У статті представлений аналіз проблеми репрезентативності дослідних даних по визначенню активності ферментів щодо різних субстратів. На прикладі рослинних пероксидаз показана обмеженість методів визначення ферментативної активності при високій субстратної специфічності ферменту. Розроблено схему визначення пероксидазною активності препаратів по субстрату-відновники фенолу, вказані оптимальні параметри процесу. Показано, що використання аналітичної реакції фенолу з 4-аміноантипірину дозволяє застосовувати його як субстрат-відновник для відтвореного оцінювання пероксидазною активності очищених ферментів і ферментних препаратів. Запропоновано спосіб непрямого визначення пероксидазною активності ферментних препаратів по фенолу, заснований на використанні калібрувальних залежностей, отриманих при вивченні активності ферментних препаратів з певним ступенем очищення як стандарт.

Анотація наукової статті по промисловим біотехнологій, автор наукової роботи - Вяткіна О.В., Бажин В.Ю., Александрова Д.Д.


ANALYSIS OF THE PROBLEM OF DETERMINING THE ACTIVITY OF ENZYME PREPARATIONS

This article presents an analysis of the problem of representatives of research data on the determination of enzyme activity in relation to various substrates. We have shown many units of activity of enzyme preparations with various purifications used in modern studies. Also the impossibility of comparing units with each other. The limitations of the methods for determining the enzymatic activity with the highest substrate specificity of the enzyme are shown by the example of plant peroxidases. Phenol is a common ecotoxicant and is used as the main agent that reduces peroxidase. The problem of comparing the effectiveness of enzyme preparations with various degrees of purification is shown. Due to the impossibility of comparing unit activity. To solve this problem, a scheme was developed for determining the peroxidase activity of drugs by phenol as a reducing substrate and the optimal process parameters were indicated. Using the analytical interaction between phenol and 4-aminoantipyrine allows it to be used as a reducing agent for the reproducible assessment of the peroxidase activity of purified enzymes and enzyme preparations. A method for indirect determination of peroxidase activity of enzyme preparations by phenol based on the use of calibration dependencies is proposed. The following relationships were constructed in this study: 1. the dependence of the rate of phenol oxidation by peroxidase on the concentration of hydrogen peroxide; 2. the dependence of the rate of peroxidase oxidation of phenol on the initial concentration of the substrate; 3. The dependence of the initial rates of peroxidase oxidation of phenol on the concentration of the enzyme (HRP); 4. The dependence of the initial reaction rate of peroxidase oxidation of phenol on the effective activity of the enzyme (HRP); 5. The dependence of the optical density of indicator systems on the effective activity of the enzyme (HRP). The method for determining activity proposed in the study was tested to determine the activity of a crude enzyme extracted from black radish root. The difference in the values ​​of the activity of the crude enzyme calculated according to the constructed dependencies and the theoretical value of the total protein mass is shown. Features of using the described method are revealed, possible limits of applicability for extremely inactive enzymes are indicated, and theoretical solutions to the identified shortcomings are proposed.


Область наук:
  • промислові біотехнології
  • Рік видавництва: 2019
    Журнал
    Вчені записки Кримського федерального університету імені В. І. Вернадського. Біологія. хімія
    Наукова стаття на тему 'АНАЛІЗ ПРОБЛЕМИ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТОВ'

    Текст наукової роботи на тему «АНАЛІЗ ПРОБЛЕМИ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТОВ»

    ?ХІМІЧНІ НАУКИ

    Вчені записки Кримського федерального університету імені В. І. Вернадського Біологія. Хімія. Том 5 (71). 2019. № 4. С. 248-261.

    УДК 577.152

    АНАЛІЗ ПРОБЛЕМИ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТНИХ

    ПРЕПАРАТІВ

    Вяткіна О. В.1, Бажин В. Ю.1, Александрова Д. Д.2

    1Тавріческая академія (структурний підрозділ) ФГАОУВО «Кримський федеральний університет ім. В. І. Вернадського », Сімферополь, Республіка Крим, Росія 2Хіміко-біологічний кластер федерального державного автономного освітнього закладу вищої освіти« Санкт-Петербурзький національний дослідницький університет інформаційних технологій, механіки і оптики »", Санкт-Петербург, Росія E-mail: oksana_vyatkina @ list.ru

    У статті представлений аналіз проблеми репрезентативності дослідних даних по визначенню активності ферментів щодо різних субстратів. На прикладі рослинних пероксидаз показана обмеженість методів визначення ферментативної активності при високій субстратної специфічності ферменту. Розроблено схему визначення пероксидазною активності препаратів по субстрату-відновники фенолу, вказані оптимальні параметри процесу. Показано, що використання аналітичної реакції фенолу з 4-аміноантипірину дозволяє застосовувати його як субстрат-відновник для відтвореного оцінювання пероксидазною активності очищених ферментів і ферментних препаратів. Запропоновано спосіб непрямого визначення пероксидазною активності ферментних препаратів по фенолу, заснований на використанні калібрувальних залежностей, отриманих при вивченні активності ферментних препаратів з певним ступенем очищення як стандарт.

    Ключові слова: пероксидаза, ферментативна активність, фенол, калібрувальний графік. ВСТУП

    Унікальна специфічність ферментів і високі швидкості реакцій з їх участю роблять ферменти і препарати, створені на їх основі привабливими для вирішення багатьох завдань промисловості, сільського господарства, екології, медицини. Основними джерелами ферментів є «живі» клітини, різного походження, але однозначно є багатокомпонентними системами складного хімічного складу і фізико-хімічних властивостей. Переважна більшість ферментів - це речовини білкової природи. Хоча в даний час розроблені схеми синтезу і хімічної модифікації активних центрів деяких ферментів, на увазі трудомісткості і високої вартості даних схем, основним методом отримання

    ферментів досі є їх виділення з біологічних об'єктів. Витяг ферменту з клітинної середовища як правило пов'язане зі зміною його активності та вибірковості під впливом нових зовнішніх факторів (Т, Р, рН). Для стабілізації ферменту, а іноді для підвищення його активності проводять процеси очищення препарату або іммобілізацію. В результаті перед дослідниками, особливо прикладної спрямованості, не залежно від того, де планується використання отриманих препаратів: в аналітичних цілях або в технологічних схемах, виникає проблема визначення їх активності і отримання при цьому даних, які можна було б порівнювати з іншими даними незалежно від методу дослідження.

    При виборі методу необхідно враховувати, що час аналізу часто важливіше точності. Наприклад, на етапі виділення фермент може инактивироваться по ряду причин, тому, затягувати цей етап не доцільно. Тобто, метод, що дозволяє за 10 хвилин визначити активність ферменту з похибкою в 5% краще того, що за 30 хвилин визначить активність з похибкою в 1%.

    Велику складність представляє робота з виділеними з рослинної сировини неочищеними ферментними препаратами, часто містять фермент в микроколичествах. При визначенні активності ферменту в таких системах необхідно підібрати правильну «одиницю активності», яка б кількісно висловлювала його чистоту і ефективність дії [1]. У науковому середовищі проблема вибору одиниць активності ферменту стоїть дуже гостро. Багато дослідників відзначають, що одиниці вимірювання активності, отримані для одного і того ж ферменту різного ступеня очищення в системах різного складу щодо різних субстратів порівнювати некоректно, тим більше робити висновки про активність ферменту і його препаратів щодо інших субстратів [2]. Щодо стандартні одиниці активності зустрічаються в роботах, де фермент використовується в «чистому вигляді», тобто із заздалегідь встановленої ступенем очищення, яка найчастіше характеризується RZ-фактором. За одиницю активності (е. А) в таких роботах часто приймають кількість ферменту, окисляє 1 мкмоль речовини за 1 хвилину. Але навіть в таких випадках одиниці вимірювань самого кількості ферменту часто не регламентуються, це може бути, наприклад, масова частка в мкг ферменту на мг матеріалу, молярность розчину ферменту, а значить і одиниці активності ферменту будуть відрізнятися [3-5]. Також для вираження ферментної активності застосовуються такі одиниці як «Катал» і «Молекулярна активність». Остання одиниця використовується виключно для чистих ферментів [6-8]. Одиниці активності ферменту можуть вибиратися і з урахуванням вивченості структури ферменту. Так, якщо відома точна кількість активних центрів в молекулі ферменту, то можна використовувати «активність каталітичного центру» характеризується таким числом молекул субстрату, яке перетворюється за 1 хв, в розрахунку на один активний центр. Хоча дана одиниця активності зустрічається вкрай рідко.

    Через дорожнечу чистих ферментів, часто в дослідженнях використовуються ферментні препарати, самостійно отримані з біоматеріалів. як

    правило, оцінювання точних концентрацій ферментів в таких системах проблематично, тому багато авторів вважають за краще йти від абсолютних кількісних одиниць активності, замінюючи їх відносними показаннями. При цьому, описуючи активність досліджуваного ферментного препарату, відносячи його активність до стандартним зразком цього ферменту, виміряні в однакових умовах, знижується похибка визначення його активності [5-14]. Так само умовною одиницею активності може виступати зміна оптичної щільності системи [15], обсяг виділився або поглиненого в індикаторної реакції газу, інтенсивність люмінесценції, інше легко реєстроване зміна системи, що викликається конкретним кількістю ферменту, наприклад, масою білка, що знаходиться в пробі, масою досліджуваного препарату , масою вихідного рослинної сировини, обсягом ферментного препарату, отриманого з рослинної сировини, за певний проміжок часу [16].

    У наших дослідженнях для створення аналітичних тест-систем і каталізаторів водоочистки ми використовуємо препарати з пероксидазною активністю, виділені з рослинної сировини. Пероксидаза є строго специфічною стосовно пероксиду водню і широко специфічною - до інших органічних і неорганічних субстратів, серед яких в якості стандартів зазвичай застосовують пирокатехин (о-діоксібензол), пирогаллол (1,2,3-трігідроксібензол1,2,3-трігідроксібензол) , гваякол (2-метоксіфенол), бензидин (4,4 'діамінодіфеніл), о-діанізідін, 2,2-азінобіс- (3-

    етілбензотіазолін-6-сульфоновая) кислота (АБТС) і так далі [16, 17]. Однак спектр субстратів-відновників пероксидази набагато ширше, з чим і пов'язаний практичний інтерес в її застосуванні, а кількість стандартних методик визначення обмежена, як і не існує однаковості в кількісному вираженні одиниць активності ферменту, що викликає складності в оцінці ефективності роботи каталізатора і визначенні механізму його дії. Також практичний інтерес викликає порівняння ферментної активності таких препаратів з певним стандартом, в якості якого виступає, як правило, комерційна пероксидаза хрону (Horseradish peroxidase, HRP) певної міри очищення (RZ), активність якої визначена виробником по одному з вище перерахованих субстратів, що ні дає можливості якимось чином припустити її активності щодо інших субстратів, навіть близьких за хімічною природою до вище зазначеним в реальних окислювальних системах складного складу.

    Так, наприклад, відомо, що фенол є екотоксикантами, що потрапляють у стічні води підприємств паперового, нафтового, полімерного виробництв, виробництв каучуку і стали. При хлоруванні води в процесі водоочищення можуть утворюватися більш токсичні похідні хлорфеноли [18]. Саме для видалення фенолу і його хлорпроізводних з стічних вод в процесі доочистки найчастіше і використовуються пероксидази [19]. Цілком логічно і корисно було б при розробці нових ферментних каталізаторів з пероксидазного дією оцінювати їх активність саме щодо реальних забруднювачів, порівнюючи її з активністю еталонного ферменту і при цьому отримувати уніфіковані,

    мають тотожний фізичний зміст дані, придатні для зіставлення та аналізу. Однак методика визначення активності ферменту за цими субстратів відсутня, внаслідок багатокомпонентної систем, складності механізмів протікають реакцій і проблем підбору аналітичних реагентів для контролю залишкових концентрацій субстрату. У зв'язку з цим для нас інтерес представляла розробка уніфікованого методу визначення пероксидазною активності ферментних препаратів на прикладі нестандартного субстрату відновника -феноли.

    МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

    Об'єктом дослідження була пероксидаза, виділена з коренеплодів редьки чорної (Raphanus sativus 'Niger'). Екстрагували фермент фосфатним буфером (рН = 7) з очищеного і подрібненого рослинної сировини. Екстракцію проводили за методикою, описаної Селібера без подальшого очищення [20]. Супернатант відокремлювали від рослинної маси центрифугуванням при 5000 об., Вміст нативной пероксидази в ньому оцінювали за кількістю активних центрів ферріпорфіріна пероксидази (далі О.Ц.) в одиниці об'єму,

    фотоколориметрично (А = 400 нм, l = 2 см, Е400 = 9,6-104 л) [3]. В якості

    моль • см

    стандарту використовували очищену пероксидазу хрону (HRP), (виробник: «Budapest Hungary», RZ 0,6). Загальний вміст білка в системах, що містять фермент, визначали біуретовим методом по каліброване графіком (А = 540 нм, l = 1 см) [21].

    Як субстрат-окислювача використовували пероксид водню виробництва «Росбі», точну концентрацію якого встановлювали методом перманганатометріческого титрування [22].

    Субстратом-відновником був обраний фенол, чда, виробництва «вітах», додатково очищений перегонкою. Концентрацію фенолу в водних розчинах визначали фотоколориметрично, по реакції з 4-міноантіпіріном в присутності катіонів Fe3 +, (pH = 10,0, ^ = 470 нм, l = 1 см) [23]. Все фотоколориметричні визначення проводили на приладі ЕКСПЕРТ-003.

    У зв'язку з тим, що нами не було знайдено відомостей про використання чистого фенолу в якості субстрату для визначення активності ферментних препаратів на основі пероксидази, на першому етапі досліджень виникла необхідність в розробці такого методу. Для цього було необхідно підібрати оптимальні умови: час експозиції, концентрацію ферменту і концентрації субстрату-окислювача, при яких кількість субстрату-відновника в системах змінювалося б з часом лінійно. Це необхідно для визначення початкової швидкості реакції, а, отже, і активності ферментного препарату.

    Сумарний обсяг системи становив 0,05 л. Систему А - стандарт: пероксидаза хрону RZ 0,6, Н2О2, С6Н5ОН, використовували для підбору оптимальних умов визначення активності пероксидази по фенолу. Система В - тестова: фосфатно-буферний екстракт пероксидази редьки чорної, Н2О2, С6Н5ОН. Концентрацію (О.Ц.) ферменту в системах варіювали від 1 • 10-9 до 1 • 10-5 моль / л, що

    відповідало C (#RP) = 4-10 - 4-102 мг / л. Концентрацію Н2О2 в системі А варіювали від 1 до 1 • 10-4 моль / л, вміст фенолу від 3-10 "6 до 5-10" 4 моль / л. В системі В використовували встановлені за результатами дослідження системи А оптимальні концентрації субстратів окислювача і відновника.

    Як розчинник у всіх системах використовували фосфатний буфер з рН = 7. Усі вимірювання проводили при кімнатній температурі (t = 25 ° C). Час експозиції, т, при підборі оптимальних умов визначення початкових швидкостей реакції варіювали в інтервалі 1 - 30 хв. Після закінчення заданого часу в систему додавали 1 мл 1 М H2SO4 для інактивації ферменту і зупинки реакції. Швидкість реакції визначали по зміні концентрації фенолу.

    Активність ферментних препаратів визначали за початковою швидкості окислення субстрату-відновника. За одиницю питомої активності, при роботі з очищеним ферментом, взяли кількість субстрату (мкМ), окисленого в присутності 1 мг ферментного препарату протягом 1 хвилини, за формулою:

    A = ^ (D

    g t

    Де: АС - зміна концентрації субстрату (мкмоль / л) за час експозиції системи т (хв); V - об'єм окисної системи (л); g - навішування ферментного препарату (мг).

    За одиницю молярної активності, при роботі з очищеним ферментом, взяли кількість субстрату (мкМ), окисленого в присутності 1 моль ферментного препарату протягом 1 хвилини, за формулою:

    л AC • V

    A = - (2)

    n t

    Де: АС - зміна концентрації субстрату (мкмоль / л) за час експозиції системи т (хв); V - об'єм окисної системи (л); n - кількість речовини ферментного препарату (моль).

    У системах В активність нативної пероксидази, висловлювали так само кількістю субстрату (мкМ), окисленого в присутності 1 мкмоль активних центрів (па.ц.) ферментного препарату за 1 хвилину.

    За даними визначення активності по фенолу для стандарту - очищеної пероксидази, будували різні види калібрувальних залежностей, що пов'язують аналітичний сигнал з масою і кількістю О.Ц. ферменту. Дані залежності використовували для оцінки активності пероксидази, екстрагованої з рослинної сировини без додаткового очищення. Обробку результатів проводили методами математичної статистики в програмі «Microsoft Excel».

    РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

    Результати досліджень показали, що в системах (А), при фіксованій початковій концентрації фенолу 5 • Ю-4 М в присутності різних концентрацій пероксиду водню і варіюванні часу експозиції т, спостерігалося лінійне

    зниження оптіческоі щільності аналітичного розчину, а, отже, зменшення остаточноІ концентрації фенолу в системі протягом перших 10 хв. Після чого спостерігалося зростання фіктивного светопоглощения внаслідок появи в системі каламуті, обусловленноі конденсації продуктів окислення фенолу [24]. У зв'язку з чим часом експозиції у всіх подальших експериментах було обраний проміжок 10 хв.

    Варіювання змісту субстрату окислювача в системах (А) показало, що при концентрації Н2О2 нижче 1 • 10-3 М достовірно визначаються змін концентрації фенолу в плині часу експозиції не відбувалося. Аналогічна картина спостерігалася при внесенні в системи пероксидази в концентраціях нижче 1 • 10-8 М. Тому ми обмежилися, в подальших дослідженнях, вужчими інтервалами концентрацій зазначених компонентів. Так в системах з фіксованою концентрацією ферменту 1 • 10-7 М (А1) і 110-6 М (А2) були отримані залежності швидкості реакції від початкової концентрації субстрату окислювача, показані на (рис. 1, 2). Видно, що при малих концентраціях субстрату-окислювача ці залежності носять лінійний характер, що відповідає першому порядку реакції за основним субстрату. При концентраціях пероксиду водню більше 0,08 М в системі (А1) і більше 0,02 М (А2), криві залежностей швидкостей реакції від концентрації субстрату-окислювача виходять на плато, тобто порядок реакції стає близьким до нуля, що повністю відповідає схемі Міхаеліса-Ментен [25].

    5 моль

    V | 10 г лмін

    3,5 --

    Я5-

    2,0 -

    0,5 <

    0 (Н202), моль / л

    Про

    -1-1-1-г

    АО2 АО4 про, про про, а

    -I-

    0,1

    СЦ2

    5 моль V - 10, л-хв 3,41

    33 ЗД 3,1 ЗА 2? 2М-2,72,6 "

    2,4

    З (НЙ), моль / л

    -1-1-1-1-1-1

    0 0? 11 Ц02 0,03 0? 14 005 0? 1б Рис. 1. Залежність швидкості Рис. 2. Залежність швидкості пероксидазного окислення фенолу від пероксидазного окислення фенолу від концентрації субстрату окислювача. концентрації субстрату окислювача. З (НДР) = 110-7 М (А1) С (ЖР) = 110-6 М (А2)

    В системі (А2) не вдалося достовірно зафіксувати залишкові концентрації фенолу після закінчення обраного часу експозиції через високу активність ферменту для концентрацій пероксиду водню вище 8-10-2 М. Тому, для подальшої роботи зі створення калібрувальної залежності активності ферменту по фенолу від його концентрації в системі, робочої концентрацією пероксиду водню вибрано 5 • Ю-2 М, а робочий діапазон концентрації ферменту 110-7-110-6 М. Правильність вибору робочих концентрацій реагентів, для визначення початкових швидкостей перо ксідазного окислення фенолу, підтверджується даними експерименту, наведеними на (рис. 3), де спостерігається лінійне зростання швидкості реакції, зі збільшенням концентрації субстрату-відновника, що повністю відповідає початковій ділянці кінетичної залежності за схемою Міхаеліса-Ментен, першого порядку реакції.

    2 4

    Мал. 3. Залежність швидкості реакції пероксидазного окислення фенолу від концентрації субстрату. (С (С6Н5ОН) = 5-10-5 -5-10-4) М; З (Н2О2), = 5-10-2 М; З (ЖР) = 110-7М; т = 10 хв, рН = 7).

    Мал. 4. Залежність початкових

    швидкостей пероксидазного окислення

    фенолу від концентрації ферменту (HRP) (системи Аі)

    Отже, для визначення активності досліджуваного ферменту за початковими швидкостями пероксидазного окислення фенолу оптимально використовувати системи наступного складу: С (СбН5ОН) = 5-10-5 -5-10-4) М; З (Н202) = 5-10-2 М; 0таР) = 1-10-7М; рН = 7, т = 10 хв. Варіювання в окислювальних системах (А) концентрації ферменту в робочому діапазоні дозволило визначити його питому активність по початковим швидкостям окислення фенолу. В результаті була отримана класична лінійна залежність, представлена ​​на (рис.4.), Яку можна використовувати як калібровану для визначення активності препаратів з

    пероксидазною активністю, в тому числі ферментів, виділених з рослинної сировини без додаткового очищення. Середні розрахункові значення пероксидазною активності ферменту-стандарту по фенолу наведені в табл. 1.

    Таблиця 1

    Середня активність пероксидази хрону очищеної (К / 0.6) по фенолу

    (Система А)

    Молярна активність АС, моль субстрату / моль ферменту • 1 хв. Питома активність Ам, мкмоль субстрату / мг ферменту • l хв, (О.О) 1 (МО), моль (п) / моль (ф) -мін

    8-106 0,18 1,3-10-7

    * Міжнародна одиниця активності (МЕ або і) - кількість ферменту (моль), що каталізують перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв.

    Таким чином, в системі (А), ефективна активність по фенолу 1 мг ферменту становить 0,18 О.О, що дозволяє нам подати такі види калібрувальних залежностей, представлених на рис.5, 6.

    Про 0,05 0,1 0,15 0,2 0 0-05 0,1 0,15 0,2

    Мал. 5. Залежність початкової швидкості Рис. 6. Залежність оптичної

    реакції пероксидазного окислення щільності індикаторних систем від

    фенолу від ефективної активності ефективної активності ферменту

    ферменту (HRP). (HRP).

    Використовуючи представлені залежності при вивченні швидкості пероксидазного окислення фенолу в присутності ферментного препарату будь-якого походження та

    будь-якого ступеня чистоти, досить буде або визначити в них початкові швидкості реакції, або тільки зафіксувати оптичні щільності систем при визначенні залишкових концентрацій фенолу, а потім шляхом екстраполяції або розрахунковим методом визначити ефективну активність досліджуваного ферментного препарату за наявними залежностям. Інакше активності ферментних препаратів, визначених різними методами, не матимуть сенсу при зіставленні результатів.

    Даний спосіб був застосований для визначень пероксидазною активності по фенолу і ступеня чистоти ферментного препарату, екстрагованого з коренеплоду редьки чорної (система (В)), де попередньо фотоколориметричним методом за законом Бугера-Ламберта-Бера, при А, (400 нм) приймаючи, що Е400 = 9,6-104 л / (моль-см) встановлювали концентрацію активних центрів пероксидази (Са.ц.) і розраховували її теоретичну масу, вважаючи, що М (пероксидази редьки) = 40000 [24]. Також розраховували теоретичну Пероксидазну активність ферменту по фенолу, виходячи з його умовного змісту в системі, використовуючи дані табл.1. У тому ж екстракті визначали масу білка біуретовим методом. Отримані дані порівнювали з результатами визначення ефективної пероксидазною активності ферменту по фенолу, запропонованим нами способом калібрувальної прямої. Результати представлені в таблиці 2.

    Таблиця 2

    Зміст і активність пероксидази в фосфатно-буферному екстракті з коренеплоду редьки чорної, встановлені різними методами

    (Усістем = 0,05 л)

    Експериментально визначені величини Розрахункові параметри

    Концентрація активних центрів ферменту Са.ц. = 3-10-6 моль / л. Теоретична маса ферменту тп.т = 6 мг Теоретична активність Ат = 1,1 М.Є.

    Маса білка в пробі ТБ = 1,7 мг

    Параметри певні по калібрувальним прямим рис. 5,6

    Кінцева оптична щільність окисної системи з фенолом А = 0,61 Ефективна маса ферменту тп.еф = 0,05 мг Ефективна активність Аеф. = 0,009 М.Є.

    Початкова швидкість пероксидазного окислення фенолу у = 1,32-10-5 моль л • хв

    З наведених даних випливає, що в неочищеному екстракті пероксидази редьки чорної, при ^ 400 поглинає не тільки гем пероксидази. Розрахункові значення визначали за законом Бугера-Ламберта-Бера, із значень оптичної щільності. Можливо, що висока оптична щільність системи обумовлена ​​її Мікрогетерогенна і фіктивним характером светопоглощения, про що свідчить надзвичайно висока розрахункове значення кількості ферменту і його теоретична активність по фенолу в МО, а також, маса ферменту в більш ніж в три рази перевищує масу білка, певного в Того ж екстракті біуретовим методом. Дані отримані при визначенні початкової швидкості окислення фенолу досліджуваним екстрактом і дані інтерпретовані за допомогою калібрувальних залежностей (рис. 5, 6), по оптичній щільності аналітичних систем із залишковими концентраціями фенолу, показують, що реальної пероксидазною активністю володіє лише 3% від усіх присутніх в системі речовин білкової природи. Даний висновок цілком логічний, для неочищеного екстракту. Очевидно, що результати, отримані запропонованим нами методом визначення пероксидазною активності виділеного неочищеного препарату з пероксидазною активністю, більш об'єктивні і уніфіковані.

    Для більш суворого докази ефективності і універсальності запропонованого методу визначення активності було б доцільно побудувати калібрувальні залежності аналітичного сигналу, що характеризує активність ферментного препарату з певним ступенем чистоти, щодо інших стандартних субстратів визначення активності ферментів, наприклад, для пероксидази - 1,2,3-пірогалола, пірокатехіна і інші.

    ВИСНОВОК

    1. За результатами кінетичних досліджень були визначені оптимальні умови і склад окислювальних систем для визначення початкових швидкостей пероксидазного окислення фенолу: С (СбН5ОН) = 5 10-5 -5-10-4) М; З (Н2О2) = 5 • Ю-2 М; З (НКР) = 110-7М; рН = 7, т = 10 хв.

    2. Показано, що використання аналітичної реакції фенолу з 4-аміноантипірину дозволяє використовувати його як субстрат відновник для відтвореного оцінювання пероксидазною активності очищених ферментів і ферментних препаратів.

    3. Запропоновано спосіб непрямого визначення пероксидазною активності ферментних препаратів по фенолу, заснований на використанні калібрувальних залежностей, отриманих при використанні ферментних препаратів з певним ступенем очищення як стандарт.

    Список літератури

    1. Діксон М. Ферменти: Пер. з англ. / М. Діксон, Е. Уебб. - М .: Світ, 1982. - Т. 1 - 392 с.

    2. Лікарські препарати з рослинної сировини. Пероксидаза / Г. Ф. Давидова, О. А. Єрмаков, А. І. Панасенко // Хімія рослинної сировини. - 1998. - № 1. - С. 15-18.

    3. Рогожин В. В. Роль индолил-3-оцтової кислоти в реакціях окислення швидко і повільно окисляються субстратів пероксидази / В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина // Вісник Московського університету. - Серія 2. Хімія. - 2004. - Т. 45, № 6. - С. 423-428.

    4. Рогожина Т. В. Стаціонарна кінетика індивідуального і спільного окислення фенотиазинов в присутності пероксидази хрону / Т. В. Рогожина, В. В. Рогожин // Електронний журнал «витрачаються на дослідження В РОСІЇ». - 2002. - Т. 70. - С. 768-780.

    5. Іммобілізація пероксидази в полі-п-вінілкапролактам / І. І. Романовська, О. В. Осейчук, О. В. Севостьянов, [и др.] // Вюнік ОНУ. - 2005. - Т. 10, Вип. 8. - С. 49-54.

    6. Пестовський Ю. С. Іммобілізація пероксидази хрону в гідрогелі і мікрочастинках альгінату кальцію / Ю. С. Пестовський // Науковий журнал КубГАУ. - 2013. - № 92, Т. 8. - С. 16.

    7. Лягін І. В. Каталітичні характеристики фермент-поліелектролітних комплексів на основі гексагістідінсодержащей органофосфатгідролази / І. В. Лягін, Е. Н. Єфременко, А. В. Кабанов // Вісник Московського університету. - Серія 2. Хімія. - 2014. - Т. 55, № 3. - С. 167-173.

    8. Шеховцова Т. Н. Визначення ртуті (II) з використанням пероксидази, ковалентно иммобилизованной на модифікованих Силікагель / Д. Л. Григор'єва, І. А. Веселова, Т. Н. Шеховцова // Вісник Московського університету. - Серія 2. Хімія. - 2003. - Т. 44, № 3. -С.178-182.

    9. Єрмоленко Д. А. Вивчення стабільності та згортання білків на прикладі убіквітину і пероксидази: автореф. дис. канд. біол. наук: 03.00.04 / Д. А. Еромоленко. - М., 2003. - 22 с.

    10. Кудряшов А. П. Дослідження стабільності препаратів иммобилизованной пероксидази / А. П. Кудряшов // Молекулярні, мембранні і клітинні основи функціонування біосистем: Міжнар. науч. конф .; Десятий з'їзд Білоруського громадського об'єднання фотобіологія і біофізиків, 19-21 червня 2012 м.Мінськ, Білорусь: зб. ст .: в 2 ч. Ч. - Мінськ: Изд. Центр БГУ. - 2012. - С. 42-45.

    11. Catalytic activity and stability of glucose oxidase / horseradish peroxidase co-confined in macroporous silica foam / X. Cao, Y. Li, Z. Zhang, J. Yu, [et al] // The Royal Society of Chemistry. Analyst. - 2012. -Vol. 137. - P. 5785-5791.

    12. Коновалова О. В. Розробка кількісного аналізу серологічних маркерів раку передміхурової залози на гідрогелевих мікрочіпах: автореф. дис. канд. фіз-мат. наук: 03.00.02 / Є. В. Коновалова. - М., 2006. - 23 с.

    13. Кирейка А. В. Пероксидаза в поліелектролітних комплексі і мицеллах поверхнево-активних речовин для визначення її субстратів і ефекторів в водно-органічних середовищах: автореф. дис. канд. хім. наук: 02.00.02 / А. В. Кирейка. - М., 2009. - 24 с.

    14. Яблоцкій К. В. Нові аспекти застосування нативної і иммобилизованной пероксидази для визначення її інгібіторів і субстратів: автореф. дис. канд. хім. наук: 02.00.02 / К. В. Яблоцкій. - М., 2010. - 25 с.

    15. Виноградова О. М. Кінетичні властивості і компонентний склад пероксидази листків POPULUS DELTOIDES MARSH. і FRAXINUS LANCEOLATA BORKH. В умовах техногенного забруднення / Е. Н. Виноградова // Промислова ботаніка. - 2007. - Вип. 7. - С. 63-68.

    16. Методи біохімічного дослідження рослин / А. І. Єрмаков [и др.]. - Л .: Агропромиздат, 1987. - 456 с.

    17. Метелиця Д. І. Ініціювання та інгібування вільнорадикальних процесів в біохімічних пероксидазних системах (огляд) / Д. І. Метелиця, Е. І. Карасьова // Прикладна біохімія та мікробіологія. - 2007. - Т. 43, №5. - С. 537-564.

    18. Тихонов Б. Б. Биокатализатор для очищення стічних вод від фенолу на основі іммобілізованої пероксидази хрону / Б. Б. Тихонов, А. І. Сидоров, Е. М. Сульман // Каталозі в промисловості. -2007. - № 3. - С. 48-50.

    19. Use of Enzymes to Remove Organic Micropollutants from Potable Water / B. Dussert, J. P. Duguet, J. Manem [et al] // Studies in Environmental Science. - 1986. - Vol. 29. - P. 655-662.

    20. Великий практикум з мікробіології / Г. Л. Селібер. [та ін.]. - Москва: Мир, 1962. - 492 с.

    21. Ронін В. С. Керівництво до практичних занять з методів клінічних лабораторних досліджень. / Ронін В. С., Старобинец Г. М. - М .: Світ, 1989. - 285 с.

    22. Аналітична хімія: навчальний посібник для студентів фармацевтичних вузів та факультетів III-IV рівнів акредитації / В. В. Болотов [и др.]. - Харків: НФаУ «Золоті сторінки», 2001. -305 с.

    23. Лур'є Ю. Ю., Хімічний аналіз виробничих стічних вод / Ю. Ю. Лур'є,

    A. І. Рибникова - М .: Хімія, 1974. - 336 с.

    24. Рогожин В. В. Пероксидаза як компонент антиоксидантної системи живих організмів /

    B. В. Рогожин. - М .: ГІАРД, 2004. - 240 с.

    25. Тарасевич Б. Н. ІК спектри основних класів органічних сполук (Довідкові матеріали) / Б. Н. Тарасевич. - М .: МГУ ім. М. В. Ломоносова, 2012. - 55 с.

    ANALYSIS OF THE PROBLEM OF DETERMINING THE ACTIVITY OF

    ENZYME PREPARATIONS

    Vyatkina O. V.1, Bazhin V. U.1, Alexandrova D. D

    1V. I. Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol, Russia

    2Chemical-Biological Cluster of federal national independent educational establishment of the high education "St. Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics", St. Petersburg, Russia E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    This article presents an analysis of the problem of representatives of research data on the determination of enzyme activity in relation to various substrates. We have shown many units of activity of enzyme preparations with various purifications used in modern studies. Also the impossibility of comparing units with each other. The limitations of the methods for determining the enzymatic activity with the highest substrate specificity of the enzyme are shown by the example of plant peroxidases. Phenol is a common ecotoxicant and is used as the main agent that reduces peroxidase. The problem of comparing the effectiveness of enzyme preparations with various degrees of purification is shown. Due to the impossibility of comparing unit activity. To solve this problem, a scheme was developed for determining the peroxidase activity of drugs by phenol as a reducing substrate and the optimal process parameters were indicated. Using the analytical interaction between phenol and 4-aminoantipyrine allows it to be used as a reducing agent for the reproducible assessment of the peroxidase activity of purified enzymes and enzyme preparations. A method for indirect determination of peroxidase activity of enzyme preparations by phenol based on the use of calibration dependencies is proposed. The following relationships were constructed in this study: 1. the dependence of the rate of phenol oxidation by peroxidase on the concentration of hydrogen peroxide; 2. the dependence of the rate of peroxidase oxidation of phenol on the initial concentration of the substrate; 3. The dependence of the initial rates of peroxidase oxidation of phenol on the concentration of the enzyme (HRP); 4. The dependence of the initial reaction rate of peroxidase oxidation of phenol on the effective activity of the enzyme (HRP); 5. The dependence of the optical density of indicator systems on the effective activity of the enzyme (HRP). The method for determining activity proposed in the study was tested to determine the activity of a crude enzyme extracted from black radish root. The difference

    BamKUHa O. B, BamuH B. AneKcaHdpoBa ff. ff.

    in the values ​​of the activity of the crude enzyme calculated according to the constructed dependencies and the theoretical value of the total protein mass is shown. Features of using the described method are revealed, possible limits of applicability for extremely inactive enzymes are indicated, and theoretical solutions to the identified shortcomings are proposed.

    Keywords: peroxidase, enzyme activity, phenol, schedule of calibration.

    References

    1. Dixon M., Webb E., Enzymes: Trans. from English, 392 p. (Mir, Moscow, 1982). (In Russ.)

    2. Davydova G. F., Ermakov O. A., Panasenko A. I., Medicines from plant materials. Peroxidase. Chemistry of plant raw materials, 1, 15, (1998).

    3. Rogozhin V. V., Rogozhina T. V., The role of indolyl-3-acetic acid in the oxidation reactions of rapidly and slowly oxidized peroxidase substrates, University Physics Bulletin, 45 (6), 423, (2004).

    4. Rogozhina T. V., Rogozhin V. V., Stationary kinetics of individual and combined oxidation of phenothiazines in the presence of horseradish peroxidase, e-print "RESEARCHED IN RUSSIA", 70, 768, (2002).

    5. Romanovskaya I. I., Oseychuk O. V., Sevostyanov O. V., Immobilization of peroxidase in poly - n-vinylcaprolactam, Visnik ONU, 10, 49, (2005).

    6. Pestovsky Y. S., Immobilization of horseradish peroxidase in the hydrogel and microparticles of calcium alginate, Scientific journal KubSAU, 8, 8, (2013).

    7. Lyagin I. V., Efremenko E. N., Kabanov A. V., Catalytic characteristics of enzyme-polyelectrolyte complexes based on hexahistidine-containing organophosphate, Moscow University Physics Bulletin, 55, 167, (2014 року).

    8. Shekhovtsova T. N., Grigoryeva D. L., Veselova I. A., Determination of mercury (II) using peroxidase covalently immobilized on modified silica, Moscow University Physics Bulletin, 44, 178, (2003).

    9. Ermolenko D. A., The study of stability and folding of proteins on the example of ubiquitin and peroxidase: abstract. diss. Cand. biol. Sciences: 03.00.04, 22 p., (2003).

    10. Kudryashov A. P., Investigation of the stability of immobilized peroxidase preparations, Intern. scientific conf .; Tenth Congress of the Belarusian Public Association of Photobiologists and Biophysicists, (BGU, Minsk, 2012), 42.

    11. Cao X., Li Y., Zhang Z., Yu J., Catalytic activity and stability of glucose oxidase / horseradish peroxidase co-confined in macroporous silica foam, The Royal Society of Chemistry. Analyst. 137, 5785, (2012).

    12. Konovalova E. V., Development of a quantitative analysis of serological markers of prostate cancer on hydrogel microarrays: author. diss. Cand. physical mat. Sciences: 03.00.02, 23 p., (2006).

    13. Kireiko A. V., Peroxidase in the polyelectrolyte complex and micelles of surface-active substances to determine its substrates and effectors in aqueous-organic media: abstract. diss. Cand. Chem. Sciences: 02.00.02, 24 (2009).

    14. Yablotsky K. V., New aspects of the use of native and immobilized peroxidase to determine its inhibitors and substrates: abstract. diss. Cand. Chem. Sciences: 02.00.02, 25 p., (2010).

    15. Vinogradova E. N., Kinetic properties and component composition of leaf peroxidase POPULUS DELTOIDES MARSH. and FRAXINUS LANCEOLATA BORKH. In conditions of technogenic pollution, Industrial botany, 7, 63, (2007).

    16. Ermakov A. I., Methods of biochemical research of plants, Agropromizdat, 1, 456, (1987).

    17. Metelitsa D. I., Karaseva E. I. Initiation and inhibition of free radical processes in biochemical peroxidase systems (review), Applied Biochemistry and Microbiology, 43, 537, (2007).

    18. Tikhonov B. B., Sidorov A. I., Sulman E. M., Biocatalyst for wastewater treatment from phenol based on immobilized horseradish peroxidase, Catalysis in industry, 3, 48, (2007).

    19. Dussert B., Duguet J. P., Manem J., Use of Enzymes to Remove Organic Micropollutants from Potable, Studies in Environmental Science, 29, 655, (1986).

    20. Seliber G. L., A large workshop on microbiology, p. 492, (Mir, Moscow, 1962). (In Russ.)

    21. Ronin V. S., Starobinets G. M., Guide to practical exercises on clinical laboratory research methods, p. 285, (Mir, Moscow, 1989). (In Russ.)

    22. Bolotov V. V., Analytical chemistry: a textbook for students of pharmaceutical universities and faculties of III - IV levels of accreditation, 305 p., (Golden Pages, Kharkov, 2001). (In Russ.)

    23. Lurie Y. Y., Rybnikova A. I., Chemical analysis of industrial wastewater ,. 336 p, (Chemistry, Moscow, 1974). (In Russ.)

    24. Rogozhin V. V., Peroxidase as a component of the antioxidant system of living organisms, p. 240, (GIARD, Moscow, 2004). (In Russ.)

    25. Tarasevich B. N., IR spectra of the main classes of organic compounds (Reference materials), 55 p., (State University. M. V. Lomonosova, Moscow, 2012). (In Russ.)


    Ключові слова: пероксидази / ферментативну активність / фенол / калібрований графік / PEROXIDASE / ENZYME ACTIVITY / PHENOL / SCHEDULE OF CALIBRATION

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити