Область наук:

  • біологічні науки

  • Рік видавництва: 2008


    Журнал: Известия Пензенського державного педагогічного університету ім. В.Г. Бєлінського


    Наукова стаття на тему 'Ампліфікація ДНК in vitro'

    Текст наукової роботи на тему «Ампліфікація ДНК in vitro»

    ?ки Мордовія. Т. 2. Тварини. Саранськ: Мордов. кн. вид-во, 2005. С. 125.

    22. Губанов І. А., Кисельов К. В., Новіков В.С., Тихомиров В. Н. Кирказон звичайний - Aristolochia clema-titis L. // Ілюстрований визначник рослин Середньої Росії. Т. 2. Покритонасінні (Дводольні: раздельнолепестний). М .: КМК, 2003. С. 44.

    23. Маєвський П. Ф. Флора середньої смуги європейської частини Росії (Изд. 10-е). М .: КМК, 2006. С. 188-189.

    24. Сацердотов Б. П. Рослинність заповідного ділянки «Сосновий бір» Куйбишевського державного заповідника; Флора заповідного ділянки «Сосновий бір» Куйбишевського державного заповідника // Праці Куйбишевського державного заповідника. Вип. 1. М .: Червоний пролетар, 1939. 208 с.

    25. Штукенберг А. А. З давньої і нової історії долини р. Сури поблизу м Пензи // Праці Пензенського товариства Любителів Природознавства і краєзнавства. 1925. Вип. IX. 27 з.

    26. Коршиков Л. В., Корнєв С. В., Горбунов П. Ю. Нотатки до пізнання фауни RHOPALOCERA (LEPIDOP-TERA) Оренбурзької області // Біорізноманіття та біоресурси Уралу і суміжних територій. Мат. межд. науч. конференції. Оренбург: Газпромпечать, 2001. С. 223-227.

    27. чину М. І., Цінговатов Л. В. Календар природи Пензенської області. Пенза: Приволзькому книжкове вид-во, 1964. 118 с.

    28. Агроклиматический довідник по Пензенській області / під ред. Ю. П. Ліберовскій. Л .: Гідрометеорологічне вид-во, 1958. 100 с.

    29. Полтавський А. Н. Деякі дані про чисельність вітрильників (Lepidoptera, Papilionidae) в Ростовській області // Еверсманна. ентомологічні дослід-

    вання в Росії і сусідніх регіонах. 2006. Вип. 7-8. Тула. С. 42-45.

    30. Ганжа Е. А., Кириченко Л. М. Поліксена - Zerynthia polyxena ([Den. Et Schiff.], 1775) // Червона книга Тамбовської області: Тварини. Тамбов: Тамбовполігра-фіздат, 2000. С. 99.

    31. Блінушов А. Е. Поліксена - Zerynthia polyxena ([Den. Et Schiff.], 1775) // Червона книга Рязанської області. Рідкісні і знаходяться під загрозою зникнення види тварин. Рязань: Узорочье, 2001. С. 265.

    32. Анікін В. В., рідні Н. В. Поліксена - Zerynthia polyxena ([Den. Et Schiff.], 1 775) // Червона книга Саратовської області: Гриби. Лишайники. Рослини. Тварини. Саратов: Изд-во Торгово-промислової палати Саратов.обл., 2006. С. 298.

    33. Некрутенко Ю., Чиколовець В. Денші метелики Украши. Кі1в: Видавництво Раевського, 2005. 232 с.

    34. Ластухін А. А. Екологія зникаючої реліктової метелики Поліксени в Чуваської РСР і питання її охорони // Актуальні екологічні проблеми Чув. РСР. Тез. доп. наук.-практ. конф. Чебоксари, 1991. С. 73-75.

    35. Гусинін І. А. Отруйні рослини і викликані ними отруєння сільськогосподарських тварин. М .: Сельхозиздат, 1958. 221 с.

    36. Вільнер А. М. Кормові отруєння сільськогосподарських тварин. Л .: Колос, 1966. 448 с.

    37. дудар А. К. Отруйні і шкідливі рослини луків, сіножатей та пасовищ. М .: Россельхозиздат, 1971. 95 с.

    38. Полумордвінов О. А. До питання про збереження біорізноманіття комах (Insecta) на території Пензенської області // Охорона біологічного різноманіття та розвиток мисливського господарства Росії. Мат. Всерос. науково-практ. конф. Пенза: ПГСХА, 2005. С. 65-67.

    УДК 577.21

    АМПЛІФІКАЦІЯ ДНК IN VITRO

    Ю. В. ПРОХОРОВА

    Пензенський державний педагогічний університет ім. В. Г. Бєлінського

    кафедра біохімії

    Відкриття методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) стало одним з найбільш видатних подій в галузі молекулярної біології за останні 20 років. Полімеразна ланцюгова реакція - це витончений метод, що імітує природну реплікацію ДНК і дозволяє виявити і багаторазово копіювати за допомогою термофільної ДНК-полімерази певний фрагмент ДНК [10].

    Вперше склад інгредієнтів, що входять в реакційну суміш для постановки полімеразної ланцюгової реакції, і основні принципи використання прай-мерів (коротких штучно синтезованих молекул ДНК) для отримання копій ДНК були описані К1ерре з співавторами в 1971 році. Однак тоді ще не була продемонстрована основна риса ПЛР -експоненціальное збільшення кількості копій фрагмента вихідної ДНК, як результат реакції [3]. Перше повідомлення про сучасну ПЛР було опубліковано співробітником корпорації «СеШв» Кагу МіШв

    і співавторами в 1985 році в журналі «Science» [8]. Удосконалення методу ПЛР і широкому її використанню сприяв розвиток деяких технологій. Зокрема, поява приладів, що дозволяють автоматично синтезувати одноцепочечниє фрагменти ДНК (олігонуклеотиди-праймери). У той же період були виявлені унікальні мікроорганізми, які живуть в гейзерах. Їх ферментні системи, в тому числі і ДНК-полімераза, витримують високі температури гарячих джерел (до 95 ° С) і при цьому зберігають свою біологічну активність. Журнал «Science» в 1989 році назвав відкриту термостабільну ДНК-полімерази, що дає можливість автоматизувати ПЛР, молекулою року [4].

    У 1987 році P. Chomezynski і N. Sacchi запропонували одноетапний метод виділення ДНК за допомогою гуанідінтіоціанат-фенолхлороформной екстракції, а К. В. Mullis і F. A. Faloona ввели в практичну медицину метод синтезу ДНК in vitro. особливо бурхливий

    ПРИРОДНИЧІ НАУКИ >>>>>

    розвиток метод ПЛР отримав завдяки міжнародній програмі «Геном людини» [13].

    Метод ампліфікації ДНК відразу ж був впроваджений в практику, що дозволило підняти медичну діагностику на якісно новий рівень. Універсальність, висока чутливість і відносна простота виконання зробили метод ПЛР незамінним для вирішення різних завдань клінічної діагностики, таких як пряме виявлення та ідентифікація збудників захворювань, молекулярне типи-вання і дослідження властивостей патогенних мікроорганізмів, аналіз мутацій, пов'язаних з генетичними захворюваннями у людини і т. д. [6] В даний час запропоновані різноманітні модифікації ПЛР, в тому числі «лонг-ПЛР», ПЛР з використанням «гарячого старту», ​​назад-транскрипційних ПЛР, «гніздовий» ПЛР, лігазная ланцюгова реакція, мультиплексная ПЛР і деякі інші. [2] За відкриття ПЛР К. В. Mullis в 1993 році був удостоєний Нобелівської премії в галузі хімії.

    Суть методу ПЛР

    Метод ПЛР забезпечує багаторазове примноження (ампліфікацію, amplification - посилення, збільшення) в умовах in vitro фрагментів геному і швидке накопичення практично в будь-яких кількостях певної, що цікавить дослідника послідовності ДНК, яка спочатку може бути представлена ​​лише однією молекулою. В результаті отримують кількість матеріалу, достатня для проведення аналізу звичайними методами.

    Суть методу ПЛР полягає в багаторазовому циклічному процесі, що включає в себе три послідовно змінюються стадії. Перша стадія являє собою плавлення (денатурацію) ДНК при температурі 90-97 ° С, т. Е. Розплітання подвійної спіралі ДНК, розбіжність ниток нуклеїнових кислот. На другій стадії відбувається гібридизація або отжиг ДНК з праймером (запалом) при температурі 50-60 ° С, в результаті якого відбувається комплементарне зв'язування специфічної олігонуклео-тідной послідовності праймера з певною ділянкою матричної ДНК. На третій заключній стадії здійснюється процес елонгації (подовження) ниток ДНК, що каталізує термостабільної Taq-полімераза в напрямку від 5'-кінця до З'-кон-цу при оптимальній для роботи ферменту температурі 72 ° С. Один цикл ПЛР триває від 2 до 5 хвилин. У другому і наступних циклах праймери гібридизується-ються з вихідної ДНК і з знову синтезованими олігонуклеотидних молекулами, отже, кількість копій певного фрагмента ДНК збільшується в геометричній прогресії [3].

    Для проведення ПЛР необхідні наступні матеріали: 1) два синтетичних олигонуклеотид-них праймера (завдовжки приблизно по 20 нуклеотидів), комплементарні певних ділянок ДНК з протилежних ланцюгів, їх З'-гідроксильні кінці після відпалу з ДНК повинні бути орієнтовані назустріч один одному; 2) ДНК-мішень довжиною від 100 до

    35 000 пар нуклеотидів; 3) термостабильная ДНК-полімераза (Taq-полімераза, ТШ-полімераза або ліга через), яка не втрачає своєї активності при температурі 95 ° і вище; 4) суміш чотирьох дезоксірібонуклео-тідов певної концентрації.

    5) Буферний розчин для забезпечення оптимальних умов роботи і іони магнію (Mg2 +) - каталізатор ферменту Taq-ДHK-полімерази. [1]

    підбір праймерів

    Праймери - синтетичні олігонуклеотиди, що складаються з 15-30 нуклеотидів, комплементарних сайтів (ділянок) на ідентифікованої матричної ДНК. Синтез праймерів - досить трудомісткий процес. В даний час підбір послідовності забезпечується автоматично з використанням відповідних програм. Від правильності підбору праймерів залежить рівень ампліфікації ДНК [3]. Особливо важлива наявність комплементарності З'-кон-цевих нуклеотидів праймерів в виявляється генетичній структурі, так як відсутність даного умови призводить до різкого зниження (в десятки разів) ефективності приєднання до -кінцю нових нуклеотидів, що, природно, ускладнює подальше зростання полінуклеотидних ланцюга. Часто в 5'-кінцева ділянка праймерів для спрощення клонування ПЛР-амп-ліфікованих ДНК вводять сайти впізнавання для рестріктірующіх ендонуклеаз.

    Конструювання праймерів проводиться після визначення нуклеотидних послідовностей в досліджуваній ДНК методом секвенування. Для підбору оптимальних умов ПЛР з вибраними праймі-рами застосовують різні комп'ютерні програми, наприклад, OLIGO [14].

    З усього вище сказаного можна сформувати такі вимоги до праймером:

    1. Праймери повинні бути специфічні. Особливу увагу приділяють З'-кінців праймерів, т. К. Саме з них починає добудовувати компліментарну ланцюг ДНК Taq-полімераза. Якщо їх специфічність недостатня, то, ймовірно, що в пробірці з реакційною сумішшю відбуватимуться небажані процеси, а саме, синтез неспецифічної ДНК (коротких або довгих фрагментів). Частина праймерів і дНТФ витрачається на синтез неспецифічної ДНК, що призводить до значної втрати чутливості.

    2. Праймери не повинні утворювати димери і петлі, т. Е. Не повинно утворюватися стійких подвійних ланцюгів в результаті відпалу праймерів самих на себе або один з одним.

    3. Область відпалу праймерів повинна знаходитися поза зонами мутацій, делецій або інсерцій в межах видовий чи іншої, взятої в якості критерію при виборі праймерів, специфічності. При попаданні на таку зону, відпалу праймерів відбуватися не буде, і як наслідок - помилково негативні результати [4].

    Tag-полімераза

    У 1980 році полімеразна активність була відкрита у деяких форм термофільних бактерій. Taq-полімераза була виділена з бактерій виду Т'егтт

    aquaticus, здатних рости при температурі 70-75 ° С. Молекулярний вага очищеного протеїну 94 кД і оптимальна температура полімеразної активності 70-80 ° С. Активність ферменту зменшується, але по-лімераза НЕ денатурируется при 90 ° С, при зниженні температури до 70-80 ° С рівень активності відновлюється [13].

    Tag-полімераза має дуже високу швидкість синтезу. За оптимальних умов фермент може добудовувати до 150 підстав на секунду. При низькій температурі активність падає до 2 підстав на секунду. Час напіввиведення Taq-полімерази при 95 ° С становить 40 хвилин [4]. Кілька років тому вдалося отримати з бактерій Т'егтт ТЬегторИШ ТШ-ДНК-полімерази, яка виконує цілий ряд функцій, в тому числі забезпечує репарацію і реплікацію ДНК, і володіє іобратнотранскріптазной активністю, дозволяючи отримувати з РНК комплементарних ДНК. Вона здатна подовжувати короткі олігонуклео-тідние послідовності (праймери), приєднуючи до їх -кінцю додатковий нуклеотид за умови, що праймер комплементарен сайту ланцюга ДНК (матриці). Нарощування довжини праймера за допомогою полімерази відбувається до тих пір, поки не буде досягнутий 5'-кінець матриці [12].

    Послідовності-мішені ДНК

    В якості матриці для синтезу продуктів ПЛР використовують будь-який тип ДНК: геномної ДНК людини, різних видів прокаріотів і еукаріотів, вірусів, ДНК, виділену з культур клітин, «бібліотек» генів і інших джерел. Метод не вимагає великих кількостей досліджуваної ДНК, в принципі, досить навіть молекули, що міститься в одному волосі голови, однієї краплі крові або сперми.

    ДНК може бути виділена з будь-якого типу тканин і клітин, що містять ядра. Етапи виділення ДНК включають швидкий лізис клітин, видалення фрагментів клітинних органел і мембран за допомогою центрифугування, ферментативне руйнування білків протеиназами і екстрагування ДНК з розчину за допомогою фенолу і хлороформу. Потім ДНК осаджують, як правило, етанолом і після видалення надосадової рідини розчиняють в буферному розчині [8].

    Молекула ДНК однієї хромосоми середнього розміру містить 150х106 пар нуклеотидів і має довжину близько 4 см. Молекули такого розміру чутливі до механічних впливів, які виникають в розчині в процесі виділення, і часто фрагментируются. В ході виділення отримують молекули ДНК значно менше вихідних, але все одно дуже великі - тисячі або десятки тисяч пар нуклеотидів. Такі молекули незручні для досліджень, і їх доводиться додатково фрагментировать. зазвичай невеликі фрагменти детектувати простіше. Краще, щоб їх розмір не перевищував 200 пар нуклеотидів, а оптимальною є довжина менше 100 пар нуклеотидів, в цьому випадку ампліфікація практично завжди проходить успішно [3].

    Консервативні послідовності-мішені

    Щоб ПЛР пройшла успішно, повинна відбутися гібридизація амплімера з потрібною послідовністю-мішенню. Якщо ця послідовність злегка розрізняється у різних індивідуумів або у мікроорганізмів з різних ізолятів (т. Е. Має місце поліморфізм), може відбутися її неповне спаровування з амплімером і порушення нормальної ампліфікації, що призведе до отримання помилково негативні результати. На щастя, у людини велика частина геномних послідовностей консервативна і не відрізняється у різних індивідуумів, так що зазвичай для них можна використовувати один набір «консервативних» амплімеров.

    Поліморфні послідовності-мішені

    У разі поліморфних мішеней, в повному обсязі гомологічних обраним праймерів, гібридизація і подовження праймерів можуть взагалі не відбутися. Найбільш критичним при цьому є неправильне відповідність матриці 3'-кінцевих нуклеотидів амплімера. Показано, що невелике порушення гомології між 3'-кінцем праймера і матрицею не позначається на ході реакції, якщо концентрація нуклеозид-трифосфатів знаходиться на рівні, звичайному для ПЛР. При низькій концентрації нуклеозидтрифосфатів таке порушення блокує ампліфікацію. Таким чином, за допомогою ПЛР можна розрізнити аллели, що розрізняються за все одним нуклеотидів.

    Поліморфні локуси ДНК людини добре вивчені і охарактеризовані. У багатьох випадках поліморфізм виникає в результаті функціонально значущих мутацій в статевих або соматичних клітинах, і для виявлення таких мутацій можна створити спеціальні праймери і гібридизаційним зонди [7]. Крім того, в геномі людини ідентифіковано велику кількість повторюваних послідовностей, число яких сильно варіює у різних індивідуумів. Ампліфікація таких ділянок і подальший аналіз фрагментів ДНК за допомогою електрофорезу дозволяє отримати картину смуг, характерну (специфічну) для кожного індивідуума. Аналіз поліморфізму і повторюваних послідовностей може використовуватися також для ідентифікації особи (ПЛР-відбиток пальців), на приклад VNTR, STR поліморфізм [10].

    Що стосується мікроорганізмів, то даних про їх поліморфізм набагато менше, і результати ПЛР-тестів можуть виявитися помилково негативні. В цьому випадку поліморфізм може відображати алельних відмінності між ізолятів або виникати в результаті нестабільності генома (наприклад, у ретровірусів). У зв'язку з обмеженістю даних про структуру геному мікроорганізмів доводиться визначати специфічність набору праймерів і зондів експериментально. Ідеальний набір праймерів повинен виявляти всі ізоляти досліджуваного виду, але не близькоспоріднені і розрізняються з медичної точки зору види. Оскільки навіть у ізолятів послідовності-мішені можуть злегка відрізнятися, для їх ідентифік-


    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити