Завдання. розробити живильне середовище Амніокар, що містить ембріональну телячу сироватку (ЕТС) і коктейль чинників зростання, для накопичення біомаси фібробластів людини. Дослідити проліферативну активність даного середовища на культурах клітин мезенхімального походження HUVEC і мезенхімальних стромальних клітинах, а також на культурі клітин амніотичної рідини человека.Матеріали і методи. Визначення швидкості накопичення клітинної маси і морфології клітин при культивуванні клітин різного гістогенезу в середовищі Амніокар і живильному середовищі, містить 10% ЕТС.Результати. Показано, що навколишнє середовище Амніокар перевершувала стандартну середу DMEM з 10% ЕТС в 2-5 разів при культивуванні фібробластів шкіри, HUVEC і мезенхімальних стовбурових клітин. середа Амніокар збільшувала кількість клітин ендотелію, що вступають в мітоз, і підтримувала культуру клітин HUVEC при тривалому пасирування in vitro. Клональне культивування клітин амніотичної рідини людини в середовищі Амніокар забезпечувало розвиток колоній як фібробластоподібних, так і епітеліального тіпа.Виводи. пролиферативная середу Амніокар ефективна для накопичення біомаси різних клітин мезенхімального походження і може використовуватися в діагностичних цілях в медичній генетиці, онкології і ін.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Честков В. В., Табаков В. Ю., Щепкіна Ю. В.


Amniocar as a proliferative medium for mesenchymal cells

Objectives. To develop the Amniocar nutrient medium that contains fetal calf serum (FCS) and growth factors cocktail for mass cultivation of human fibroblasts. To study proliferative activity of the medium on cultures of HUVEC cells of mesenchymal origin and mesenchymal stromal cells, as well as on cell culture of human amniotic fluid.Materials and methods. Determination of the rate of accumulation of the cellular mass and cell morphology in the course of cultivation of cells of various histogenesis in the Amniocar medium and nutrient medium that contains 10% of FCS.Results. It has been demonstrated that the Amniocar medium is prevalent as compared to the standard DMEM medium with 10% of FCS by 2 to 5 times for cultivation of skin fibroblasts, HUVEC, and mesenchymal stem cells. The Amniocar medium increased the quantity of endothelial cells that enter mitosis and maintained the culture of HUVEC cells with prolonged passaging in vitro. Clonal cultivation of human amniotic fluid cells in the Amniocar medium secured development of colonies of both fibroblast and epithelial type.Conclusions. Proliferative Amniocar medium is efficient for mass cultivation of various cells of mesenchymal origin and can be used for diagnostic purposes in medical genetics, oncology, etc.


Область наук:

  • Біотехнології в медицині

  • Рік видавництва: 2014


    Журнал: Успіхи молекулярної онкології


    Наукова стаття на тему 'Амніокар - проліферативна середовище для мезенхімальних клітин'

    Текст наукової роботи на тему «Амніокар - проліферативна середовище для мезенхімальних клітин»

    ?74

    НА ПРАВАХ РЕКЛАМИ

    ! Амніокар - проліферативна середу

    ^ Для мезенхімальних клітин

    В.В. Честков, В.Ю. Табаков, Ю.В. Щепкіна

    ® ФГБУ «Медико-генетичний науковий центр» РАМН, Росія, 115478, Москва, вул. Москворіччі, 1;

    ТОВ НВП «ПанЕко», Росія, 115522, Москва, а / с 119

    _ Контакти: Валерій Вікторович Честков Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    ™ Завдання. Розробити живильне середовище Амніокар, що містить ембріональну телячу сироватку (ЕТС) і коктейль факто-

    ^ Рів росту, для накопичення біомаси фібробластів людини. Дослідити проліферативну активність даного середовища на куль-

    ^ Турах клітин мезенхімального походження HUVEC і мезенхімальних стромальних клітинах, а також на культурі клітин

    °? амніотичної рідини людини.

    ^ Матеріали і методи. Визначення швидкості накопичення клітинної маси і морфології клітин при культивуванні клітин

    ЕС різного гістогенезу в середовищі Амніокар і живильному середовищі, що містить 10% ЕТС.

    I- Результати. Показано, що навколишнє середовище Амніокар перевершувала стандартну середу DMEMс 10% ЕТС в 2-5 разів при культивуванні

    Про фібробластів шкіри, HUVEC і мезенхімальних стовбурових клітин. Середа Амніокар збільшувала кількість клітин ендотелію,

    ? вступають в мітоз, і підтримувала культуру клітин HUVEC при тривалому пасирування in vitro. клональне культивують-

    s вання клітин амніотичної рідини людини в середовищі Амніокар забезпечувало розвиток колоній як фібробластоподібних,

    X так і епітеліального типу.

    ??^ Висновки. Пролиферативная середу Амніокар ефективна для накопичення біомаси різних клітин мезенхімального походжу-

    ЙД дення і може використовуватися в діагностичних цілях в медичній генетиці, онкології і ін.

    Ключові слова: живильне середовище, ембріональна теляча сироватка, проліферація, фібробласти, мезенхімальні будів-формальні клітини, амніотична рідина, амніокар, amniomax, HUVEC, in vitro

    Amniocar as a proliferative medium for mesenchymal cells

    V.V. Chestkov, V.Yu. Tabakov, Yu.V. Shchepkina

    Medical and Genetic Reseach Center, Russian Academy of Medical Sciences, Russia, 115478, Moscow, Zamoskvorechiye St., 1;

    NPP "PanEco" LLC, Russa, 115522, Moscow, p / o box 119

    Objectives. To develop the Amniocar nutrient medium that contains fetal calf serum (FCS) and growth factors cocktail for mass cultivation of human fibroblasts. To study proliferative activity of the medium on cultures of HUVEC cells of mesenchymal origin and mesenchymal stromal cells, as well as on cell culture of human amniotic fluid.

    Materials and methods. Determination of the rate of accumulation of the cellular mass and cell morphology in the course of cultivation of cells of various histogenesis in the Amniocar medium and nutrient medium that contains 10% of FCS.

    Results. It has been demonstrated that the Amniocar medium is prevalent as compared to the standard DMEM medium with 10% of FCS by 2 to 5 times for cultivation of skin fibroblasts, HUVEC, and mesenchymal stem cells. The Amniocar medium increased the quantity of endothelial cells that enter mitosis and maintained the culture of HUVEC cells with prolonged passaging in vitro. Clonal cultivation of human amniotic fluid cells in the Amniocar medium secured development of colonies of both fibroblast and epithelial type.

    Conclusions. Proliferative Amniocar medium is efficient for mass cultivation of various cells of mesenchymal origin and can be usedfor diagnostic purposes in medical genetics, oncology, etc.

    Key words: nutrient medium, fetal calf serum, proliferation, fibroblasts, mesenchymal stromal cells, amniotic fluid, Amniocar, amniomax, HUVEC, in vitro

    Вступ

    Розширення використання методу культури тканини в різних областях діагностичної медицини визначається не тільки наростаючою потребою в діагностиці захворювань на молекулярно-генети-зації і клітинному рівні, але також і розробками в області замісної клітинної та тканинної терапії [1]. Поставлена ​​задача вимагає культивування клітинних елементів самих різних тканин організму, які потребують певних гуморальних регуляторних-раторних факторах мікрооточення. це передбачає,

    що культивування різних клітин організму вимагає спеціальних умов для кожного типу клітин [2].

    Метод культивування клітин людини заснований на використанні класичних поживних середовищ з відомим хімічним складом і універсальної добавкою - сироваткою великої рогатої худоби, найчастіше це ембріональна теляча сироватка (ЕТС) [3]. Цей підхід дозволяє створювати варіації живильного середовища за складом мінеральних солей, амінокислот і вітамінів, але обмежений в зміні змісту факторів росту клітин. Їх пропорція і зміст

    НА ПРАВАХ РЕКЛАМИ

    75

    визначаються додається в живильне середовище ЕТС, розведення якої в 10 і більше разів на складі середовища робить концентрацію сироваткових компонентів свідомо нижче фізіологічної. Такий метод культивування зручний завдяки його універсальності щодо більшості клітинних ліній і первинних клітинних культур, але залишає широке вікно можливостей по оптимізації складу поживних середовищ для конкретних типів клітин [4].

    Серед різних типів клітин, які використовуються для діагностики в сучасній медицині, фібро-бласти є одним з найбільш затребуваних [5]. Тому була зроблена спроба розробки живильного середовища, ефективної для швидкого і масового культивування цих клітин [6]. Оскільки розроблена середовище виявилося затребуваною, в першу чергу, при цитогенетичної діагностики з використанням клітин амніотичної рідини, вона отримала назву Амніокар [7]. У статті наводяться дані на користь того, що ця живильне середовище підтримує високий рівень проліферації і інших клітин організму і, отже, може бути використана для вирішення більш широкого кола завдань.

    матеріали та методи

    У роботі використовувався клітинний матеріал від пацієнтів і донорів, що залишився незатребуваним при проведенні цитогенетичної діагностики в МГНЦ РАМН. Культивування клітин проводилося в атмосфері з 5% СО2.

    Використані в роботі реактиви для культивування клітин зроблені НПП «ПанЕко». Середа Амніокар містить живильне середовище DMEM з модифікаціями, 10% ЕТС, фактори росту клітин в оптимальній концентрації для кожної партії ЕТС, гормони та ін.

    Оцінка проліферативних властивостей середовища Амніо-кар проводилася за результатами культивування фібробластів шкіри дорослої людини HSF-W58 на 17-19-му пасажі. В якості контролю використовували живильне середовище DMEM з 10% ЕТС. Іншим контролем була комерційно Доступне середовище Amnio-тах-С100 (Invitrogen, Life Technologies, США).

    результати

    Результати кількісної оцінки проліфера-тивних властивостей фібробластів в випробовуваних середовищах представлені в табл. 1. Показано, що по ефективності культивування фібробластів розроблена середу Амніокар багаторазово перевершує середу DMEM з 10% ЕТС (стандартні умови культивування) і не поступається середовищі Amniomax. Морфологія фибро-бластів в середовищі Амніокар не відрізняється від їх морфології в контрольному середовищі (малюнок). Необхідно відзначити додаткову перевагу середовища Амніокар - вона може зберігатися при -20 ° С більше 1 року.

    Таблиця 1. Відносний показник зростання і час подвоєння культури фібробластів в різних середовищах

    Середовище щодо показників зростання Час подвоєння, ч

    Контроль (DMEM + 10% ЕТС) 1 42

    Amniomax-C100 (Invitrogen) [7] 3,0 27,2

    Amniomax-II (Invitrogen) [7] 3,6 25,5

    Амніокар (НПП «ПанЕко») [6] 6,4 21,8

    рах СЧ

    Ж ш

    CJ

    Цитоморфологія фібробластів шкіри дорослої людини штаму HSF- W58 в різних умовах культивування: а - в ростовий середовищі DMEM +10% ЕТС; б - в проліферативної середовищі Амніокар. Фазовий контраст (х 150)

    76

    НА ПРАВАХ РЕКЛАМИ

    рах

    Ж ш

    і

    Перспективною моделлю для дослідження процесів ангіогенезу, патогенезу і лікування захворювань серця і судин є псевдолініі диплоїдних клітин ендотелію пупкової вени людини HUVEC [8, 9]. Разом з тим відзначено, що зростання цих клітин в культурі in vitro уповільнений і сильно обмежений в пасажах при використанні класичних середовищ [10]. Ці клітини, так само як і фібробласти, мають мезенхімального походження, що дозволило оцінити ефективність їх культивування в розробленій середовищі при тривалому пасирування in vitro. Показано, що про-ліфератівная середу Амніокар стимулює проліферацію клітин ендотелію і перешкоджає їх переходу в стан термінальної диференціювання. При цьому кількість подвоєнь клітин в культурі зростає з 3-4 до 15-20 (табл. 2).

    Таблиця 2. Порівняльна характеристика росту культури клітин HUVEC в класичній (DMEM / F12) і проліферативної (Амніокар) середовищах

    Таблиця 3. Порівняльна характеристика проліфератівн'х середовищ для культивування клітин амніотичної рідини

    Максимальна Час

    Середа число пасажів подвоєння

    в культурі в пасажах, ч

    Контроль (DMEM / F12 + 10% ЕТС) 4 52

    Амніокар (НПП «ПанЕко») [6] 20 20,3-38,6

    У нашій лабораторії отримані дані про те, що навколишнє середовище Амніокар може бути ефективна при культивуванні мезенхімальних стромальних клітин, виділених з жирової тканини.

    Живильне середовище Амніокар знайшла застосування в медичній генетиці для культивування клітин амніотичної рідини. У табл. 3 наведені дані 1115 незалежних порівняльних досліджень використання даного середовища для цитогенетичної діагностики в зіставленні з результатами культивування в середовищі Атшотах-С100 [11]. Клітини амніотичної рідини культивували 8-12 діб, потім оцінювали кількість утворилися колоній і мітотичний індекс клітинної культури. Необхідно відзначити, що морфологія клітин і колоній вказувала на ефективний клональний зростання як фібробластоподоб-них, так і епітеліальних клітин.

    Обговорення

    Основною тенденцією в розвитку сучасних поживних середовищ для клітин людини і тварин є розробка бессивороточной середовищ. Однак для культивування первинних клітинних культур їх ефективність недостатня, і стандартні методи культивування з використанням класичних поживних середовищ і сироваток тваринного походження залишаються широко використовуваними в діагностичній роботі. Для цих цілей розробляються поживні середовища, що містять сироватку тварин і коктейль факторів росту, що стимулює проліферацію ін-

    Середнє число Мітотічес-

    Серед колон кий індекс,%

    на флакон 25 см2 (на 5000 клітин)

    Amniomax-C100 (Invitrogen) 9,9 ± 4,5 4,35 ± 0,65

    Амніокар (НПП «ПанЕко») 8,5 ± 3,6 3,94 ± 1,2

    Тереса клітин. Такі середовища можна позначити як проліферативні.

    У даній роботі представлені результати розробки проліферативної живильного середовища Амніокар, оптимізованої для культивування фібробластів та інших клітин мезенхімального походження. Оскільки кожна партія ЕТС має свій проліферативним потенціалом, оптимальна концентрація факторів росту повинна підбиратися з урахуванням якості використовуваної ЕТС. НПП «ПанЕко» вже протягом декількох років виробляє сприятливе середовище Амніокар, що не поступається за ростовими властивостями світовим аналогам.

    Питання про адекватність таких проліферативних середовищ умов, що існують навколо клітини in vivo, ще довго не матиме однозначної відповіді. Склад факторів росту в тканинної рідини, що оточує клітину, в певній мірі динамічний і відрізняється від складу сироватки крові. Крім того, використання 10% ЕТС свідомо прирікає культивовані клітини на дефіцит більшості сироваткових факторів росту клітин. З іншого боку, зміст чинників зростання в проліферативних середовищах істотно вище їх концентрації в сироватці тварин. Оскільки в коктейль входить, як правило, лише кілька факторів росту, можливий дисбаланс їх змісту в живильному середовищі, що потенційно може змінювати напрямок диференціювання клітин.

    За умов культивування клітин, далеких від фізіологічних, частіше порушується проходження клітинами нормального клітинного циклу і в культурі клітин спостерігається підвищена частота хромосомних аберацій [12-14]. Такі наслідки вкрай небажані для розроблюваних проліферативних середовищ, оскільки вони використовуються, в тому числі, і для цито-генетичної діагностики. Необхідно відзначити, що Амніокар вже кілька років застосовується в цитогенной-ної діагностики, і подібного роду проблем при його використанні не виявлено. Мабуть, це єдиний, але досить надійний інтегральний показник відповідності розробленої середовища фізіологічним потребам клітин.

    висновок

    Розроблена пролиферативная середу Амніокар може ефективно застосовуватися для культивування клітин амніотичної рідини, а також для швидкого накопичення біомаси клітин мезенхімального походження при культивуванні in vitro.

    НА ПРАВАХ РЕКЛАМИ

    77

    1. Soto-Gutierrez A., Yagi H., Uygun B.E. et al. Cell delivery: from cell transplantation to organ engineering. Cell Transplant 2010 року; 19 (6): 655-65.

    2. Freshney R.I. Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique. 5th ed. Hoboken, NJ: John Wiley&Sons, 2005.

    3. Boone C.W., Mantel N., Caruso T.D. Jr. et al. Quality control studies on fetal bovine serum used in tissue culture. In vitro 1971; 7 (3): 174-89.

    4. Табаков В.Ю., Щепкіна Ю.В., Честков В.В. Сучасні принципи класифікації і розробки поживних середовищ для культивування клітин людини і тварин. Клітинні технології в біології та медицині 2013; (1): 47-57. [Tabakov V.Yu., Shchepkina Yu.V., Chestkov V.V. Modern principles of classification and development of nutrient media for cultivation of human and animal cells. Kletochnye tekhnologii

    v biologii i meditsine = Cell Technologies in Biology and Medicine 2013; (1): 47-57. (In Russ.)]

    5. Wong T., McGrath J. A., Navsaria H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. Br J Dermatol 2007; 156 (6): 1149-55.

    ЛІТЕРАТУРА

    6. Chang H.C., Jones O.W., Masui H. Human amniotic fluid cells grown

    in a hormone-supplemented medium: suitability for prenatal diagnosis. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79 (15): 4795-9.

    7. Табаков В.Ю., Щепкіна Ю.В., Честков В.В. Спосіб культивування клітин амніотичної рідини

    і фібробластів людини в спеціалізованому середовищі «Амніокар». Патент RU № 2415929, пріоритет 10.06.2009. [Tabakov V.Yu., Shchepkina Yu.V., Chestkov V.V. Method of cultivation of human amniotic fluid cells and human fibroblasts in the Amniocar specialized medium. Patent RU No. 2415929, priority 10.06.2009. (In Russ.)]

    8. Schaefermeier P.K., Cabeza N., Besser J.C. et al. Potential cell sources for tissue engineering of heart valves

    in comparison with human pulmonary valve cells. ASAIO J 2009 року; 55 (1): 86-92.

    9. Takakura N., Watanabe T., Suenobu S. et al. A role for hematopoietic stem cells in promoting angiogenesis. Cell 2000; 102 (2): 199-209.

    10. Morgan D.M.L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. In: Human Cell Culture Protocols.

    Gareth E. Jones (ed.). Totowa, NJ: HumanaPress, 1996. Pp. 104-9.

    11. Kuligowski S., Csirke B., Biddle W. et al. AMNIOMAX ™ -II complete: a second-generation AMNIOMAX medium for primary amniocyte culture. FOCUS 1999; 21 (2): 35-7.

    12. Полянська Г.Г., Дьяконова М.Ю. Вплив умов культивування на ка-ріотіпіческую структуру клітинної сублінії нирки кенгурові щури. Цитологія 1988; 30 (11): 1355-63. [Polyanskaya G.G., Diakonova M.Yu. Effect of culture conditions on karyotypic structure of cell subline of the kangaroo rat kidney. Tsitologiya = Cytology 1988; 30 (11): 1355-63. (In Russ.)]

    13. Pochampally R.R., Smith J.R., Ylostalo J., Prockop D.J. Serum deprivation of human marrow stromal cells (hMSCs) selects for a subpopulation of early progenitor cells with enhanced expression of OCT-4 and other embryonic genes. Blood 2004; 103 (5): 1647-52.

    14. Tian J., Ishibashi K., Honda S. et al. The expression of native and cultured human retinal pigment epithelial cells grown in different culture conditions. Br J Ophthalmol 2005; 89 (11): 1510-7.

    СЧ

    СЧ

    Ж ш

    CJ


    Ключові слова: ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ /Ембріональні телячої СИРОВАТКА /ПРОЛІФЕРАЦІЯ /фібробластів /МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ стромальні клітини /амніотичної рідини /АМНІОКАР /AMNIOMAX /HUVEC /IN VITRO

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити