Клітини китайського хом'ячка лінії V-79 опромінювали у-квантами в дозі 0,5 Гр і 3 Гр при потужностях доз, рівних 0,48 Гр / хв (гостре опромінення) і 0,0485 мГр / хв (пролонгована опромінення). Гостре і пролонговану опромінення в дозі 0,5 Гр збільшує частоту появи мікроядер (МЯ) і хромосомних аберацій (ХА). Подальше культивування опромінених клітин протягом 20 генерацій збільшує частоту МЯ, причому для пролонгованого опромінення підвищена частота МЯ зберігається протягом 40-60 генерацій, а після гострого опромінення число МЯ починає знижуватися після 20 генерацій. Гостре і пролонговану опромінення в дозі 0,5 Гр збільшують частоту ХА відразу після опромінення, яка поступово знижується до контрольного рівня до 20-ї генерації. Опромінення в дозі 3 Гр відразу після опромінення збільшує частоту ХА, яка знижується до контрольного рівня до 20-ї генерації, потім підвищується до 40-ї генерації і залишається на цьому рівні до 60-ї генерації.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Рябченко Н. І., Антощіна М. М., Насонова В. А., Фесенко Е. В.


Analysis of chromosome aberrations and micronucleus in the descendants of Chinese hamster cells, irradiated at various doses and intensities of y-radiation

The Chinese hamster cells V-79 were irradiated by y-rays in doses 0.5 Gy and 3 Gy at dose rate of 0.48 Gy / min (an acute irradiation) and in dose 0.5 Gy at dose rate of 0.0485 MGy / min (a prolonged irradiation ). The acute and prolonged irradiation in a dose 0.5 Gy enlarges frequency of appearance of micronucleus. Subsequent cultivation of the irradiated cells during 20 generations enlarges frequency of micronucleus, and for a prolonged irradiation the boosted frequency of micronucleus is saved during 40-60 generations. After an acute irradiation the number of micronucleus starts to be reduced after 20 generations. An acute and prolonged irradiating in a dose 0.5 Gy enlarge frequency of chromosome aberrations at once after an irradiating, which is gradually reduced up to a control level to 20 generating. The irradiating in a dose 3 Gy enlarges frequency of chromosome aberrations at once after an irradiating, which is reduced up to a control level to 20 generating, then increases to 40-th generating and remains at this level before 60-th generating.


Область наук:
  • Біотехнології в медицині
  • Рік видавництва: 2006
    Журнал: Радіація і ризик (Бюлетень Національного радіаційно-епідеміологічного регістру)
    Наукова стаття на тему 'Аналіз аберацій хромосом і мікроядер в нащадках клітин китайського хом'ячка, опромінених при різних дозах і інтенсивності у-випромінювання'

    Текст наукової роботи на тему «Аналіз аберацій хромосом і мікроядер в нащадках клітин китайського хом'ячка, опромінених при різних дозах і інтенсивності у-випромінювання»

    ?Аналіз аберацій хромосом і мікроядер в нащадках клітин китайського хом'ячка, опромінених при різних дозах і интенсивностях ^ випромінювання

    Рябченко Н.І., Антощіна М.М., Насонова В.А., Фесенко Е.В.

    ГУ - Медичний радіологічний науковий центр РАМН, Обнінськ

    Клітини китайського хом'ячка лінії У-79 опромінювали у-квантами в дозі 0,5 Гр і 3 Гр при потужностях доз, рівних 0,48 Гр / хв (гостре опромінення) і 0,0485 мГр / хв (пролонгована опромінення). Гостре і пролонговану опромінення в дозі 0,5 Гр збільшує частоту появи мікроядер (МЯ) і хромосомних аберацій (ХА). Подальше культивування опромінених клітин протягом 20 генерацій збільшує частоту МЯ, причому для пролонгованого опромінення підвищена частота МЯ зберігається протягом 40-60 генерацій, а після гострого опромінення число МЯ починає знижуватися після 20 генерацій. Гостре і пролонговану опромінення в дозі 0,5 Г р збільшують частоту ХА відразу після опромінення, яка поступово знижується до контрольного рівня до 20-ї генерації. Опромінення в дозі 3 Гр відразу після опромінення збільшує частоту ХА, яка знижується до контрольного рівня до 20-ї генерації, потім підвищується до 40-ї генерації і залишається на цьому рівні до 60-ї генерації.

    Вступ

    У роботах багатьох авторів, узагальнених в оглядах [1, 2, 3], було показано, що щільно-і редкоіонізірующіе випромінювання в високих дозах викликають нестабільність геному, яка проявляється у віддалених нащадків, що вижили після опромінення клітин. Передбачається, що основою нестабільності генома є пошкодження ДНК, які не проявляються відразу після опромінення, але зберігаються у нащадків опромінених клітин і призводять протягом багатьох поділів до відстроченої загибелі клітин, зміни їх радіочутливості, появи мутацій, мікроядер (МЯ) і хромосомних аберацій (ХА ) [2, 4-7]. Пошкодження генома у нащадків опромінених клітин випадкові, непередбачувані по частоті і часу прояви [3]. Їх вираженість залежить від якості випромінювання [6, 8, 9], виду аналізованих клітин [1, 6] і дози випромінювання [5-7].

    В останні роки з'явилися дані про те, що редкоіонізірующее випромінювання в малих дозах також призводить до клітинних проявів нестабільності генома в нащадках опромінених клітин [7, 10, 11], однак при цьому спостерігаються інші закономірності в порівнянні з ефектами опромінення в досить високих дозах [10 ]. В експериментальних дослідженнях, проведених на забрудненій внаслідок Чорнобильської аварії території при тривалому впливі іонізуючої радіації в малих дозах і низької потужності дози, було показано, що у віддалених поколіннях клітин спостерігається відстрочена загибель, гальмування зростання, збільшення частоти мікроядер і сестринських хроматидного обмінів [12].

    У даній роботі передбачається дослідити нестабільність геному в нащадках клітин китайського хом'ячка, опромінених при різних дозах і інтенсивності у-випромінювання. Як показник нестабільності генома буде проведено аналіз хромосомної нестабільності по тесту появи у нащадків опромінених клітин МЯ і ХА.

    Матеріали і методика

    Робота виконана на клітинах китайського хом'ячка лінії У-79, які культивували в середовищі Голка з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки. Для вивчення дії пролонгованого опромінення на частоту хромосомних аберацій і мікроядер клітини опромінювали при температурі 37 ° С протягом тижня при потужності дози 0,0485 мГр / хв у-квантами 137Се на установці «Панорама» (МРНЦ РАМН, Росія) в сумарній дозі 0, 5 Гр. Гостре опромінення клітин У-79 в дозах 0,5 Гр та 3 Гр проводили у-квантами 60Со на установці «Луч» ( «Ізотоп», Росія) при потужності дози 0,48 Гр / хв. Клітини після пролонгованої і гострого опромінення пересівали кожні 3-4 дні і аналізували відразу після опромінення і через 5, 10, 15 і 20 пасажів. В окремих експериментах було показано, що перед виходом в стаціонарну фазу під час кожного пасажу клітини проходять чотири митотических ділення (генерації). Для визначення частоти ХА клітини вирощували протягом 24 годин після пересіву на нову живильне середовище. Для накопичення клітин, які діляться в стадії метафази за дві години до фіксації в культуральне середовище вносили демеколцін. Клітини гіпотонізіровалі, фіксували сумішшю метанолу і крижаної оцтової кислоти, наносили на предметні скельця і ​​фарбували АЗУР-еозином. Для визначення частоти МЯ клітини пересівали і вирощували протягом 30 годин, потім обробляли 0,125 М розчином КСІ протягом 2 хв і фіксували. Препарати готували методом розкопування на охолоджені предметні скельця, висушували і фарбували АЗУР-еозином. Частоту МЯ враховували в 1000 клітин з чіткими межами цитоплазми [13, 14].

    Результати та обговорення

    Відразу після завершення пролонгованого опромінення число МЯ на 1000 клітин збільшується з 14 (контроль) до 70,7. При подальшому культивуванні число клітин з МЯ продовжує зростати аж до 40-ї генерації і зберігається приблизно на тому ж рівні до 60-ї генерації. До 80-ї генерації частота клітин з МЯ падає, але залишається як і раніше на більш високому рівні в порівнянні з контролем (рис. 1). При гострому опроміненні в тій же дозі відразу після впливу число МЯ на 1000 клітин збільшується з 14 (контроль) до 45,3, потім зростає до 20-ї генерації і при подальшому культивуванні починає зменшується. Однак навіть після завершення 80 генерацій спостерігається число клітин з МЯ у нащадків опромінених клітин в два рази перевищує частоту МЯ в контролі.

    Таким чином, при дії пролонгованого опромінення в дозі 0,5 Гр, а також гострого опромінення в тій же дозі у віддалених нащадків опромінених клітин спостерігається підвищена частота клітин з МЯ. Так як МЯ є летальними подіями для клітини, то можна вважати, що підвищена частота клітин з МЯ у нащадків опромінених клітин свідчить про виникнення цих ушкоджень сіє поуо, тобто спостерігається типовий прояв нестабільності генома. Як для пролонгованої, так і для гострого опромінення після 20 генерацій у нащадків опромінених клітин в однаковій мірі підвищена частота клітин з МЯ. Разом з

    тим, отримані дані свідчать про те, що після пролонгованого опромінення прояви нестабільності генома спостерігаються більш тривалий час і підвищений рівень МЯ зберігається аж до 60-ї генерації, в той час як при гострому опроміненні в тій же дозі після 20-ї генерації частота клітин з МЯ починає зменшуватися.

    число генерацій

    Мал. 1. Зміна числа мікроядер (МЯ) при різних термінах культивування клітинах клітин китайського хом'ячка У-79, опромінених в дозі 0,5 Гр при різних потужностях дози у-випромінювань.

    1 - у-випромінювання 60Со, потужність дози 0,48 Гр / хв; 2 - у-випромінювання 137Се, потужність дози 0,047 мГр / хв; 3 - контроль. Абсциса - число генерацій опромінених і неопромінених клітин. Ордината - число МЯ на 1000 клітин.

    Поряд з МЯ, у тих же клітин після пролонгованої і гострого опромінення в дозі 0,5 Г р у метафазі першого після пересіву мітозу аналізували аберації хромосом. Як випливає з даних, наведених на рис. 2, відразу після гострого і пролонгованого опромінення число ХА, що припадають на 100 метафаз, збільшувалася, проте динаміка зміни частоти ХА в процесі тривалого культивування нащадків опромінених клітин відрізнялася від динаміки частоти МЯ, що спостерігається у цих клітин. На відміну від МЯ пролонговану опромінення в порівнянні з гострим опроміненням індукує менше ХА. Подальше тривалий культивування опромінених клітин призводить до зниження виходу аберацій хромосом і через 20 генерацій рівень ХА наближається до контролю. Після пролонгованого опромінення до 40-ї генерації частота ХА дещо збільшується, проте при подальшому культивуванні рівень ХА знову знижується і через 60 генерації практично не відрізняється від контрольного рівня (рис. 2). Після гострого опромінення в дозі 0,5 Гр у нащадків опромінених клітин, які пройшли більше 20 генерацій, частота ХА не відрізняється від контролю.

    го

    го

    про

    про

    го

    CL

    CL

    Ф

    Ю

    ГО

    Про

    ц

    про

    число генерації

    Мал. 2. Зміна числа аберацій хромосом при різних термінах культивування клітинах клітин китайського хом'ячка V-79, опромінених в дозі 0,5 Гр при різних потужностях дози Y-випромінювань.

    1 - у-випромінювання 60Со, потужність дози 0,48 Гр / хв; 2 - Y-випромінювання 137Се, потужність дози 0,047 мГр / хв; 3 - контроль. Абсциса - число генерацій опромінених і неопромінених клітин. Ордината - загальне число аберацій хромосом на 100 метафаз.

    Подальше дослідження закономірностей індукції хромосомної нестабільності, що оцінюється по тесту ХА, було проведено після гострого опромінення клітин в дозі 3 Гр. Як випливає з даних, наведених на рис. 3, відразу після опромінення число ХА, що припадають на 100 метафаз, збільшується з 0,5-1,0 (контроль) до 29. Подальше культивування опромінених клітин призводить до того, що спостережуваний відразу після опромінення високий рівень ХА знижується і після 8-16 генерацій не відрізняється від контролю. Однак при подальшому культивуванні опромінених клітин рівень ХА, починаючи з 20-ї генерації, збільшується і через 40 генерацій у нащадків опромінених клітин число з'явилися «de novo» ХА становить 11 на 100 метафаз, що більш ніж в 10 разів перевищує рівень ХА в контролі. Підвищений рівень ХА зберігається у нащадків опромінених клітин і через 60 генерацій (рис. 3).

    Вивчення спектра аберацій хромосом показало, що відразу після опромінення в дозі 3 Гр із загального числа ХА 12% складають аберації хроматидного типу і 88% складають аберації хромосомного типу, з яких 22,5% ХА складають парні фрагменти і 65,5% складають обмінні аберації (дицентриків, тріцентрікі, Ацентріческіе кільця). При аналізі спектра аберацій хромосом, які з'явилися de novo після проходження нащадками опромінених клітин 40 генерацій, було показано, що із загального числа аберацій 22,7% представлено аберацією хроматидного типу, а решта аберації (77,3%) представлені обмінними абераціями хромосомного типу. Слід зазначити різницю в структурі обмінних абер-

    рацій хромосомного типу, що з'являються відразу після опромінення і після тривалого культивування опромінених клітин. Так, всі обмінні аберації хромосомного типу, що з'являються відразу після опромінення, містять супутні їм парні фрагменти, в той час як у обмінних аберацій хромосомного типу, що виникають «сіє поуо» після тривалого культивування опромінених клітин, відсутні супутні їм парні фрагменти. Одним з можливих механізмів утворення у нащадків опромінених клітин діцентріческіх і кільцевих хромосом може бути втрата теломерна ділянок хромосом і подальша аномальна асоціація цих хромосом з утворенням діцентріческіх і моноцентричні кільцевих структур без супроводжуючих їх парних фрагментів [9, 15].

    число генерацій

    Мал. 3. Залежність виходу аберацій хромосом від тривалості культивування клітин китайського хом'ячка У-79, опромінених в дозі 3 Гр у-квантами 60Со при потужності дози 0,48 Г р / хв.

    1 - опромінені в дозі 3 Гр клітини; 2 - неопромінені клітини. Абсциса - число генерацій опромінених і неопромінених клітин. Ордината - число аберацій на 100 метафаз.

    Проведені експерименти свідчать про прояв хромосомної нестабільності у нащадків опромінених клітин після впливу редкоіонізірующей радіації в низьких і високих дозах опромінення. Цікавим є факт вираженої індукції МЯ в нащадках клітин при пролонгованим опроміненні в низьких дозах. Дані робіт [16, 17] свідчать про те, що освіта МЯ є наслідком появи ацентріческій фрагментів, втрати хромосом, нерасхожденія хромосом, а також наявності апоптотической фрагментації хроматину. Аналіз появи МЯ і ХА при впливі на клітини різних факторів показав, що чисельні співвідношення появи цих ушкоджень визначаються механізмами дії на клітини досліджуваних факторів. Так, поява МЯ після першого поділу опромінених клітин в основному пов'язано з індукцією іонізуючим випромінюванням ацентріческій

    фрагментів [14, 18, 19]. Вплив на клітини агентів, які індукують в основному аберації хроматидного типу, практично не призводить до появи МЯ, в той час як агенти, наприклад вінбластин, що впливають на мітотичний веретено і викликають Анеуплоїдія, збільшують частоту клітин з МЯ і менш ефективні відносно індукції ХА [14 , 17, 18]. Отримані нами результати (рис. 1 і 2) показали, що при низькій дозі опромінення рівні хромосомної нестабільності, які оцінюються по тестах появи МЯ і ХА, розрізняються по динаміці їх змін в потомстві опромінених клітин. Так, при дії гострого та пролонгованого опромінення (доза 0,5 Гр) число клітин з МЯ в потомстві опромінених клітин, які вчинили 20 подвоєнь, збільшується (рис. 1). У той час як проведений нами аналіз появи ХА у цих же клітин показав, що підвищений рівень ХА, індукований в першому мітозі опроміненням в дозі 0,5 Гр, через 20 генерацій знижується і наближається до контрольного рівня. З огляду на дані наведених вище робіт [14, 16-20], можна зробити висновок про те, що спостережувана різниця в динаміці зміни числа МЯ і ХА є наслідком появи у нащадків опромінених клітин анеугенних ушкоджень (втрата і нерасхождение хромосом) і, можливо, ознак апоптотической деградації хроматину. Ці ушкодження практично не враховуються при аналізі ХА, але збільшують число МЯ у нащадків опромінених клітин. Необхідно також відзначити, що запропонований механізм збільшення числа МЯ в потомстві опромінених клітин, що спостерігається в цій роботі і проведених раніше дослідженні [11, 12], характерний для низьких (0,5 Гр) доз опромінення. Згідно з даними роботи [12], при високих (6 Гр) дозах число МЯ, індукованих випромінюванням після першого поділу, знижується при подальшим культивуванні опромінених клітин і через 24-30 генерацій вже не відрізняється від контрольного рівня. Мабуть при високих дозах випромінювання (більше 3 Гр) хромосомная нестабільність, що виявляється в наступних поколіннях опромінених клітин, пов'язана більшою мірою з утворенням «de novo» хромосомнихаберацій обмінного типу. Оскільки поява таких обмінних аберацій не супроводжується появою супутніх їм парних фрагментів, то прояви хромосомної нестабільності при високих дозах опромінення в більшій мірі пов'язані з підвищеним рівнем ХА у нащадків опромінених клітин.

    Робота виконана за фінансової підтримки РФФД (проект 06-04-48300).

    література

    1. Little J.B. // Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V. 74, N 6. - Р. 663-671.

    2. Wright E.G. // Med. Confl. Surviv. - 2000. - V. 16, N 1. - Р. 117-133.

    3. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. // Радіаційна біологія. Радіоекологія. - 2001. - Т. 41, № 3. - С. 272 ​​289.

    4. Готліб В.Я., Топонайнен Н.Я., Пелевіна І.І. // Біологія. - 1985. - Т. 25, Вип. 4. - С. 435-443.

    5. Jamali M., Trott K.R. // Int. J. Radiat. Biol. - 1996. - V. 70, N 6. - P. 705-709.

    6. Kadhim M.A., Marsden S.J., Wright E.G. // Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V. 73, N 2. - P. 143-148.

    7. Пелевіна І.І., Готліб В.Я., Кудряшова О.В. та ін. // Онтогенез. - 2001. - Т. 32, № 1. - С. 51-57.

    8. Ponnaiya B., Cornforth M.N., Ullrich R.L. // Radiat. Res. - 1997. - V. 147, N 3. - Р. 288-294.

    9. Sobatier L., Lebeau J., Pommier J.P. et al. // Radiat. Res. Congress Proc. - 1995. - V. 2. - P. 509-512.

    10. Biological Effects at Low Radiation Doses - Models. Mechanisms and Uncertainties. Report to General Assembly. 48 session of UNSCEAR. Vienna, 12-16 April, 1999..

    11. Антощіна М.М., Рябченко Н.І., Насонова В.А. та ін. // Радіаційна біологія. Радіоекологія. -2005. - Т. 45. № 3. - С. 291-293.

    12. Пелевіна І.І., Алещенко А.В., Антощіна М.М. та ін. // Радіаційна біологія. Радіоекологія. -2003. - Т. 43, № 2. - C. 161-166.

    13. Heddle J.A., Carrano A.V. // Mutat. Res. - 1977. - V. 44, N 1. - P. 63-69.

    14. Македонов Г.П., Цвовребова Л.В. // Радіаційна біологія. Радіоекологія. - 2003. - Т. 42, № 5. - C. 469-474.

    15. Sobaties L., Lebeau J., Dutrillaux B. // Int. J Radiat. Biol. - 1994. - V. 66, N 5. - Р. 611-613.

    16. Fenech M., Crott J., Turner J. et al. // Mutagenesis. - 1999. - V. 14, N 6. - Р. 605-612.

    17. Kirsch-Volders M., Vanhauwaert A., De Boeck M. et al. // Mutat. Res. - 2002. - V. 504, N 1-2. - Р. 137-148.

    18. Salassidis K., Huber R., Zitzelsberger H. et al. // Environ. Mol. Mutagen. - 1992. - V. 19, N 1. - Р. 1-6.

    19. Keshava C., Ong T., Nath J. // Mutat. Res. - 1995. - V. 328, N 1. - P. 63-71.

    20. Ponza I., Barquinero J.F., Egozcue J. et al. // Radiat. Res. - 2001. - V. 155, N 3. - Р. 424-431.

    Analysis of chromosome aberrations and micronucleus in the descendants of Chinese hamster cells, irradiated at various doses and intensities of 7-radiation

    Ryabchenko N.I., Antoschina M.M., Nasonova V.A., Fesenko E.V.

    Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk

    The Chinese hamster cells V-79 were irradiated by y-rays in doses 0.5 Gy and 3 Gy at dose rate of 0.48 Gy / min (an acute irradiation) and in dose 0.5 Gy at dose rate of 0.0485 MGy / min (a prolonged irradiation ). The acute and prolonged irradiation in a dose 0.5 Gy enlarges frequency of appearance of micronucleus. Subsequent cultivation of the irradiated cells during 20 generations enlarges frequency of micronucleus, and for a prolonged irradiation the boosted frequency of micronucleus is saved during 40-60 generations. After an acute irradiation the number of micronucleus starts to be reduced after 20 generations. An acute and prolonged irradiating in a dose 0.5 Gy enlarge frequency of chromosome aberrations at once after an irradiating, which is gradually reduced up to a control level to 20 generating. The irradiating in a dose 3 Gy enlarges frequency of chromosome aberrations at once after an irradiating, which is reduced up to a control level to 20 generating, then increases to 40-th generating and remains at this level before 60-th generating.


    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити