної профілактики захворювань викликаних цими та іншими високопатогенними вірусами [24].

    Найбільш перспективним видом антисмислових олігомерів для використання при лікуванні вірусних інфекційних захворювань є siPHK.

    Дослідження з оцінки захисної ефективності siPHK на нижчих приматів вперше були проведені в 2007 р T. Yokota et al. [26] показали ефективність siPHK при інгібуванні реплікації вірусу гепатиту В в організмі інфікованих мармозеток. У більш пізній роботі встановлено, що siPHK, специфічні по відношенню до коронавірус - збудника SARS, відзначено зниження-вали реплікацію вірусу в макаках резус [27].

    T.W. Geisbert et al. [28] провели вивчення захисної ефективності siPHK до фрагментів генів білків L, VP35 і VP24 вірусу Ебола.

    ^ Мбінація модифікованих siPHK, специфічних по відношенню до генам зазначених білків, була використана в експериментах на макаках резус, інфікованих штамом Заїр вірусу Ебола. Препарат вводили внутрішньовенно в дозі 2 мг / кг. Одній групі тварин (n = 3) препарат вводили за схемою + 30 хв, +1 добу, +3 доби, +5 діб після інфікування. Другій групі тварин (n = 4) препарат вводили за схемою +30 хв, + 1 добу., + 2 сут., + 3 діб., + 4 діб., + 5 діб., + 6 діб. після інфікування. У першій групі виживаність склала 67% (2/3), у другій - 100% (4/4).

    Шіболее ефективним способом введення siPHK в макроорганізм є їх використання в складі ліпідних наночастинок.

    E. P. Thi et al [29] використовували для конструювання siPHK вектор psiCHECK2 (Promega). Були приготовлені плазміди, що містять вставки генів VP35 і L штаму Макона розміром 201 пара нуклеотидних залишків (позиції генома 3817-4018 і 17287-17488, відповідно). Зазначені послідовності вставляли в 3 "не-трансльований регіон гена Rlu9 вектора psiCHECK2 між сайтами рестрикції Xho1 і Not1. siPHK, специфічні до ділянок генів L і VP35 синтезували за допомогою інтеграційної ДНК-технології. Дуплекси siPHK в молекулярному співвідношенні 1: 1 були вміщені в ліпідні частинки методом спонтанного освіти везикул [13]. В якості негативного контролю використовували siPHK, специфічні до PHK вірусу Марбург, інкапсульовані в ли-Пидне наночастинки.

    Шість дорослих макак резус (маса 4-8 кг, 3 самця і 3 самки) були внутрішньом'язово інфіковані вірусом Ебола-Заїр, штам Макона, в дозі 1000 БОЮ. Тварини були розподілені випадковим чином на дослідну і контрольну групи. Тваринам вводили siPHK в дозі 5 мг / кг через 72 год і потім на 4-9 добу. після інфікування щодня. Всі тварини дослідної групи вижили, контрольної загинули.

    Отже, було встановлено, що ліпідні наночастинки, що містять siPHK, специфічні до вірусу Ебола штам Макона, забезпечують 100% захист макак резусів при введенні через 3 доби. після зараження, коли у тварин вже була зареєстрована вирусемия і клінічні ознаки захворювання. Хоча у всіх інфікованих тварин розвинулося захворювання з гематолітіческімі порушеннями, у тварин, яким була введена siPHK, відхилення від норми були виражені в меншому ступені. за-

    Отримані дані дозволили рекомендувати siPHK як засіб лікування захворювання, викликаного вірусом Ебола (ЗВВЕ) у людини.

    J. Dunning et al. [30] провели вивчення захисної ефективності ліпідних наночастинок TKM-130803, що містять siPHK до фрагментів генів білків VP35 і L.

    TKM-130803 є модифікацією препарату TKM-100802, в якому компонент siPHK містив 2 нуклеотидні заміни в гені білка VP35 і одну заміну в гені білка L, проведені з метою максимальної адаптації препарату до штаму Макона вірусу Ебола-Заїр, виділеного в ході спалаху 2014 -2016 рр. в Західній Африці.

    При проведенні випробувань на нижчих приматів була зареєстрована 100% захист від загибелі при дозі 5 мг / кг / сут. препарату TKM-100802, і 66% захист при дозі 0,2 мг / кг / добу.

    Під час проведення фази II клінічних випробувань 14 хворим з лабораторно-під-тверждённим діагнозом ЗВВЕ щодня протягом 7 діб. вводили внутрішньовенно TKM-130803. Препарат вводили в дозі 0,3 мг / кг / день протягом 7 діб. внутрішньовенно зі швидкістю 1,25 мл / хв протягом 2 ч. Загальний обсяг введеного препарату склав 150 мл. Побічні реакції на введення препарату спостерігали тільки у одного хворого. Двоє з хворих загинули протягом 48 годин після госпіталізації і були виключені з дослідної групи. Середній рівень вірусемії у решти 12 хворих становив 2,24х109 копій PHK / мл (J95 - 7,52х108-6,66х109).

    З решти 12 хворих 9 загинуло та 3 вижило. Розраховані, що ймовірність того, що хворі, які отримують TKM-130803, що вижили через 2-е суток після госпіталізації, доживуть до 14 дня, становить 0,27 (J95 - 0,06-0,58). Для того, щоб препарат міг вважатися перспективним кандидатом як лікувальний засіб, даний показник повинен перевищувати 0,55.

    ЛІТЕРАТУРА

    1. Stephenson M.L., Zamecnik P.C. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75 (1): 285-288. PMCID: PMC411231.

    2. Zamecnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75 (1): 280-284. PMCID: PMC411230.

    3. Trobaugh D.W., Klimstra W.B. Micro RNA Regulation of RNA Virus Replication and Pathogenesis. Trends Mol Med 2017; 23 (1): 80-93. doi: 10.1016 / j.molmed.2016.11.003.

    4. Teterina N.L., Liu G, Maximova O.A., Pletnev A.G. Silencing of neu-rotropic flavivirus replication in the central nervous system by combining multiple microRNA target insertions in two distinct viral genome regions. Virology 2014; 456: 247-258. doi: 10.1016 / j.virol. 2014.04.001.

    5. Jopling C.L., Yi M, Lancaster A.M., Lemon S.M., Sarnow P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science. 2005; 309 (5740): 1577-1581. doi: 10.1126 / science.1113329.

    6. Trobaugh D.W., Gardner C.L., Sun C, Haddow A.D., Wang E, Chapnik E. et al. RNA viruses can hijack vertebrate microRNAs to suppress innate immunity. Nature 2014; 506 (7487): 245-248. doi: 10.1038 / nature12869.

    Таким чином, введення препарату TKM-130803 не зробило достовірного ефекту на виживаність хворих з діагнозом ЗВВЕ. Ймовірно, це може бути пояснено термінами першого введення препарату, який може бути неефективний, якщо у хворого відзначено високий рівень вірусемії. Дані по оцінці ефективності в ході клінічних випробувань суперечать даним доклінічних випробувань на нижчих приматів. Однак порівняння рівня вірусемії у нижчих приматів (~ 1х106 копій PHK / мл), для яких введення TKM-100802 забезпечило 100% виживання, з рівнем вірусемії хворих при проведенні клінічних випробувань (~ 2х109 копій PHK / мл) дає пояснення можливих причин невідповідності результатів клінічних і доклінічних випробувань. Можливо, що застосування антисмислових олігонуклеотидів в лікувальних цілях може бути найбільш ефективним в поєднанні з використанням інших специфічних і неспецифічних засобів медичного захисту, що характеризуються іншою порівняно з антисмислового олигонуклеотидами спрямованістю дії [31].

    Для профілактики і лікування небезпечних та особливо небезпечних інфекційних захворювань в даний час розробляють різні класи препаратів на основі антисмислових олігонук-леотідов. Pазработанние модифікації оліго- нуклеотидів покращують ефективність і переносимість антисмислових препаратів, а також покращують розподіл препарату в тканинах і, в кінцевому підсумку, сприяють його надходженню до PHK-мішені всередині клітини. Подальше вдосконалення препаратів на основі антисмислових олігонуклеотидів можна забезпечити шляхом поліпшення структури останніх, більш повного скринінгу і пошуку нових хімічних модифікацій і лікарських форм.

    7. SongL, Liu H, Gao S, Jiang W, Huang W.Cellular microRNAs inhibit replication of the H1N1 influenza A virus in infected cells. J Virol 2010 року; 84 (17): 8849-8860. doi: 10.1128 / JVI.00456-10.

    8. Zheng Z, Ke X., Wang M, He S, Li Q, Zheng C. et al. Human microRNA hsa-miR-296-5p suppresses enterovirus 71 replication by targeting the viral genome. J Virol 2013; 87 (10): 5645-5656. doi: 10.1128 / JVI.02655-12.

    9. Lecellier C.H., DunoyerP., ArarK, Lehmann-Che J., Eyquem S, Himber C. et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science 2005; 308 (5721): 557-560. doi: 10.1126 / science.1108784.

    10. Bai X.T., Nicot C. miR-28-3p is a cellular restriction factor that inhibits human T cell leukemia virus, type 1 (HTLV-1) replication and virus infection. J Biol Chem 2015; 290 (9): 5381-5390. doi: 10.1074 / jbc.M114.626325.

    11. Huang J., Wang F, Argyris E, Chen K, Liang Z, Tian H. et al. Cellular microRNAs contribute to HIV-1 latency in resting primary CD4 + T lymphocytes. Nat Med 2007; 13 (10): 1241-1247. doi: 10.1038 / nm1639.

    12. Ingle H, Kumar S, Raut A.A., Mishra A., Kulkarni D.D., Kameyama T. et al. The microRNA miR-485 targets host and influenza virus transcripts to regulate antiviral immunity and restrict viral replication. Sci Signal 2015; 8 (406): 1-13. doi: 10.1126 / scisignal.aab3183.

    13. Ma Y.J., Yang J., Fan X.L, Zhao H.B., Hu W, Li Z.P. et al. Cellular microRNA let-7c inhibits M1 protein expression of the H1N1 influenza

    A virus in infected human lung epithelial cells. J Cell Mol Med 2012; 16 (10): 2539-2546. doi: 10.1111 / j.1582-4934.2012.01572.x.

    14. Wen B.P., Dai H.J, Yang Y.H., Zhuang Y, Sheng R. MicroRNA-23b inhibits enterovirus 71 replication through downregulation of EV71 VPl protein. Intervirology 2013; 56 (3): 195-200. doi: 10.1159 / 000348504.

    15. Ho B.C., Yu I.S., Lu L.F., Rudensky A., Chen H.Y., Tsai C.W. et al. Inhibition of miR-146a prevents enterovirus-induced death by restoring the production of type I interferon. Nat Commun 2014; 5: 3344. doi: 10.1038 / ncomms4344.

    16. Chang Y.L, Ho B.C., Sher S, Yu S.L., Yang P.C. miR-146a and miR-370 coordinate enterovirus 71-induced cell apoptosis through targeting SOS1 and GADD45 ?. Cell Microbiol 2015; 17 (6): 802-818. doi: 10.1111 / cmi.12401.

    17. Ho B.C., Yu S.L., Chen J.J, Chang S.Y, Yan B.S., Hong Q.S. et al. Enterovirus-induced miR-141 contributes to shutoff of host protein translation by targeting the translation initiation factor eIF4E. Cell Host Microbe 2011 року; 9 (1): 58-69. doi: 10.1016 / j.chom.2010.12.001.

    18. Wu S., He L., Li Y, Wang T., Feng L., Jiang L. et al. miR-146a facilitates replication of dengue virus by dampening interferon induction by targeting TRAF6. J Infect 2013; 67 (4): 329-341. doi: 10.1016 / j.jinf.2013.05.003.

    19. Sharma N., Verma R., KumawatK.L., Basu A., Singh S.K. miR-146a suppresses cellular immune response during Japanese encephalitis virus JaOArS982 strain infection in human microglial cells. J Neuroinflammation 2015; 12: 30. doi: 10.1186 / s12974-015-0249-0.

    20. Othumpangat S., Noti J.D., Blachere F.M., Beezhold D.H. Expression of non-structural-1A binding protein in lung epithelial cells is modulated by miRNA-548an on exposure to influenza A virus. Virology 2013; 447 (1-2): 84-94. doi: 10.1016 / j.virol.2013.08.031.

    21. Stewart C.R., Marsh G.A., Jenkins K.A., Gantier M.P., Tizard M.L., Middleton D. et al. Promotion of Hendra virus replication by microRNA 146a. Virology 2013; 87 (7): 3782-3791. doi: 10.1128 / jvi.01342-12.

    22. Bennett C.F., Baker B.F., Pham N., Swayze E., Geary R.S. Pharmacology ofAntisense Drugs. Ann Rev Pharmacol Toxicol 2017; 57: 81-105. doi: 10.1146 / annurev-pharmtox-010716-104846.

    23. WarfieldK.L., PanchalR.G., Aman M.J., Bavari S. Antisense treatments for biothreat agents. Curr Opin Mol Ther 2006; 8 (2): 93-103. PMID: 16610760.

    24. Warren T.K., Warfield K.L., Wells J., Swenson D.L., Donner K.S., Van Tongeren S.A. et al. Advanced antisense therapies for postexposure protection against lethal filovirus infections. Nat Med 2010 року; 16 (9): 991-994. doi: 10.1038 / nm.2202.

    25. Warfield K.L., Swenson D.L., Olinger G.G., Nichols D.K., Pratt W.D., Blouch R. et al. Gene-specific countermeasures against Ebola virus based on antisense phosphorodiamidate morpholino oligomers. PLoS Pathog 2006; 2 (1): 5-13. doi: 10.1371 / journal.ppat.0020001.

    26. Yokota T., Iijima S., Kubodera T., Ishii K., Katakai Y., Ageyama N. et al. Efficient regulation of viral replication by siRNA in a non-human primate surrogate model for hepatitis C. Biochem Biophys Res Commun 2007; 361 (2): 294-300. doi: 10.1016 / j.bbrc.2007.06.182.

    27. International Society for Infectious Diseases. Ebola, lab accident death -Russia (Siberia) [serial online] 2010 April (cited 2017 Aug 29). Available from: URL: http://www.promedmail.org/pls/apex/f?p=2400: 1001, ::: N0 :: F2400_ P1001_BACK_PAGE, F2400_P1001_PUB_MAIL_ID: 1000% 2C25465.

    28. Geisbert T.W, Lee A.C., Robbins M, Geisbert J.B, Honko A.N., Sood V et al. Postexposure protection of non-human primates against a lethal Ebola virus challenge with RNA interference: a proof-of-concept study. Lancet 2010 року; 375 (9729): 1896-1905. doi: 10.1016 / S0140-6736 (10) 60357-1.

    29. Thi E.P., Mire C.E., Lee A.C.H., Geisbert J.B., Zhou J.Z., Agans K.N. et al. Lipid nanjparticle siRNA treatment of Ebola virus Makona infected primates. Nature 2015; 521 (7552): 362-365. doi: 10.1038 / nature14442.

    30. Dunning J., Sahr F., Rojek A., Gannon F., Carson G., Idriss B. et al. Experimental Treatment of Ebola Virus Disease with TKM-130803: A Single-Arm Phase 2 Clinical Trial. PLoS Med 2016 року; 13 (4): 1-19. doi: 10.1371 / journal.pmed.1001997.

    31. Uyeki T.M., Mehta A.K., Davey R..T., Liddell A.M., Wolf T., Vetter P. et al. Clinical Management of Ebola Virus Disease in the United States and Europe. N Engl J Med 2016 року; 374 (7): 636-646. doi: 10.1056 / NEJMoa1504874.

    ВІДОМОСТІ ПРО АВТОРІВ:

    Петров Олександр Анатолійович - к. М. Н., Начальник відділу, Федеральне державне бюджетна установа «48 Центральний науково-дослідний інститут» Міністерства оборони Російської Федерації, Сергієв Посад

    Лебедєв Віталій Миколайович - д. Б. н., професор, провідний науковий співробітник, Федеральне державне бюджетна установа «48 Центральний науково-дослідний інститут» Міністерства оборони Російської Федерації, Сергієв Посад

    Сизикова Тетяна Євгенівна - к. Б. н., науковий співробітник; Федеральне державне бюджетне учрежде-

    ня «48 Центральний науково-дослідний інститут» Міністерства оборони Pоссійской Федерації, Сергієв Посад

    Плеханова Тамара Михайлівна - к. Б. н., старший науковий співробітник, Федеральне державне бюджетна установа «48 Центральний науково-дослідний інститут» Міністерства оборони Pоссійской Федерації, Сергієв Посад

    Борисевич Сергій Володимирович - д. Б. н., професор, член-кор. PAH, начальник інституту, Федеральне державне бюджетна установа «48 Центральний науково-дослідний інститут» Міністерства оборони Pоссійской Федерації, Сергієв Посад


    Ключові слова: АНТІЕМИЕЛОВИЕ олігонуклеотиду / ФОСФОРОДІАМІДАТ морфолінового олигомере / МАЛІ інтерферуючих РНК / ПРОФІЛАКТИКА / ЛІКУВАННЯ / ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES / PHOSPHORDIAMIDATE MORPHOLINE OLIGOMERS / SMALL INTERFERING RNAS / PREVENTION / TREATMENT

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити