На гомозиготних мутантних мишах лінії С57BL / KsYJLeprdb /+ вивчені можливості корекції вуглеводного обміну, метаболічних і імунологічних порушень за допомогою Алло ізогенних гемопоетичних і стромальной фракцій клітин кісткового мозку. Дослід проводився на першій і другій стадіях захворювання. В результаті експериментів було доведено, що стовбурові і прогеніторні ККМ виконують не замісну, а біорегуляторних функцію.

Анотація наукової статті по ветеринарним наук, автор наукової роботи - Степанова О. І., Каркіщенко Н. Н., Онищенко Н. А., Баранова О. В.


Область наук:
  • ветеринарні науки
  • Рік видавництва: 2010
    Журнал: біомедицина

    Наукова стаття на тему 'Альтернативні моделі клітинної трансплантології при цукровому діабеті 2 типу в різні терміни захворювання'

    Текст наукової роботи на тему «Альтернативні моделі клітинної трансплантології при цукровому діабеті 2 типу в різні терміни захворювання»

    ?Біомедицина • № 5, 2010 С. 22-25

    Альтернативні моделі клітинної трансплантології при цукровому діабеті 2 типу в різні терміни захворювання

    О.І.Степанова, Н.Н.Каркіщенко, Н.А.Оніщенко *, О.В.Баранова

    Науковий центр біомедичних технологій РАМН, Московська область

    * НФЦ трансплантології і штучних органів імені академіка В.І.Шумакова,

    Москва

    На гомозиготних мутантних мишей лінії С57BL / KsYJLeprdb / + вивчені можливості корекції вуглеводного обміну, метаболічних і імунологічних порушень за допомогою алло-і ізогенних гемопоетичних і стромальной фракцій клітин кісткового мозку. Дослід проводився на першій і другій стадіях захворювання. В результаті експериментів було доведено, що стовбурові і прогеніторні ККМ виконують не замісну, а біорегуляторних функцію.

    Ключові слова: цукровий діабет, миші лінії С57BL / KsYJLeprdb / +, стовбурові клітини.

    Цукровий діабет (ЦД) II типу відноситься до числа найбільш поширених хронічних неінфекційних захворювань в світі і число хворих на ЦД продовжує, неухильно зростати. Незважаючи на певні досягнення останніх років, сучасна медикаментозна терапія цукрового діабету як і раніше не здатна надійно перешкоджати прогресуванню клінічних проявів СД і його ускладнень, тому пошук і розробка нових підходів до лікування ЦД залишається актуальною проблемою.

    Метою нашого дослідження було вивчення можливості корекції вуглеводного обміну, а також метаболічних і імунологічних порушень за допомогою алло-і ізогенних гемопоетичних і стромальной фракцій клітин кісткового мозку (ККМ) при використанні генетичної моделі СД II типу на різних стадіях розвитку цього захворювання.

    матеріали та методи

    Для корекції клінічних і морфологічних ознак СД II типу

    використовували модель гомозигот-

    них мутантних мишей лінії С57BL / KsYJLeprdb / +, ця модель має стадійність перебігу захворювання та відповідні патогенетичні зміни внутрішніх органів. У дослідних групах використовували мишей у віці 1 міс. (Перша стадія захворювання) і в віці 3-4 міс. (Друга стадія захворювання). Для корекції клінічних і патогенетичних порушень захворювання використовували алогенних клітини (гемопоетичних і стромальной фракцій) клітин кісткового мозку (ККМ) від донорів мишей лінії B10.GFP і з-генні (аутологічних) клітини (гемопоетичних і стромальной фракцій) ККМ від фенотипически здорових гетерозиготних мишей тієї ж лінії С57BL / KsYJLeprdb / +. Введення ККМ проводили внутрибрюшинно, вік донорів відповідав віку реципієнтів, терміни спостережень склали 2 і 4 місяці.

    Дослід проводився на першій і другій стадіях захворювання. Всього було проведено 8 серій експериментів.

    I. У досвідчених серіях на другій стадії захворювання були введені ал-Логен і ізогенні ККМ:

    серія 1 - 4,5-5 млн. культивованих (протягом 5 діб) гемопоетіче-ських ККМ (ГПККМ) одноразово;

    серія 2 - 4,5-5 млн. некультивованих ККМ одноразово;

    серія 3 - семиразове введення ККМ за наступною схемою: спочатку вводили 18-20 млн. ГПККМ (мононуклеарного фракцію) культивовані протягом 5 діб в чотири рази з інтервалом в 7 днів; потім - 6-7,5 млн. культивованих мультіпотентних мезенхімальних стромальних (фібробластоподібних) ККМ (ММСК КМ) трикратно (з інтервалом в 14 днів);

    серія 4 - 24-39 млн. культивованих (протягом 5 діб) ГПККМ трикратно з інтервалом 3-4 дня;

    серія 5 - 24-30 млн. культивованих (протягом 14 діб) ММСК КМ трикратно з інтервалом 14 днів;

    серія 6 ​​- 100 млн. культивованих (протягом 5 діб) ГПККМ одноразово.

    II. У досвідчених серіях на першій стадії захворювання були введені ал-Логен і ізогенні ККМ:

    серія 7 - семиразове введення ККМ за наступною схемою: спочатку вводили 18-20 млн. алогенних ГПККМ (моно-нуклеарную фракцію) культивовані протягом 5 діб в чотири рази з інтервалом в 7 днів, а потім 6-7,5 млн. культивовані (протягом 14 діб) ММСК КМ трикратно з інтервалом в 14 днів;

    серія 8 - 100 млн. культивованих (протягом 5 діб) ГПККМ одноразово.

    У мишей-реципієнтів в динаміці визначали в крові вміст глюкози, глікозильованого гемоглобіну, заміряли масу тіла і масу внутрен-

    них органів; визначали обсяг випитої води і з'їденого корму.

    Результати та їх обговорення

    Після введення алогенних ККМ в однакових дозах (4,5-5 млн.) У тварин (через 3-4 міс. Після народження) спостерігали зниження показників рівня глюкози і глікозильованого гемоглобіну в крові, найбільш вірогідно виражений ефект був отриманий в серії з використанням культивованих клітин, а менш виражений в серії з некультивованих ККМ. Однак, як показали спостереження, при багаторазовому послідовному (семиразове) застосуванні алогенних культивованих клітин вдається досягти більш пролонгованої дії на показники вуглеводного обміну.

    Застосування культивованих з-генних ККМ показало наступні результати. У групах з триразовим введенні ГПККМ в кількості 24-39 млн. І в групі з триразовим введенні ММСК КМ в кількості 24-30 млн. Показники вуглеводного обміну були достовірно рівноцінно нижче в порівнянні з контролем, однак ці показники були вищими, ніж в групі у тварин з одноразовому введенням в дозі 100 млн. ГПККМ. При введенні такої дози клітин вдалося досягти більш пролонгованого ефекту зниження показників вуглеводного обміну. Однак алогенних і ізогенні ККМ у всіх серіях дослідів (на другій стадії хвороби СД у тварин) не сприяли стійкого зниження показників вуглеводного обміну, вони лише стабілізували його на рівні нижчому в порівнянні з контролем.

    При використанні культивованих алогенних (при семиразове по-

    Отже введенні ГПККМ і ММСК КМ) і ізогенних (при одноразовому введенні в дозі 100 млн. ГПККМ) ККМ у тварин на ранній стадії розвитку хвороби СД, нам вдалося досягти вираженого пролонгованого ефекту зниження показників вуглеводного обміну до субнормальних величин.

    У всіх досвідчених серіях маса тіла і апетит тварин стабілізувалися і утримувалися на одному рівні (але їх вираженість була різна), а в контрольних групах з СД II типу за аналогічний період маса тіла або підвищувалася, або знижувалася в залежності від стадії перебігу хвороби. Спостерігали зниження поліурії до її повного зникнення, особливо в серіях на ранній стадії розвитку хвороби і в серіях (на другій стадії хвороби) з використанням семиразового введення ККМ і при введенні 100 млн. ККМ; відзначено також усунення мацерації шкірних покривів в досвідчених серіях після клітинної терапії, тоді як в контрольній групі мацерація ставала великою раною, яка залишалося у тварини аж до його загибелі.

    Отримані позитивні ефекти клітинної терапії в досвідчених серіях у тварин на регуляцію вуглеводного обміну привели до пролонгованим терміном виживання, де тривалість життя були в 1,7-2,3 рази (на другій стадії захворювання СД II типу) і 2,5-2,7 рази (на ранній стадії хвороби) більше в порівнянні з контролем.

    Результати морфологічних досліджень

    У підшлунковій залозі (ПЗ) при введенні культивованої суспензії ал-Логен і ізогенних ККМ відзначає-

    ся позитивний ефект, що виражається в збільшенні кількості і розмірів острівців Лангерганса (ОЛ), збільшенні базафільних ^ клітин острівців, високо достовірні результати отримані в серіях 8, 7 і 3, 6.

    З метою підтвердження наявності нейроендокринних клітин в складі ОЛ в досвідчених серіях використовували імуно-гістохімічних (ІГХ) аналіз з хромо-Гранін А. Отримані дані показали, що позитивне цитоплазматическое фарбування було виявлено практично у всіх клітинах острівців груп з використанням ККМ при різних дозах введення.

    З метою встановлення наявності та ступеня проліферативної активності клітин островковой частини ПЖ після введення ККМ, нами було виконано ІГХ дослідження (іммуннопероксідазний метод з АТ) з використанням маркерів реплікації ДНК, антитіла до Кь67. Використання даних ІГХ маркерів показало наявність високої проліферативної активності в серіях 8, 7, 3, 6, 1, 4 і 5; дещо менш виражену активність в підгрупі 2.

    У печінки після клітинної терапії у реципієнтів спостерігали накопичення глікогену від помірної до вираженої ступеня змісту. Результат був досягнутий за рахунок поліпшення білкового і вуглеводного обмінів в печінці. В експериментальних групах (серії 8, 7, 6, 3 і 4, 5) ознаки жирової дистрофії гепато-цитов були відсутні і спостерігалося гарне накопичення глікогену Гепатоцит-тами всіх відділів часточок.

    У тканині селезінки під дією алло-і ізогенних ККМ формуються великі лімфоїдні фолікули, спостерігається інтенсивна бластотрансформаціі лімфоїдних клітин в

    селезінці, що свідчить про відновлення структури селезінки, як імуно-компітентного органу і відновленні її иммунорегуляторной активності, що підтвердило морфометричне дослідження і маса кіс була значно достовірно вище (в 2-6 рази) в серіях 8, 7, 6 і 3, і менш виражена в серії 2.

    У нирках у всіх експериментальних серіях після клітинної терапії спостерігали зниження ступеня вираженості дистрофічних змін епітелію дистальних і проксимальних канальців, зникнення еозинофільних мас в просвіті канальців, що було пов'язано з нормалізацією вуглеводного і жирового обмінів.

    В ході експериментальної роботи була проведена оцінка введених алло-генних ККМ з геном зеленого білка, яка показала, що на 66 і 120 добу по-

    сле введення ККМ в організмі вони не гинуть, а зберігають свою життєдіяльність, мігруючи в різні органи, в тому числі в ПЖ і селезінку, стимулюючи участь цих органів у ауторегенераціі.

    висновки

    В результаті експериментів було доведено, що стовбурові і прогеніторні ККМ виконують не замісну, а біорегуляторних функцію. У зв'язку з цим більш ефективним є застосування ККМ на ранній стадії розвитку захворювання.

    При введенні ККМ на етапі виражених клінічних проявів СД терапевтичний ефект не настільки різко виражений і ступінь його залежить від стадії деструктивних процесів в організмі і зберігся рівня адаптаційних резервів.

    Alternative models of stem cells transplantation with a diabetes 2 types at various terms of disease

    O.I.Stepanova, N.N.Karkischenko, N.A.Onishenko, O.V.Baranova

    On homozygous mutant С57BL / KsYJLeprib / mice possibilities of correction of a carbohydrate exchange, metabolic and immunology infringements with allogeneic and isogena stem cells of hemopoetic and stromal fractions are studied. Experience was spent at the first and second stages of disease. As a result of experiments it has been proved that stem and progenitor stem cells carry out not replaceable, but biologically regulator function.

    Key words: diabetes, С57BL / KsYJLeprtlb / + mice, stem cells.


    Ключові слова: ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ / миші лінії С57BL / KsYJLeprdb / + / стовбурові клітини

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити