У статті представлені матеріали про варіабельності 45 штамів Escherichia coli від пацієнтів з інфекційно запальними захворюваннями урогенітального тракту і жовчовивідних шляхів по серорезистентности, інтегральним фізико хімічними параметрами (гидрофобность, електрокінетіческій потенціал z потенціал) і здатності до формування біоплівок. Встановлено, що біопленкообразующіе культури і «біопленочная» фракція ешерихій менш стійкі до бактерицидної активності сироватки і більш гідрофобні, ніж ізоляти E. coli, що не формують біоплівки, і клітини з «планктонної» фракції.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Гриценко Віктор Олександрович, Журлов Олег Сергійович, Андрейчев Віталій Васильович


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2012


    Журнал: Вісник Оренбурзького державного університету


    Наукова стаття на тему 'Аналіз взаємозв'язку серорезистентности і фізико хімічних властивостей кишкової палички зі здатністю до біопленкообразованію'

    Текст наукової роботи на тему «Аналіз взаємозв'язку серорезистентности і фізико хімічних властивостей кишкової палички зі здатністю до біопленкообразованію»

    ?Гриценко В.А., Журлов О.С., Андрейчев В.В.

    Інститут клітинної та внутрішньоклітинного симбіозу УрО РАН, м Оренбург

    E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    АНАЛІЗ взаємозв'язку серорезистентного І ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ КИШКОВОЇ ПАЛОЧКИ СО ЗДАТНІСТЮ До БІОПЛЕНКООБРАЗОВАНІЮ

    У статті представлені матеріали про варіабельності 45 штамів Escherichia coli від пацієнтів з інфекційно-запальними захворюваннями урогенітального тракту і жовчовивідних шляхів по серорезистентности, інтегральним фізико-хімічним параметрам (гідрофобних-ність, електрокінетіческій потенціал - z-потенціал) і здатності до формування біоплівок. Встановлено, що біопленкообразующіе культури і «біопленочная» фракція ешерихій менш стійкі до бактерицидної активності сироватки і більш гідрофобні, ніж ізоляти E. coli, що не формують біоплівки, і клітини з «планктонної» фракції.

    Ключові слова: Escherichia coli, біоплівки, планктонні клітини, серорезистентність, гід-

    рофобность, z-потенціал.

    Вступ

    Здатність бактерій утворювати біоплівки багатьма дослідниками розглядається як важлива властивість, що забезпечує виживання мікроорганізмів в несприятливих умовах (висушування, підвищена інсоляція тощо.), А також при їх контакті з антибіотиками і дезинфектантами [1-3]. Вважається, що формування мікроорганізмами биопленок має відношення до патогенезу багатьох інфекційно-запальних захворювань, в тому числі, асоційованих з катетерами і імплантатами [4, 5]. Разом з тим дані про вплив біопленкообразованія на стійкість бактерій, зокрема Escherichia coli як збудників позакишкових ешеріхіозов (запальна патологія сечо-і жовчовивідних шляхів, сепсис, нозокоміальні інфекції та ін.) [6, 7], до різних ефекторів імунітету макроорганізму поки нечисленні і суперечливі, що визначає актуальність досліджень, спрямованих на вивчення взаємозв'язку між зазначеними властивостями.

    Метою цієї роботи став аналіз взаємозв'язку серорезистентности і інтегральних фізико-хімічних характеристик (гідро-фобность, електрокінетіческій потенціал) ешерихій, виділених при інфекційно-запальних захворюваннях урогенітального тракту і жовчовивідних шляхів, з їх здатністю утворювати біоплівки.

    Матеріали і методи дослідження

    Дослідження виконані на 45 штамах Escherichia coli з колекції ІКіВС УрО РАН, виділених з урогенітального тракту і сечі

    у хворих з простатитом, сальпингоофоритом, пієлонефрит і цистит, а також з жовчі від пацієнтів з інфекційно-запальною патологією жовчовивідних шляхів (гнійний холангіт, холецистит). Ідентифікацію мікроорганізмів проводили загальноприйнятими методами за морфологічними, тинкторіальними, культуральними та біохімічними властивостями з використанням наборів «EnteroTest I і II» (LaChema, Чехія) [8].

    Освіта биопленок ешеріхіями вивчали за допомогою «планшетного методу» [9], шляхом вирощування штамів E. coli в 150 мкл ма-сопептонного бульйону (МПБ) в 96-ямковий полистироловой планшеті протягом 24 год при 37 ° С, видалення з лунок планктонних клітин , фарбування биопленок 1% розчином крис-таллвіолета, промивання лунок дистильованою водою, внесення в них 96% етанолу і виміру за допомогою фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптичної щільності (OD) надосадової рідини при довжині хвилі (л) 540 нм. Інтенсивність забарвлення відповідала ступеня плівкоутворення досліджуваних культур ешерихій.

    При визначенні серорезистентности, гід-рофобності і електрокінетичного потенціалу ешерихій використовували добові агарові культури E. coli, а також клітини з різних фракцій бульйонних культур ешерихій, інкубованих в лунках полістиролових планшети. Планктонну фракцію клітин E.coli відбирали шляхом вилучення з лунок 100 мкл надосадової частини МПБ, що містить зважені бактерії; біопленочную фракцію клітин ешерихій отримували шляхом додавання до осаду 100

    мкл 15М розчину NaCl і механічної дезінтеграції плівок. Обидві фракції клітин тричі відмивали 15М розчином NaCl (30 хв, 3000 об / хв) і стандартизованих по OD на фотоелектроколориметри КФК-2 (Росія) при л = 540 нм.

    Серорезистентність ешерихій оцінювалася за методикою [10] з використанням в досвіді 50% сироватки крові людини (пул від 20 здорових донорів), а в контролі - 15М розчину NaCl шляхом заміру за допомогою фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптичної щільності ( OD) досвідчених і контрольних суспензій при л = 540 нм і розрахунку індексу резистентності до бактерицидної активності сироватки (і-РБАС,%) за такою формулою: і-РБАС = ODо / ODк * 100, де ODо і ODx - оптичні щільності досвідчених і контрольних суспензій бактерій відповідно.

    Для оцінки ступеня гідрофобності Ешер-дисководу використовували метод поділу суспензії клітин E. coli в двофазної системі «рідина-рідина» з несмешивающимися водними фазами в 0,15 розчині NaCl, збагаченими поліетилен-ленгліколем (PEG 6000, з кінцевою концентрацією 4,5%) і декстраном (Т500; з кінцевої концентрацією 6,2%), що забезпечувало середній рівень межфазного поверхневого натягу [11, 12]. Емульгування суміші виробляли безпосередньо після додавання в неї бактерій шляхом інтенсивного струшування на злодій-текс (2000 об / хв) протягом 120 сек при кімнатній температурі. Про гидрофобности бактерій судили за показником гідрофільно-ліпо-профільного балансу (ГЛБ), який розраховували за формулою: ГЛБ = Lg (ODpEG / ODDextran), де ODpEG і ODDextran - оптичні щільності верх-

    ній (гидрофобной, збагаченої PEG 6000) фази і нижньої (гидрофильной, збагаченої декстраном Т500) фази відповідно, заміряних за допомогою фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) при л = 540 нм.

    Вимірювання електрокінетичного потенціалу (z-потенціалу, mV) клітин E. coli здійснювали амплітудно-частотним методом [13] з використанням Дзетометра-1М (Росія) в звичайному режимі його роботи (напруга - 10 В, частота -0,2 Гц) шляхом вимірювання амплітуди коливань 50 бактеріальних клітин в мікроелектрофореті-чеський камері (розміри: 22г22 мм, висота 0,2 мм) і обчислення середніх значень z-потенціалу для конкретного даного штаму по апроксимувати формулою Смолуховского [14].

    Обробку даних здійснювали методами варіаційної статистики і кореляційного аналізу [15].

    Результати дослідження

    Вивчені штами E. coli виявилися варіабельними за здатністю утворювати біоплівки. Менша частина (35,6 ± 7,2%) культур еше-ріхій не утворювалися біоплівки, а 64,4 ± 7,2% ізолятів E. coli були здатні до біопленкооб-разованию (OD>0,2). Причому серед останніх біопленкообразующіх ізолятів E. coli були культури як зі слабкою (OD<0,6), так і з високою (OD>0,6) експресією даної ознаки (42,2 ± 7,4 і 22,2 ± 6,3% штамів відповідно).

    Зіставлення вираженості інших характеристик (серорезистентність, ступінь гід-рофобності і величина z-потенціалу) у еше-ріхій з урахуванням їх здатності до біопленкооб-разованию виявило ряд достовірних (p<0,05) міжгрупових відмінностей E. coli (таблиця).

    Таблиця. Cерорезістентность і фізико-хімічні властивості ешерихій з урахуванням їх здатності до біопленкообразованію

    Характеристики бактерій Штами E. coli Всього (n = 45)

    Чи не утворюють біоплівки (П = 16) Утворюють біоплівки (n = 29)

    І-РБАС. % 60.0-132.4 4.3-130.6 4.3-132.4

    104.1i4.5 76.6i7.5 * 86.4i5.4

    ГЛБ. уел. од. -2.13 ... + 0.38 -0.79i0.24 -1.71 +1.93 -0.39i0.15 * -2.13 ... 1.93 -0.53i0.13

    z-потенціал, mV -12.5.-29.9 18.9i1.2 -10.5 ...- 33.6 -18.5i1.0 -10.5.-33.6 -18.7i0.8

    Примітка: в чисельнику - діапазон варіювання ознаки; в знаменнику - середні значення; І-РБАС - індекс резистентності до бактерицидної активності сироватки; ГЛБ - гідрофільно-ліпофільний баланс; * - достовірні відмінності між групами (р<0,05)

    Так, ешерихії, схильні до біопленкообра-тання, були менш стійкі до бактерицидної активності сироватки (І-РБАС = 76,6 ± 7,5%) і володіли більш високим ступенем гідрофобнос-ти (ГЛБ = -0,39 ± 0,15 ум. од.), ніж ізоляти Е. еоІ, що не утворюють біоплівки (і-РБАС = 104,1 ± 4,5% і ГЛБ = -0,79 ± 0,24 ум. од. відповідно), але практично не відрізнялися один від одного за величиною 7-потенціалу. При цьому мінімальний рівень серорезистентности (І-РБАС = 72,4 ± 9,1%) демонстрували ізоляти ешерихій, що утворюють «товсті» біоплівки (ПРО>0,6), а гидрофобность клітин «планктонних» фракцій біопленкообразующіх штамів (ГЛБ = -0,68 ± 0,08) була порівнянна з гідрофобних-ністю ешерихій, що не володіють здатністю утворювати біоплівки (р>0,05).

    Результати кореляційного аналізу також вказували на наявність у кишкових паличок достовірних (р<0,05) взаємозв'язків їх здатності утворювати біоплівки з рівнем серорезистентности (r = -0,36) і ГЛБ (r = 0,31), а крім того на зворотну залежність рівня стійкості еше-ріхій до бактерицидної активності сироватки від ступеня їх гідрофобності ( г = -0,46).

    Для експериментального підтвердження взаємозв'язку біопленкообразованія кишкових паличок з їх серорезистентного і фізико-хімічні властивості на 9 штамах Е. еоІ, які формують виражені біоплівки (ПРО>0,6), проведено визначення зазначених

    властивостей у клітин ешерихій, препаративно відібраних з планктонної і біопленочной фракцій (малюнок).

    Встановлено, що «планктонні» клітини Е. еоІ в порівнянні з «біопленочнимі» були в 1,2 рази стійкіше до бактерицидної активності сироватки крові і в 1,7 рази більше гідрофільних (р<0,05), але достовірно не відрізнялися по 7-потенціалу. Крім того, в спеціальній серії дослідів з використанням цих же штамів Є. еоІ показано, що механічна дезінтеграція биопленок практично не змінювала рівень серорезистентности ешерихій.

    Обговорення

    При розвитку багатьох ендогенних бактеріальних інфекцій, включаючи позакишкові еше-ріхіози, ключовими етапами патогенезу є гематогенна дисемінація мікроорганізмів і колонізація ними тканин інфікованих органів [7]. Реалізація зазначених процесів критично залежить від здатності збудників виживати при контакті з ефекторами імунітету (зокрема, системою комплементу сироватки крові) і адгезіроваться на поверхні клітин макроорганізму (в тому числі, з подальшим утворенням мікроколоній і биопленок) [6, 16, 17]. У зв'язку з цим зрозуміло підвищена увага до вказаних характеристик ешерихій як пріоритетних збудників інфекційно-запальних

    а)

    25 І-РБАС,%

    ь

    б)

    в)

    15

    10

    пл

    0

    -0,05

    -0,1

    -0,15

    -0,2

    -0,25

    пл

    ГЛБ (усл.ед.)

    -10 -

    -15 -

    -20 -

    -25 -

    пл

    z-пoтенціaл, ТМ

    Позначення: ПЛ - клітини планктонної фракції; БП - клітини біопленочной фракції; * - достовірні відмінності між групами (р<0,05)

    Малюнок. Характеристика клітинних фракцій Е. соїі по серорезистентности (а); гидрофобности (б) і z-потенціалу (в)

    процесів в урогенітальному тракті і жовчовивідної системі.

    Наведені в роботі дані свідчать не тільки про варіабельності E. coli по серорезистентности, інтегральним фізико-хімічними характеристиками (гидрофобность, z-потенціал) і здатності до біопленкообразова-нию, що відображає їх фенотипическое різноманітність і частково може бути обумовлено колекційним зберіганням бактеріальних культур, але і про певні взаємозв'язки між цими ознаками, що представляють інтерес в декількох аспектах. Так, ще раз підтверджена зворотна залежність рівня стійкості еше-ріхій до комплементопосредованной бактерицидної активності сироватки крові від ступеня гідрофобності E. coli, яка вказує на істотне значення стану гідратірованнос-ти клітинної стінки грамнегативних бактерій в детермінації їх серорезистентности [12]. Однак інший інтегральний фізико-хімічний показник (z-потенціал) ешерихій слабо впливав як на їх стійкість до сироватці, так і на їх схильність до формування біоплівок, хоча вважається, що утворюється при цьому ек-зополісахарідний матрикс не тільки повідомляє мікроколонії додатковий негативний заряд, але і захищає бактерії від згубної дії ряду антимікробних речовин [4, 5]. У той же час виявлено зворотний кореляційний зв'язок серорезистентности ешерихій з їх здатністю утворювати біоплівки, яка, на

    перший погляд, може здатися парадоксальною, оскільки біопленкообразованіе «традиційно» пов'язують з підвищеною стійкістю мікроорганізмів до антибіотиків, антисептиків і дезінфектантів, волюнтаристично переносячи ці уявлення на захист бактерій від інших антимікробних речовин, в тому числі, що виконують функцію ефекторів імунітету макроорганізму [2, 3] . Отримані результати змушують засумніватися в правомірності такої безумовної екстраполяції, що не враховує видову приналежність і джерело виділення бактерій, а також особливості механізмів взаємодії різних ефекторних систем з ними. Звідси очевидна необхідність подальшого вивчення ролі біопленкообразо-вання у патогенних і потенційно патогенних мікроорганізмів при їх контакті з конкретними гуморальними ефекторами імунітету, що дозволить об'єктивно оцінити внесок даного властивості збудників в патогенез інфекційно-запальних захворювань різної етіології. У цьому сенсі, виявлений більш високий рівень серорезистентности у «планктонних» E. coli, в порівнянні з «біопленочнимі» ешеріхіями, представляється патогенетично цілком доцільним, так як саме клітини, що не асоційовані тісно з біоплівки збудників, беруть участь в гематогенной діссеміна-ції всередині макроорганізму , при якій неминуча їх зустріч з системою комплементу сироватки крові [6, 7].

    ------------------------------ 21.06.2011

    Список літератури:

    1. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999. 284: 1318-1322.

    2. Oie S., Huang Y., Kamiya A., Konishi H., and Nakazawa T .. Efficacy of disinfectants against biofilm cells of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. 1996. Microbios. 85: 223-230.

    3. Lewis K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2001. 4: 999-1007.

    4. Davey M.E., O'Toole G.A .. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. and Molec. Biol. Rev. 2000. 12: 847-867.

    5. Ong C.Y., Ulett G.C., Mabbett A. N. et all .. Identification of type 3 fimbriae in uropathogenic Esherichia coli reveals a role in biofilm formation. J. Bacteriol. 2008. 3: 1054-1063.

    6. Гриценко В.А., Брудастого Ю.А., Журлов О.С. Серорезистентність ентеробактерій, виділених з різних джерел. Ж. микробиол., Епідеміолого. і іммунобіол. 1999. 3: 3-6.

    7. Гриценко В.А., Іванов Ю.Б. Роль персистентних властивостей в патогенезі ендогенних інфекцій. Ж. микробиол., Епідеміолого. і іммунобіол. 2009. 4: 66-71.

    8. Довідник по мікробіологічним і вирусологическим методам дослідження / Под ред. М.О. Біргера. М .: Медицина, 1982. 464 с.

    9. O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Ann. Rev. Microbiol. 2000, 54: 49-79.

    10. Бухарін О.В., Брудастого Ю.А., Гриценко В.А., Дерябін Д.Г. Роль здатності бактерій до інактивації факторів природної противоинфекционной резистентності в їх стійкості до бактерицидної дії крові (сироватки крові). Бюлл. експер. біол. і медичного. 1996. 2: 174-176.

    11. Magnusson K.E., Stendahl O., Tagesson C., Edebo L., Johansson G. The tendency of smooth and rough Salmonella typhimurium bacteria and lipopolysaccharide to hydrophobic and ionic interaction, as studied in aqueous polymer two-phase systems. Acta Pathol. Microbiol. Scand. (B). 1977. 85: 212-218.

    12. Брудастого Ю.А., Гриценко В.А., Журлов О.С., Чертков К.Л. Характеристика гідрофобних властивостей бактерій при їх взаємодії з сироваткою крові. Ж. микробиол., Епідеміолого. і іммунобіол. 1997. 4: 73-77.

    13. Soni K.A., Balasubramanian A. K., Beskok A., Pillai S. D. Zeta Potential of Selected Bacteria in Drinking Water When Dead, Starved, or Exposed to Minimal and Rich Culture Media. Curr. Microbiol. 2008. 56: 93-97.

    14. Журлов О.С., Гриценко В.А., Брудастого Ю.А. Вплив температури культивування на фізіологічні та фізико-хімічні властивості Escherichia coli K12. Вісник Оренбурзького державного університету. 2009. 12: 106-110.

    15. Лакіна Г.Ф. Біометрія. М .: Вища. шк., 1990. 352 с.

    16. Ofek I., Doyle R.J. Bacterial adhesion to cells and tissues. Chapman Hall, 1994. Inc., New York, N.Y.

    17. Pratt L.A., Kolter R .. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. 1998. 30: 285-293.

    Робота виконана в рамках спільного проекту організацій УрО, СО і ДВО РАН

    Відомості про авторів:

    Гриценко Віктор Олександрович, завідувач лабораторією клітинного симбіозу

    Інституту клітинної та внутрішньоклітинного симбіозу Уральського відділення Російської академії наук (м Оренбург), доктор медичних наук, професор Журлов Олег Сергійович, старший науковий співробітник лабораторії клітинного симбіозу

    Інституту клітинної та внутрішньоклітинного симбіозу Уральського відділення Російської академії

    наук (м Оренбург), кандидат медичних наук Андрейчев Віталій Васильович, заочний аспірант Інституту клітинної та внутрішньоклітинного

    симбіозу Уральського відділення Російської академії наук (м Оренбург), лікар-дерматовенеролог ММУЗ Муніципальна міська клінічна лікарня ім. Н.І. Пирогова, м Оренбург 460000, г. Оренбург, ул. Піонерська, 11, тел .: (3532) 770512, е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    UDC 579.22

    Gritsenko V.A., Zhurlov O.S., Andreychev V.V.

    The Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis UB RAS, Orenburg

    ANALISIS OF INTERCONNECTION OF SERUMRESISTENCE AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF ESCHERICHIA COLI WITH THEIR ABILITY TO FORM BIOFILMS

    The article includes materials about variability of 45 strains Escherichia coli from patients with infectious-inflammatory diseases of an urogenital tract and biliary ways to serumresistence, integral physico-chemical properties (hydrophobicity, electrokinetic potential - z-potential) and ability to form biofilms. Bacterial isolates forming biofilms and «biofilm« fraction of E. coli are less resistant to bactericidal activity of serum and more hydrophobic, than isolates E. coli not forming biofilms, and cells from «planktonic» fraction was established.

    Key words: Escherichia coli, biofilms, planktonic cells, serumresistence, hydrophobicity, z-potential.


    Ключові слова: біоплівки /планктону клітки /серорезистентного /гідрофобні /Z-ПОТЕНЦІАЛ /ESCHERICHIA COLI

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити