На 45 штамах Escherichia coli, виділених при інфекційно-запальних захворюваннях урогенітального тракту і жовчовивідної системи людини, показана варіабельність бактерій по серорезистентности, інтегральним фізико-хімічним параметрам (гидрофобность, електрокінетіческій потенціал) і здатності до формування біоплівок. Встановлено, що біопленкообразующіе культури і "біопленочная" фракція ешерихій менш стійкі до бактерицидної активності сироватки і більш гідрофобні, ніж ізоляти E. coli, що не формують біоплівки, і клітини з "планктонної" фракції.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Гриценко В. А., Журлов О. С., Іванов Ю. Б., Гриценко Я. В.


Analysis of the correlation between seroresistance and physico-chemical properties of escherichia coli with their ability of forming biofilms

45 strains of Escherichia coli, isolated from patients with infectious-inflammatory pathologies of urogenital tract and bile passages, were characterized by variability of seroresistance, cumulative physico-chemical parameters (hydrophobic, electro-kinetic potential) and abilities of forming biofilms.It was established that the bacterial cultures with abilities of forming biofilms and "biofilm"Faction of E. coli cells are less resistant to the serum bactericidal activities and more hydrophobic than the isolates of E. coli, not forming a biofilm as well as the cells of the "plankton" faction.


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2012


    Журнал: Курський науково-практичний вісник «Людина та її здоров'я»


    Наукова стаття на тему 'Аналіз взаємозв'язку серорезистентности і фізико-хімічних властивостей ешерихій з їх здатністю утворювати біоплівки'

    Текст наукової роботи на тему «Аналіз взаємозв'язку серорезистентности і фізико-хімічних властивостей ешерихій з їх здатністю утворювати біоплівки»

    ?Експериментальна біологія і медицина УДК 576.851.49

    АНАЛІЗ взаємозв'язку серорезистентного І ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ Ешеріхія З ЇХ здатні утворювати біоплівки

    © Гриценко В.А., Журлов О.С., Іванов Ю.Б., Гриценко Я.В.

    Інститут клітинної та внутрішньоклітинного симбіозу УрО РАН, Оренбург

    E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    На 45 штамах Escherichia coli, виділених при інфекційно-запальних захворюваннях урогенітального тракту і жовчовивідної системи людини, показана варіабельність бактерій по серорезистентности, інтегральним фізико-хімічним параметрам (гидрофобность, електрокінетіческій потенціал) і здатності до формування біоплівок. Встановлено, що біопленкообразующіе культури і "біопленочная" фракція ешерихій менш стійкі до бактерицидної активності сироватки і більш гідрофобні, ніж ізоляти E. coli, що не формують біоплівки, і клітини з "планктонної" фракції.

    Ключові слова: Escherichia coli, біоплівки, серорезистентність, гідрофобність, z-потенціал.

    ANALYSIS OF THE CORRELATION BETWEEN SERORESISTANCE AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF ESCHERICHIA COLI WITH THEIR ABILITY OF FORMING BIOFILMS

    Gritsenko V.A., Zhurlov O.S., Ivanov Y.B., Gritsenko Ya.A.

    Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg

    45 strains of Escherichia coli, isolated from patients with infectious-inflammatory pathologies of urogenital tract and bile passages, were characterized by variability of seroresistance, cumulative physico-chemical parameters (hydrophobic, electro-kinetic potential) and abilities of forming biofilms.It was established that the bacterial cultures with abilities of forming biofilms and "biofilm" faction of E. coli cells are less resistant to the serum bactericidal activities and more hydrophobic than the isolates of E. coli, not forming a biofilm as well as the cells of the " plankton "faction.

    Keywords: Escherichia coli, biofilm, seroresistance, hydrophobic, z-potential.

    Здатність бактерій утворювати біоплівки багатьма дослідниками розглядається як важлива властивість, що забезпечує виживання мікроорганізмів в несприятливих умовах (висушування, підвищена інсоляція тощо.), А також при їх контакті з антибіотиками і дезинфектантами [7, 12, 9]. Вважається, що формування мікроорганізмами биопленок має відношення до патогенезу багатьох інфекціонновоспалітельних, в тому числі асоційованих з катетерами і імплантатами [8, 13]. Разом з тим дані про вплив біоплівки-освіти на стійкість бактерій, зокрема Escherichia coli як збудників внекішеч-них ешеріхіозов (запальна патологія урогенітального тракту і жовчовивідних шляхів, сепсис, нозокоміальні інфекції та ін.) [2, 4], до різних ефекторів імунітету макроорганізму поки нечисленні і суперечливі [14], що визначає актуальність досліджень, спрямованих на вивчення взаємозв'язку між зазначеними властивостями.

    Метою цієї роботи став аналіз взаємозв'язку серорезистентности і інтегральних фізико-хімічних характеристик (гидрофобность, електрокінетіческій потенціал) ешерихій, виділених при інфекційно-запальних захворюваннях урогенітального тракту і желчеви-

    провідних шляхів, з їх здатністю утворювати біоплівки.

    Матеріали та методи дослідження

    Дослідження виконані на 45 штамах Escherichia coli, виділених від хворих з інфекційно-запальною патологією з сечі і урогенітального тракту (пієлонефрит, цистит, простатит, сальпінгоофорит та ін.), А також із захворюваннями жовчовивідної системи (гнійний холангіт, холецистит) і зберігаються в колекції ІКВС УрО РАН. Ідентифікацію мікроорганізмів проводили загальноприйнятими методами за морфологічними, тинкторіальними, культуральними та біохімічними властивостями з використанням систем "ENTEROTest" (LaChema, Чехія).

    Освіта биопленок ешеріхіями вивчали за допомогою "планшетного методу" [14], шляхом вирощування штамів E. coli в 150 мкл мясопеп-тонного бульйону (МПБ) в 96-ямковий полістиро-ролів планшеті протягом 24 год при 37 ° С, видалення з лунок планктонних клітин, фарбування биопленок 1% крісталвіолета, промивання лунок дистильованою водою, внесення в них 96% етанолу і виміру за допомогою планшетного фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптичної щільності (OD) надосадочной

    рідини при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення відповідала ступеня плівкоутворення досліджуваними культурами ешерихій.

    Для визначення серорезистентности, гідро-фобності і електрокінетичного потенціалу ешерихій використовували добові агарові культури E. coli, а також клітини з різних фракцій бульйонних культур ешерихій, інкубованих в лунках планшети. Планктонну фракцію клітин E. coli відбирали шляхом вилучення з лунок 100 мкл надосадової частини МПБ, що містить зважені бактерії; біопленочную фракцію ешерихій отримували шляхом додавання до осаду 100 мкл 15М розчину NaCl і механічної деструкції (диспергування) плівок. Обидві фракції клітин тричі відмивали 15М розчином NaCl (30 хв, 3000 об / хв) і стандартизованих по OD на фотоелектроколориметри КФК-2 (Росія) при довжині хвилі А, = 540 нм.

    Серорезистентність ешерихій оцінювалася за методикою [3] з використанням в досвіді 50% сироватки крові людини (пул від 20 здорових донорів), а в контролі - 15М розчину NaCl шляхом заміру за допомогою планшетного фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптичної щільності (OD) досвідчених і контрольних суспензій при довжині хвилі 540 нм і розрахунку індексу резистентності до бактерицидної активності сироватки (і-РБАС,%) за такою формулою: і-РБАС = ODо / ODк * 100, де ODо і ODк - оптичні щільності досвідчених і контрольних суспензій бактерій відповідно.

    Для оцінки ступеня гідрофобності ешерихій використовували метод поділу суспензії клітин E. coli в двофазної системі "рідина-рідина" з несмешивающимися водними фазами в 0,15 розчині NaCl, збагаченими поліетіленгліко-лем (PEG 6000, з кінцевою концентрацією 4,5%) і декстраном (Т500; з кінцевої концентрацією 6,2%), що представляє собою середній рівень межфазного поверхневого натягу [1, 10]. Емульгування суміші виробляли безпосередньо після додавання в неї бактерій шляхом інтенсивного струшування протягом 120 сек при кімнатній температурі на вортексі (2000 об / хв). Про гидрофобности бактерій судили за показником гідрофільно-ліпофільного балансу (ГЛБ), який розраховували за формулою: ГЛБ = Lg (ODpEG / ODDextran), де ODpeg і ODoextran -оптичні щільності верхньої (гидрофобной, збагаченої PEG 6000) фази і нижньої (гидрофильной, збагаченої декстраном Т500) фази відповідно, заміряних за допомогою спектрофотометра (СФ-46, А, = 541 нм, ширина кювети 1 см).

    Вимірювання електрокінетичного потенціалу (z-потенціалу, mV) клітин E. coli здійснювали амплітудно-частотним методом [16] з використанням Дзетометра-1М (Росія) в звичайному режимі його роботи (напруга - 10 В, частота -0,2 Гц) шляхом вимірювання амплітуди коливань 50 бактеріальних клітин в мікроелектрофоретіче-ської камері (розміри: 22x22 мм, висота 0,2 мм) і обчислення середніх значень z-потенціалу для конкретного даного штаму по апроксимувати формулою Смолуховского [5].

    Обробку даних здійснювали методами варіаційної статистики і кореляційного аналізу [6].

    РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

    Вивчені штами E. coli виявилися варіабельними за здатністю утворювати біоплівки: більшу частину вибірки (64,4 ± 7,2% ізолятів) склали біопленкообразующіе ешерихії (0D>0,2), а 35,6 ± 7,2% культур кишкової палички не утворювали біоплівки. Причому серед біопленкообразующіх ізолятів E. coli були культури як зі слабкою (0,2<0D<0,6), так і з високою (OD>0,6) експресією даної ознаки (42,2 ± 7,4 і 22,2 ± 6,3% штамів відповідно). Зіставлення вираженості інших характеристик у біопленкообразующіх E. coli і ешерихій без цієї властивості виявило достовірні (p<0,05) міжгрупові відмінності E. coli за рівнем сероре-резистентності і ступеня гідрофобності (табл.). Ешерихії, схильні до біопленкообразованію, були менш стійкі до бактерицидної активності сироватки (І-РБАС = 71,5 ± 6,5%) і володіли більш високим ступенем гідрофобності (ГЛБ = -0,42 ± 0,2 ум. Од.), чому не утворюють біоплівки штами E. coli (І-РБАС = 95,4 ± 2,8%; ГЛБ = -0,76 ± 0,3 ум. од .; відповідно).

    Результати кореляційного аналізу, проведеного всередині всієї вибірки E. coli і в групі біопленкообразующіх культур кишкової палички, також вказували на наявність у ешерихій достовірних взаємозв'язків їх здатності утворювати біоплівки з серорезистентного і гід-рофобностью (r = 0,39-0,47, p<0,05), а крім того, на зворотну залежність рівня стійкості E. coli до сироватці крові від ступеня їх гідро-фобності (r = -0,50, p<0,05).

    Для експериментального підтвердження взаємозв'язку біопленкообразованія ешерихій з їх серорезистентного і фізико-хімічними властивостями на 9 штамах кишкової палички, які формують виражені біоплівки (OD>0,6), проведено визначення зазначених властивостей у клітин E. coli, препаративно відібраних з планктонних і біопленочних фракцій.

    Таблиця 1

    Характеристика варіабельності ешерихій по серорезистентности і фізико-хімічними властивостями (з урахуванням їх здатності до біопленкообразованію)

    Характеристики Вивчені штами E. coli (n = 45)

    бактерій Чи не утворюють біоплівки (n = 16) Утворюють біоплівки (n = 29) Всього

    Частка штамів,% 35,6 ± 7,2 64,4 ± 7,2 100

    І-РБАС,% 60,0-105,2 4,3-100,2 4,3-100

    95,4 ± 2,8 71,5 ± 6,5 * 80,0 ± 4,6

    ГЛБ, ум. од. -2,13 - +0,93 -0,76 ± 0,3 -1,71- +2,04 -0,42 ± 0,2 * -2,13-2,04 -0,54 ± 0, 1

    z-потенціал, mV -12,5- -29,9 18,9 ± 1,2 -10,5- -33,6 -18,5 ± 1,0 -10.5--33,6) -18,7 ± 0,8

    Примітка: І-РБАС - індекс резистентності до бактерицидної активності сироватки; ГЛБ - гідрофільно-ліпофільний баланс; в чисельнику - діапазон варіювання ознаки; в знаменнику - середні значення; * - достовірні відмінності між групами (р<0,05).

    а)

    б)

    в)

    25 І-РБАС,%

    20

    15

    10

    -f-

    ПЛ

    0

    -0,05

    -0,1

    -0,15

    -0,2

    -0,25

    ПЛ

    ГЛБ (усл.ед.)

    -10

    -15

    -20

    -25

    ПЛ

    z-потенціал, mV

    Мал. 1. Характеристика клітин E. coli з різних фракцій по: а) серорезистентности (І-РБАС,%); б) гидрофобности (ГЛБ, ум. од.) і в) z-потенціалу (mV).

    Примітка: але осі абсцис - виразність ознаки; ПЛ - планктонні клітини (світлі стовпчики); БП - біопленочние клітини (темні стовпчики); * - достовірні відмінності між групами (р<0,05).

    Встановлено, що "планктонні" клітини Е. сої в порівнянні з "біопленочнимі" були в 1,2 рази стійкіше до бактерицидної активності сироватки крові (р<0,05) і в 1,7 рази більше гідрофільних (р<0,05), але достовірно не відрізнялися поz-потенціалу (рис.). У спеціальній серії дослідів з використанням цих же штамів Є. сої було показано, що ешерихії в «інтактних» біоплівках і в підвішеному стані після механічної дезінтеграції биопленок практично не відрізнялися за рівнем своєї серорезі-стентності і ступеня гідрофобності.

    При розвитку багатьох ендогенних бактеріальних інфекцій, включаючи позакишкові Ешері-

    хіози, ключовими етапами патогенезу є гематогенна дисемінація мікроорганізмів і колонізація ними тканин інфікованих органів [3, 4]. Реалізація зазначених процесів критично залежить від здатності збудників виживати при контакті з ефекторами імунітету (зокрема, системою комплементу сироватки крові) і адгезіроваться на поверхні клітин макроорганізму (в тому числі, з подальшим утворенням мікроколоній і биопленок) [11, 15]. У зв'язку з цим зрозуміло підвищена увага до вказаних характеристик Ешер-дисководу як пріоритетних збудників інфекційно-

    0

    5

    5

    0

    но-запальних процесів в урогенітальному тракті і жовчовивідної системі людини.

    Наведені в роботі дані, з одного боку, свідчать про варіабельності E. coli по серорезистентности, інтегральним физикохимических характеристикам (гидрофобность, z-потенціал) і здатності до біопленкообразова-нию, що відображає їх фенотипическое різноманітність і частково може бути обумовлено колекційним зберіганням бактеріальних культур, з іншого боку, відображають наявність певних взаємозв'язках між цими ознаками, що становить певний інтерес в декількох аспектах. Так, ще раз підтверджена зворотна залежність рівня стійкості ешерихій до когось плементопосредованной бактерицидної активності сироватки крові від ступеня гідрофобності E. coli, яка вказує на істотне значення стану гідратірованіем клітинної стінки грамнегативних бактерій в детермінації їх серорезистентности [1]. Однак інший інтегральний фізико-хімічний показник (елек-трокінетіческій потенціал) ешерихій слабо впливав як на їх стійкість до сироватці, так і на їх схильність до формування біоплівок, хоча вважається, що утворюється при цьому екзо- полісахаридних матрикс не тільки повідомляє мікроколонії додатковий негативний заряд , але і захищає бактерії від згубної дії ряду антимікробних речовин [8, 13]. У той же час виявлено зворотний кореляційний зв'язок серорезистентности ешерихій з їх здатністю утворювати біоплівки, яка на перший погляд може здатися парадоксальною, оскільки біопленкообразованіе "традиційно" пов'язують з підвищеною стійкістю мікроорганізмів до антибіотиків, антисептиків і дезінфектантів, «волюнтаристично» без належної експериментальної перевірки переносячи ці подання на захист бактерій від інших антимікробних речовин, в тому числі виконують функцію ефекторів імунітету макроорганізму [12]. Отримані результати змушують засумніватися в правомірності такої безумовної екстраполяції, що не враховує видову приналежність бактерій і особливості механізмів взаємодії різних ефекторних систем з ними. Звідси очевидна необхідність подальшого вивчення ролі біопленкообразованія у патогенних і потенційно патогенних мікроорганізмів при їх контакті з конкретними гуморальними ефекторами імунітету, що дозволить об'єктивно оцінити внесок даного властивості збудників в патогенез інфекціонновоспалітельних різної етіології. У цьому сенсі, виявлений більш високий рівень серорезистентности у "планктонних" клітин

    E. coli, в порівнянні з "біопленочнимі" Ешер-хіямі, представляється патогенетично цілком доцільним, так як саме вони беруть участь в гематогенної дисемінації збудників всередині макроорганізму, при якій неминуча їх зустріч з системою комплементу сироватки крові

    [9].

    (Робота виконана в рамках спільного проекту організацій УрО і ДВО РАН і гранту РФФД № 11-04-97102-р_поволжье_а).

    ЛІТЕРАТУРА

    1. БрудастовЮ.А., Гриценко В.А., Журлов О.С., Чертков К.Л. Характеристика гідрофобних властивостей бактерій при їх взаємодії з сироваткою крові // Журн. микробиол., епі-деміол. і іммунобіол. - 1997. - № 4. - С. 73-77.

    2. Брудастого Ю.А., Гриценко В.А., Кудря Є.В., Васильєва Л.В. Порівняльний аналіз стійкості ентеробактерій до жовчі // Журн. микробиол., епідеміолого. і іммунобіол. -2002. - № 3. - С. 65-67.

    3. Бухарін О.В., Брудастого Ю.А., Гриценко В.А., Дерябін Д.Г. Роль здатності бактерій до інактивації факторів природної противоинфекционной резистентності в їх стійкості до бактерицидної дії крові (сироватки крові). // Бюлл. експер. біол. і медичного. - 1996. - № 2. -С. 174-176.

    4. Гриценко В.А., Брудастого Ю.А., Журлов О.С. Серорезі-стентності ентеробактерій, виділених з різних джерел. // Журн. микробиол., епідеміолого. і іммунобіол.

    - 1999. - № 3. - С. 3-6.

    5. Журлов О.С., Гриценко В.А., Брудастого Ю.А. Вплив температури культивування на фізіологічні та фізико-хімічні властивості Escherichia coli K12 // Вісник ОДУ. -2009. - № 12. - С. 106-110.

    6. Лакіна Г.Ф. Біометрія. - М .: Вища. шк., 1990. - 212 с.

    7. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. -1999. - N284. - P. 1318-1322.

    8. DaveyM.E., O'Toole G.A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics // Microbiol. and Molec. Biol. Rev. - 2000.

    - N12. - P. 847-867.

    9. Lewis K. Riddle of biofilm resistance // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2001. - N4. - P. 999-1007.

    10. Magnusson KE, Stendahl O., Tagesson C., Edebo L., Johansson G. The tendency of smooth and rough Salmonella typhi-murium bacteria and lipopolysaccharide to hydrophobic and ionic interaction, as studied in aqueous polymer two-phase systems // Acta Pathol. Microbiol. Scand. (B). - 1977. - N85. -P. 212-218.

    11. Ofek I., Doyle R.J. Bacterial adhesion to cells and tissues // N.Y .: Chapman Hall, 1994.

    12. Oie S., Huang Y., Kamiya A., Konishi H., Nakazawa T. Efficacy of disinfectants against biofilm cells of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Microbios. - 1996. -N85. - P. 223 230.

    13. Ong C.Y., Ulett G.C., Mabbett A. N. et al. Identification of type 3 fimbriae in uropathogenic Escherichia coli reveals a role in biofilm formation // J. Bacteriol. - 2008. - N3. - P. 1054-1063.

    14. O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - N54.

    - P. 49-79.

    15. Pratt L.A., Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili // Mol. Microbiol. - 1998. - N30. - P. 285-293.

    16. Soni K.A., Balasubramanian A. K., Beskok A., Pillai S. D. Zeta Potential of Selected Bacteria in Drinking Water When Dead, Starved, or Exposed to Minimal and Rich Culture Media // Curr Microbiol. - 2008. - N 56. - P. 93-97.


    Ключові слова: біоплівки /серорезистентного /гідрофобні /Z-ПОТЕНЦІАЛ /ESCHERICHIA COLI /BIOFILM /SERORESISTANCE /HYDROPHOBIC /Z-POTENTIAL

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити