Нами було проаналізовано використання аналітичних контрольних показників «реплікати Т-клітин» і «сума Т-клітин» на прикладі 174 хворих на ВІЛ-інфекцію незалежно від віку і стадії захворювання. З огляду на це, пацієнти були розділені нами на 2 групи. Хворі, у яких сума CD45 + CD3 + CD4 + і CD45 + CD3 + CD8 + лімфоцитів збігається з процентним і абсолютним вмістом CD45 + CD3 + лімфоцитів, або різниця розбіжності абсолютних значень не перевищує різницю «реплікатов Т-клітин». Особи цієї групи склали 36,78%. Пацієнти, у яких сума CD45 + CD3 + CD4 + лімфоцитів і CD45 + CD3 + CD8 + менше процентного і абсолютного вмісту CD45 + CD3 +, або різниця розбіжності абсолютних значень перевищує різницю «реплікатов Т-клітин» (41,38% хворих). Подібне розбіжність контрольних сум може бути пов'язано з високим вмістом в зразку ?? - Т-клітин, що мають двічі негативний фенотип CD45 + CD3 + CD4-CD8-.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Шестакова Е. В., Зурочка А. В., Квятковська С. В., Бецков С. Т., Дукардт В. В.


ANALYSIS OF CONTROL MEASUREMENTS OF «T-CELL REPLICATES» AND «T-CELL SUMMARY» IN INVESTIGATION OF THE IMMUNE STATUS OF HIV-INFECTED PATIENTS AND DETECTION DOUBLE NEGATIVE SUBPOPULATION OF T-LYMPHOCYTES (CD45 + CD3 + CD4-CD8-)

We analyzed efficiency of application for analytic control parameters, i.e., «T-cell replicates»And« T-cell summary »in a sample of 174 HIV-infected patients, independently of age or disease stage. The patients were divided in two groups. Group 1 consisted of patients with total CD45 + CD3 + CD4 + and CD45 + CD3 + CD8 + lymphocyte concentrations being similar to relative and absolute concentrations of CD45 + CD3 + lymphocytes, or the difference between absolute measurements not exceeding «T-cell replicates»Differences. Group 1 included 36.78% of the whole cohort. Group 2 consisted ofpatients with total CD45 + CD3 + CD4+ & CD45 + CD3 + CD8 + lymphocytes concentrations being lower than relative and absolute concentrations of CD45 + CD3 + lymphocytes, and the differences in absolute values ​​being higher than «T-cell replicates»Differences (41.38% of total sample). Such difference between control sums maybe connected with high concentrations of double-negative y8-T-cells (CD45 + CD3 + CD4-CD8-) in the specimens under study. (Med. Immunol, 2008, vol. 10, N4-5, pp 463-466)


Область наук:

  • фундаментальна медицина

  • Рік видавництва: 2008


    Журнал: медична імунологія


    Наукова стаття на тему 'Аналіз контрольних показників «Реплікати Т-клітин» і «Сума Т-клітин» при дослідженні імунного статусу у віл-інфікованих хворих і виявлення дубль-негативних субпопуляцій Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 + CD4-CD8-)'

    Текст наукової роботи на тему «Аналіз контрольних показників« Реплікати Т-клітин »і« Сума Т-клітин »при дослідженні імунного статусу у віл-інфікованих хворих і виявлення дубль-негативних субпопуляцій Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 + CD4-CD8-)»

    ?Медична Імунологія 2008, Т. 10, № 4-5, стор. 463-466 © 2008, СПб РВ РААКІ

    короткі повідомлення

    АНАЛІЗ КОНТРОЛЬНИХ ПОКАЗНИКІВ «РЕПЛІКАТИ Т-клітин» І «СУМА Т-клітин»

    при дослідженні імунного статусу у віл-інфікованих хворих і виявлення дубль-негатібних

    субпопуляцій Т-лімфоцитів

    (CD45 + CD3 + CD4CD8)

    Шестакова Е.В.1, Зурочка А.В.2, Квятковська С.В.1, Бецков С.Г.1, Дукардт В.В.1, Хайдуков С.В.3

    1 Клініка ГОУ ВПО Челябінської державної медичної академії, м Челябінськ

    2 ГОУ ВПО Челябінська державна медична академія, м Челябінськ

    3 Інститут біоорганічної хімії ім. акад. М.М. Шемякіна і Ю. А. Овчинникова РАН, Москва

    Резюме. Нами було проаналізовано використання аналітичних контрольних показників «реплікати Т-клітин» і «сума Т-клітин» на прикладі 174 хворих на ВІЛ-інфекцію незалежно від віку і стадії захворювання. З огляду на це, пацієнти були розділені нами на 2 групи. Хворі, у яких сума CD45 + CD3 + CD4 + і CD45 + CD3 + CD8 + лімфоцитів збігається з процентним і абсолютним вмістом CD45 + CD3 + лімфоцитів, або різниця розбіжності абсолютних значень не перевищує різницю «реплікатов Т-клітин». Особи цієї групи склали 36,78%. Пацієнти, у яких сума CD45 + CD3 + CD4 + лімфоцитів і CD45 + CD3 + CD8 + менше процентного і абсолютного вмісту CD45 + CD3 +, або різниця розбіжності абсолютних значень перевищує різницю «реплікатов Т-клітин» (41,38% хворих). Подібне розбіжність контрольних сум може бути пов'язано з високим вмістом в зразку yS-Т-клітин, що мають двічі негативний фенотип CD45 + CD3 + CD4CD8-.

    Ключові слова: проточна цитометрії, T-клітини, ВІЛ.

    Shestakova E.V., Zurochka A.V., Kviatkovskaya S.V., Betskov S.G., Dukardt V.V., Haidukov S.V.

    ANALYSIS OF CONTROL MEASUREMENTS OF «Т-CELL REPLICATES» AND «Т-CELL SUMMARY»

    in investigation of the immune status of hiv-infected patients and DETECTION

    DOUBLE NEGATIVE SUBPOPULATION OF T-LYMPHOCYTES (CD45 + CD3 + CD4CD8)

    Abstract. We analyzed efficiency of application for analytic control parameters, i.e., «T-cell replicates» and «T-cell summary» in a sample of 174 HIV-infected patients, independently of age or disease stage. The patients were divided in two groups. Group 1 consisted of patients with total CD45 + CD3 + CD4 + and CD45 + CD3 + CD8 + lymphocyte concentrations being similar to relative and absolute concentrations

    Адреса для листування:

    Хайдуков Сергій Валерійович

    Інститут біоорганічної хімії

    ім. акад. М.М. Шемякіна і Ю. А. Овчинникова РАН,

    117997, Москва, вул. Миклухо-Маклая, 16/10.

    Тел .: (495) 336-02-55.

    E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    463

    Шестакова Є.В. та ін.

    медична Імунологія

    of CD45 + CD3 + lymphocytes, or the difference between absolute measurements not exceeding «T-cell replicates» differences. Group 1 included 36.78% of the whole cohort. Group 2 consisted of patients with total CD45 + CD3 + CD4 + & CD45 + CD3 + CD8 + lymphocytes concentrations being lower than relative and absolute concentrations of CD45 + CD3 + lymphocytes, and the differences in absolute values ​​being higher than «T-cell replicates» differences (41.38% of total sample). Such difference between control sums may be connected with high concentrations of double-negative yS-T-cells (CD45 + CD3 + CD4CD8) in the specimens under study. (Med. Immunol., 2008, vol. 10, N4-5, pp 463-466)

    Вступ

    В діагностиці та прогнозуванні захворювань, обумовлених імунодефіцитом, зокрема при ВІЛ-інфекції, надзвичайно важливе значення має визначення відносних і абсолютних концентрацій Т-лімфоцитів (CD3 +), Т-хелперів (CD3 + CD4 +) і цитотоксичних Т-лімфоцитів (CD3 + CD8 +) . В даному випадку відбувається критичне порушення функціонування захисних сил організму переважно за рахунок селективної загибелі Т-хелперів (CD3 + CD4 +). Прогресивне погіршення клінічної та імунологічної картини в значній мірі корелює зі зниженням концентрації CD3 + CD4 + лімфоцитів в периферичної крові. Виявлення точних абсолютних значень концентрації даної субпопуляції лімфоцитів є найбільш важливим параметром для уточнення стадії захворювання і прийняття рішення про призначення пацієнтові антиретровірусної і патогенетичної терапії.

    Наказами МОЗ РФ від 26.05.2003 № 220 «Правила проведення внутрішньолабораторного контролю якості кількісних методів клінічних лабораторних досліджень з використанням контрольних матеріалів» і від 02.02.2000

    100 101 102 103

    CD45-FITC

    Малюнок 1. двопараметричного гістограма розподілу клітин за флуоресценції і світлорозсіювання під кутом 90 ° для виділення області лімфоцитів

    № 45 «Про систему заходів щодо підвищення якості клінічних лабораторних досліджень в установах охорони здоров'я Російської Федерації» зазначається важлива роль контролю якості проведених досліджень. У зв'язку з викладеним вище, одним з основних умов коректної оцінки імунного статусу пацієнтів є постійне проведення внутрішньолабораторного контролю якості. Для цих цілей необхідно за допомогою атестованих контрольних матеріалів з відомими значеннями контролювати стану проточного цитометра і оцінювати якість проведення пре- і аналітичного етапів дослідження (пробопідготовка, реакційна здатність антитіл і т.д.) [1, 2].

    Крім викладеного вище і відповідно до загальноприйнятих рекомендацій, в процесі безпосереднього виконання кожного дослідження необхідно проведення аналітичного контролю якості з урахуванням наступних контрольних показників: «реплікати Т-клітин» і «сума Т-клітин» [1, 2].

    Метою даної роботи була перевірка ефективності використання даних показників аналітичного контролю при щоденному виконанні внутрішньолабораторного контролю якості на базі лабораторії міцної цитометрия центру СНІД Клініки ЧГМА.

    матеріали та методи

    Дослідження імунного статусу у пацієнтів, інфікованих вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), в рамках Національного проекту «Здоров'я», проводилося методом проточної цитометрії з використанням прямої імунофлуоресценції цільної периферичної крові і «безотмивочной» технології.

    Клітини периферичної крові фарбували трибарвними комбінаціями моноклональних антитіл до CD45 / CD4 / CD3 і CD45 / CD8 / CD3, кон'югованих з флуоресцентними барвниками FITC / PE / PC5. Пофарбовані зразки аналізували на проточному цитометрі EPICS XL ( «Beckman Coulter», США) за допомогою мультіпараметріческого аналізу. Даний тест заснований на здатності моноклональних антитіл специфічно взаємодіяти з дискретними антигенними детермінантами, експресувати на поверхні лейкоцитів. Дана процедура

    464

    2008, Т. 10, № 4-5

    Аналіз контрольних показників...

    дозволяла вести одночасну ідентифікацію та підрахунок загальної кількості Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 +), загальної кількості Т-хелперів (CD45 + CD3 + CD4 +) і загальної кількості цитотоксичних Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 + CD8 +). Еритроцити видаляли з досліджуваних зразків за рахунок прямого лізису з використанням лізуючого і фіксують реагентів ImmunoPrep Reagent System і автоматичної робочої станції Q-PREP ( «Beckman Coulter», США). Популяцію лімфоцитів виділяли за допомогою гетерогенного гейтуванням [область подій, що мають яскраву флуоресценцію CD45-FITC і низький рівень сигналу світлорозсіювання під кутом 90о (SS)] (рис. 1). Підрахунок абсолютного кількості клітин проводився з використанням Одноплатформенние технології та референс-них частинок Flow-Count Fluorespheres ( «Beckman Coulter», США).

    Оцінку якості роботи цитометра проводили щодня, включаючи перевірку сигналів светорассеяния і флуоресценції з використанням калібрувальних частинок Flow Check Fluorespheres ( «Beckman Coulter», США) і стандартних настроювальних протоколів. Якість аналітичного етапу оцінювали шляхом фарбування контрольного матеріалу Immuno-Trol Cells ( «Beckman Coulter», США) з заздалегідь відомим діапазоном допустимих значень відносного і абсолютного кількості позитивних клітин. Контрольні зразки аналізували в тих же умовах, що і досвідчені, з використанням тих же реагентів, концентрацій і стандартних робочих протоколів настройки цитометра. Після наведених вище процедур оцінювали відносні і абсолютні кількості Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 +), Т-хелперів (CD45 + CD3 + CD4 +) і Т-цитотоксичних (CD45 + CD3 + CD8 +) лімфоцитів.

    В ході виконання кожного аналізу перевіряли контрольні показники «реплікати Т-клітин» (рекомендована різниця в змісті субпопуляції CD45 + CD3 + клітин в кожній пробірці не повинна перевищувати 2%). Іншим контрольним показником була «сума Т-клітин». Вона являє собою суму як відносного, так і абсолютного вмісту Т-хелперів (CD45 + CD3 + CD4 +) і цітотоксіч-

    ТАБЛИЦЯ 1. атестовані значення КОНТРОЛЬНОГО МАТЕРІАЛУ IMMUNO-TROL CELLS

    (За даними «beckman coulter»)

    LY% ± 2s Cells / pL ± 2s

    CD3 + 71 9 799 260

    CD3 + / CD4 + 45 9 518 165

    CD3 + / CD8 + 23 6 259 118

    ських Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 + CD8 +) і повинна бути дорівнює значенню відносного і абсолютного вмісту Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 +), причому розкид не повинен перевищувати ± 5%.

    Результати та обговорення

    Аналіз роботи проточного цитофлуориметр EPICS XL показав високу стабільність роботи приладу, причому коефіцієнти варіацій (CV) на каналах флуоресценції FL1, FL2, FL3 і FL4 перебували в допустимих межах (< 1,5%). У свою чергу коефіцієнт варіацій на каналі малоуглового светорассеяния FS знаходився в діапазоні < 1,3%. Стандартним відхиленням для всіх параметрів було < 0,11.

    Проведення внутрішньолабораторного контролю якості з використанням атестованого контрольного матеріалу Immuno Trol і програмно-апаратних засобів (QC) дозволило визначити середні значення положення максимуму піку позитивних клітин, їх коефіцієнти варіацій і значення стандартного відхилення. Ці параметри були отримані як для відносних, так і для абсолютних показників Т-лімфоцитів (CD45 + CD3 +), Т-хелперів (CD45 + CD3 + CD4 +) і цитотоксичних (CD45 + CD3 + CD8 +) Т-лімфоцитів.

    Нижче наведені таблиці допустимих значень, отримані від виробників контрольних матеріалів (табл. 1) і значення, отримані в результаті проведення контролю якості в лабораторії (табл. 2).

    Отримані дані свідчать про задовільний проходженні лабораторією внутрішнього контролю якості і високої точності як на преаналітичному, так і аналітичному етапах роботи.

    На наступному етапі було перевірено використання аналітичних контрольних показників «реплікати Т-клітин» і «сума Т-клітин» на прикладі 174 хворих на ВІЛ-інфекцію незалежно від віку і стадії захворювання.

    При використанні аналітичного контрольного показника «реплікати Т-клітин» рекомендований тільки процентний розкид (± 2%) і не вказані рекомендовані розкид у визначенні абсолютного числа Т-лімфоцитів. Однак

    таблиця 2. значення контрольного матеріалу immuno-trol cells (за даними лабораторії проточної цитометрії центру спід)

    LY% ± 2s Cells / pL ± 2s

    CD3 + 71,1 2,34 752,5 71

    CD3 + / CD4 + 45,5 2,6 480 50,2

    CD3 + / CD8 + 21,9 1,42 255 29

    465

    Шестакова Є.В. та ін.

    медична Імунологія

    абсолютне число Т-лімфоцитів є більш важливим показником при визначенні рівня Т-хелперів при використанні Одноплатформенние технології. Таким чином, для визначення меж допустимих варіацій було застосовано четверте правило Вестгардта (R4S), що використовується для виявлення випадкових помилок в межах однієї аналітичної серії в разі, коли відстань між результатами вимірювання контрольного матеріалу в даній аналітичній серії становило понад 4S.

    У свою чергу, внутрішньолабораторний контроль якості проведених процедур виявив, що значення стандартного відхилення для абсолютного числа Т-лімфоцитів становило 35,5 клітин / мкл (табл. 1).

    Виходячи з наведеного вище, аналіз контрольного показника «реплікатов Т-клітин» у пацієнтів з різницею відносного змісту CD45 + CD3 + лімфоцитів в різних пробірках, що перевищує 2%, був розцінений як прояв випадкової помилки. Те ж стосувалося і абсолютним значенням CD45 + CD3 + лімфоцитів, що перевищує 140 клітин / мкл. Мабуть, це було пов'язано з погрішностями на етапах пробоподготовки (неточність дозування, погане перемішування крові і т.д.). Дані зразки відправляли на повторне дослідження. В результаті, дану особливість виявили у 21,8% (38 осіб) пацієнтів.

    Дані цитометричного аналізу інших пацієнтів були використані для оцінки аналітичного контрольного показника «сума Т-клітин». Сума як відносного, так і абсолютного вмісту CD45 + CD3 + CD4 + і CD45 + CD3 + CD8 + клітин в кінцевому підсумку повинна дорівнювати як відносного, так і абсолютного вмісту CD45 + CD3 + клітин і не перевищувати ± 5%.

    В результаті проведеної роботи обстежені пацієнти були розділені на 2 групи:

    1) Сума CD45 + CD3 + CD4 + і CD45 + CD3 + CD8 + лімфоцитів у яких збігається з відносним і абсолютним вмістом CD45 + CD3 + лейкоцитів, або розбіжність абсолютних значень не перевищує різницю «реплікатов Т-клітин». Пацієнти цієї групи склали 36,78% (64 людини)

    2) Сума CD45 + CD3 + CD4 + і CD45 + CD3 + CD8 + лімфоцитів у яких менше відносного і абсолютного вмісту CD45 + CD3 + лейкоцитів, і це розбіжність абсолютних значень перевищує різницю «реплікатов Т-клітин». Пацієнти цієї групи склали 41,38% (72 людини).

    Згідно з літературними даними, подібне розбіжність контрольних сум може бути пов'язано з високим вмістом в зразку yS-Т-клітин, які досить часто представлені дубль-негативним фенотипом CD45 + CD3 + CD4-CD8- [2,3,6]. Даний ефект особливо проявляється як у ВІЛ-інфікованих [5], так і у пацієнтів з цито-мегаловірусной інфекцією [4].

    висновок

    Таким чином, для підвищення аналітичної точності роботи і виявлення випадкових помилок необхідно використовувати оцінку не тільки відносних, а й абсолютних значень «реплікатов Т-клітин». Також необхідно враховувати дані допустимих відхилень, отримані в результаті щоденного аналізу контрольного матеріалу. Досить високий відсоток пацієнтів, включених у другу групу з розбіжністю контрольних сум абсолютних і відносних значень, свідчить про необхідність подальшого більш детального дослідження дубль-негативних субпопуляцій Т-лімфоцитів, зокрема yS-Т-клітин.

    Список літератури

    1. ВІЛ-інфекція // Інформаційний бюлетень № 28. - М., 2006. - 24 с.

    2. Canadian Guidelines for Flow Cytometric Im-munophenotyping. 2001. Edition.

    3. De Paoli P., Gennari D., Martelli P, Basa-glia G., Crovatto M., Battistin S., Santini G. A subset of gamma delta lymphocytes is increased during HIV-1 infection // Clin. Exp. Immunol. - 1991. - Vol. 83. - P. 187-191.

    4. Dechanet J., Merville P, Lim A., Retiere C., Pitard V, Lafarge X., Michelson S., Meric C., Hal-let M.M., Kourilsky P, Bonneville M., Moreau J.F. Implication of yST cells in the human immune response to cytomegalovirus // J. Clin. Invest. - 1999. - Vol. 103. - P 1437-1449.

    5. Lambert C., Genin C. CD3 bright lymphocyte population revel gamma delta T cells // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2004. - Vol. 61, N 1. - P 45-53.

    6. Margolick J.B., Scott E.R., Odaka N., Saah A.J. Flow Cytometric analysis of gamma delta T cells and natural killer cells in HIV-1 infection // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1991. - Vol. 58. - P 126-138.

    надійшла до редакції 30.06.2007 прийнята до друку 13.09.2007

    466


    Ключові слова: проточної цитометрії /Т-клітки /ВІЛ /T-CELL REPLICATES /FLOW CYTOMETRY /HIV

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити