Серйозну небезпеку в трансфузіології становлять особи з латентним гепатитом В. Дослідження крові донорів тільки на поверхневий антиген вірусу HBV HBsAg не може забезпечити повну інфекційну безпеку крові, наслідком чого може бути посттрансфузійні передача інфекції. Це пояснюється тим, що вірус присутній в організмі навіть при негативному HBsAg. В роботі проаналізовані дані 59110 донорів КУ "Станція переливання крові" г.Сургут, отримані в 20162018гг.Аналізіровалі результати тестування на HBsAg (методом імуноферментного аналізу) І визначення ДНК вірусу HBV в крові (методом полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі"). Встановлено, що донори з латентним гепатитом В виявляються щорічно, хоча і спостерігається тенденція до зниження їх числа. Для запобігання поширенню вірусу HBV рекомендується ввести в стандарт діагностики HBV-інфекції спільне використання методів ІФА і ПЛР, що дозволить удосконалити лабораторну діагностику латентної форми HBV інфекції при проведенні скринінгу донорської крові.

Анотація наукової статті по ветеринарним наук, автор наукової роботи - Вальчугова Лілія Михайлівна, Вальчугова Юлія Сергіївна, Ямпільська Тетяна Данилівна


The relevance of the use of molecular biological methods (PCR) for the detection of hepatitis B virus DNA in seronegative donor blood with parallel ELISA screening for HBsAg. Persons with latent hepatitis B pose a serious danger in transfusiology. Examination of the blood of donors only for the surface antigen of the virus (hepatitis B virus, HBV) HBsAg can not ensure complete infectious blood safety, which can result in post-transfusion infection. This is due to the fact that the virus is present in the body even with negative HBsAg. The paper analyzes the data of 59110 donors from the KU "Blood transfusion station" in Surgut, obtained in 2016-2018. Analyzed the results of testing for HBsAg (enzyme-linked immunosorbent assay) and the determination of virus DNA in the blood (by the method of polymerase chain reaction in "real time"). It was established that donors with latent hepatitis B are detected annually, although there is a tendency to a decrease in their number. To prevent the spread of the HBV virus, it is recommended that the joint use of ELISA and PCR methods be introduced into the standard for diagnosing HBV infection, which will improve the laboratory diagnosis of latent HBV infection when screening for donor blood.


Область наук:
  • ветеринарні науки
  • Рік видавництва: 2019
    Журнал: Євразійський Союз Вчених

    Наукова стаття на тему 'АКТУАЛЬНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ молекулярно-БІОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ (ПЛР) ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В У серонегативном ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ ПРИ ПАРАЛЕЛЬНОМУ ІФА-скринінгу на HBSAG'

    Текст наукової роботи на тему «АКТУАЛЬНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ молекулярно-БІОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ (ПЛР) ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В У серонегативном ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ ПРИ ПАРАЛЕЛЬНОМУ ІФА-скринінгу на HBSAG»

    ?БІОЛОГІЧНІ НАУКИ

    АКТУАЛЬНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ молекулярно-БІОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ (ПЛР) ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ВІРУСУ ГЕПАТИТУ В У серонегативном ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ ПРИ ПАРАЛЕЛЬНОМУ ІФА-скринінгу на ІБ8АО

    Вальчугова Лілія Михайлівна, Вальчугова Юлія Сергіївна, Ямпільська Тетяна Данилівна

    Лікар КЛДвисшей категорії ЛІіМБІКУ «Станція переливання крові» г.Сургут;

    студент, Сургутський державний університет;

    Кандидат біологічних наук, доцент, Сургутський державний університет.

    DOI: 10.31618 / ESU.2413-9335.2019.5.60.4-6

    АНОТАЦІЯ

    Серйозну небезпеку в трансфузіології становлять особи з латентним гепатитом В. Дослідження крові донорів тільки на поверхневий антиген вірусу HBV - HBsAg не може забезпечити повну інфекційну безпеку крові, наслідком чого може бути посттрансфузійні передача інфекції. Це пояснюється тим, що вірус присутній в організмі навіть при негативному HBsAg. В роботі проаналізовані дані 59110 донорів КУ "Станція переливання крові" г.Сургут, отримані в 2016-2018гг.Аналізіровалі результати тестування на HBsAg (методом імуноферментного аналізу) і визначення ДНК вірусу HBV в крові (методом полімеразної ланцюгової реакції в «реальному часі») . Встановлено, що донори з латентним гепатитом В виявляються щорічно, хоча і спостерігається тенденція до зниження їх числа. Для запобігання поширенню вірусу HBV рекомендується ввести в стандарт діагностики HBV-інфекції спільне використання методів ІФА і ПЛР, що дозволить удосконалити лабораторну діагностику латентної форми HBV інфекції при проведенні скринінгу донорської крові.

    ABSTRACT

    The relevance of the use of molecular biological methods (PCR) for the detection of hepatitis B virus DNA in seronegative donor blood with parallel ELISA screening for HBsAg. Persons with latent hepatitis B pose a serious danger in transfusiology. Examination of the blood of donors only for the surface antigen of the virus (hepatitis B virus, HBV) HBsAg can not ensure complete infectious blood safety, which can result in post-transfusion infection. This is due to the fact that the virus is present in the body even with negative HBsAg. The paper analyzes the data of 59110 donors from the KU "Blood transfusion station" in Surgut, obtained in 2016-2018. Analyzed the results of testing for HBsAg (enzyme-linked immunosorbent assay) and the determination of virus DNA in the blood (by the method of polymerase chain reaction in "real time"). It was established that donors with latent hepatitis B are detected annually, although there is a tendency to a decrease in their number. To prevent the spread of the HBV virus, it is recommended that the joint use of ELISA and PCR methods be introduced into the standard for diagnosing HBV infection, which will improve the laboratory diagnosis of latent HBV infection when screening for donor blood.

    Ключові слова: лабораторна діагностика, вірусний гепатит В, імуноферментний аналіз, по-лімеразная ланцюгова реакція, маркери інфекції, донорська кров

    Keywords: laboratory diagnosis of viral hepatitis, enzyme immunoassay, polymerase chain reaction, markers of infection, donor blood.

    Вступ

    Переливання донорської крові залишається одним з провідних варіантів передачі гемотрансміссів-них інфекцій (ГТВ), найбільш небезпечними з яких є вірусні гепатити [1, с.47,3с.5]. Незважаючи на застосування в Службі крові високочутливих і специфічних методів тестування донорів, в більшості випадків дозволяють забезпечити безпеку гемотрансфузій, залишається ризик інфікування реципієнта при використанні компонентів крові від донорів, що знаходяться в періоді серонегативного вікна. У зв'язку з цим забезпечення інфекційної безпеки донорської крові є одним з найактуальніших і важливих питань в лабораторній практиці, в тому числі ситуація пов'язана зі своєчасною і точною лабораторної виявленням маркерів латентної форми вірусу гепатиту В [3с.6,4с.33-34].

    В даний час скринінгові лабораторії Служби крові проводять дослідження зразків донорської крові на маркери вірусного гепатиту В (ВГВ) серологічними методами: іммунофер-цементних (ІФА) або іммунохемілюмінісцент-ним (ІХЛА) аналізом, що дозволяють визначати наявність в них поверхневого антигену ВГВ (HBsAg), що дозволило значно знизити ризик посттрансфузійної передачі ВГВ.

    HBsAg в більшості випадків є найбільш значущим серологічним маркером гострого і хронічного ВГВ, виявлення якого в крові свідчить з високим ступенем ймовірності про присутність в ній вірусу [8с.260,10с.29-30]. Разом з тим зустрічалися випадки посттрансфузійного зараження ВГВ реципієнтів компонентами крові при негативних результатах серологічного

    Євразійський Союз Вчених (ЕСУ) # 3 (60), 2019 тестування. Наприклад, існування «мовчить» - латентної форми гепатиту В, яка характеризується низькою концентрацією вірусу в крові при недетектіруемом рівні HBsAg, або наявність так званих «вислизають» мутантів HBsAg може привести до випадків зараження ВГВ при переливанні HBsAg-негативної крові [1с.48,2с .12]. Виявлення «мовчить» форми ВГВ, яка характеризується наявністю низьких концентрацій вірусу, грунтується головним чином на застосуванні високочутливого методу ПЛР для визначення вірусної ДНК [4с.33,5с.21-22].

    Мета роботи: Оцінка доцільності та ефективності тестування донорів крові шляхом застосування комплексу лабораторних технологій

    (Серологічних, ПЛР). Ефективність виявлення ДНК ВГВ при негативному ІФА скринінгу на HbsAg.

    У зв'язку з цим поставлені наступні завдання:

    1.Изучить частоту виявлення ПЛР-методом донорів, що знаходяться в періоді «серологічного вікна» гепатиту В ( «мовчить» формою гепатиту В).

    2. Провести порівняльний моніторинг виявлення ДНК HBV-позитивних HBsAg-отрица-них донорів за три роки 2016-2018гг. на базі СВК р Сургута.

    3.Доказать актуальність застосування молекулами-лярно- біологічних методів (ПЛР) для виявлення ДНК вірусу гепатиту В в серонегативной донорської крові при паралельному ІФА-скринінгу на HbsAg

    4. Провести оптимізацію лабораторного процесу та оцінити її вплив на якість роботи.

    Матеріали і методи роботи

    Зразки плазми крові донорів, отримані з відділу заготівлі компонентів крові СПК г.Сургут забирали в 2 пробірки: одну пробірку з розділовим гелем для отримання сироватки для серологічних досліджень і другу пробірку з ЕДТА для отримання плазми для ПЦР.Скрінінг донорських сироваток на серологічні маркери ВГВ проводили методом ІФА на апараті i-Mark (компанія Biorad, США).

    Для виявлення HBsAg методом ІФА використовували тест-системи HBsAg-ІФА-БЕСТ Набір реагентів для імуноферментного виявлення HBs-антигену вірусу гепатиту В.Чувствітельность: 0,01 МО / мл (нг / мл) і HBsAg-який підтверджує-ІФА-

    БЕСТ Набір реагентів для імуноферментного підтвердження присутності HBs-антигену вірусу гепатиту В.) Чутливість: 0,01 МО / мл (нг / мл) .Образци, що показали при первинному дослідженні в ІФА позитивний результат на HBsAg, відбирали для повторного дослідження в тих же тест -Система і підтверджують те-стах [2с.10,6с.155].

    Все серонегативні зразки досліджували методом ПЛР на наявність ДНК HBV. ПЛР-дослідження виконували в пулах з 6 зразків на аналізаторі Cobas s201 ( "Roche" Швейцарія) з використанням мультиплексних тест-систем CobasTagScreen в режимі реального ча-мени [4с.33,5с.22].

    Інструментальний комплекс Cobas 201 (Roche. Швейцарія), включає піпетують робочу станцію, апарат для автоматичного виділення нуклеїнових кислот CobasAmpliprep і аналізатор CobasTaqman для автоматичного проведення ампліфікації і детектування нуклеїнових кислот з використанням 5 нуклеазного тих-нології [10с29-30]. Багатоканальні оптичні системи приладу дозволяють реєструвати флуоресцентний сигнал від досліджуваного зразка в кожному циклі ПЛР [9с.202]. Для ПЛР-аналізу се-ронегатівних зразків використовували мультиплексні тест-системи CobasTaqScreen MPX Test v2, розроблені компанією Roche спеціально для скринінгу донорської крові з дотриманням наступних правил [8с255-256]. Зразки плазми з негативними результатами ІФА тестів об'єднуються в мініпули (6 зразків) і перевіряються на наявність ДНК ВГВ. Перше молекулярно-біологи-чеський дослідження проводиться у одиничної постановці кожного мініпула. При отриманні позитивного результату дослідження повторюють 2 рази зі збереженням умов першої постановки, включаючи реагенти. У разі виявлення хоча б одного позитивної відповіді при повторному тестуванні зразки аналізуються індивіду-ально [2с.9-10,4с.33-34]

    При отриманні позитивного результату даний зразок донорської крові перевіряється повторно і при відтворенні результату визнається позитивним на наявність ВГВ, незважаючи на наявний у нього негативний результат ІФА [4с.34]. Результати дослідження представлені в таблиці 1.

    Таблиця 1. Результати дослідження серонегатівних зразків донорської крові методом ПЛР на кому-

    плексите Cobas S 201

    Роки проведення досліджень Кількість зразків донорської крові "се-ронегатівних" в ІФА по HBsAg Кількість досліджень зразків донорської крові методом ПЛР Кількість позитивних результатів в дискримінаційне тесті на ДНК HBV

    2016 16580 16580 2

    2017 22208 22208 3

    2018 20322 20322 2

    Разом 59110 59110 7

    результати

    Детекція-ідентифікація вірусу гепатиту В:

    При дослідженні протягом 2016-2018гг. 59110серонегатівних зразків донорської плазми на наявність вірусної ДНК HBV на апаратному комплексі Cobas 201 за допомогою тест-систем CobasTagScreen МРХ v2 в 7 випадках було зареєстровано наростання флуоресцентного сигналу, що свідчить про наявність в зразку вірусної ДНК HBV, таким чином було виявлено 7 позитивних зразків донорської крові на наявність ВГВ (табл. 1). Виявлення ВГВ за трирічний період методом ПЛР (0,02-0,02- 0,01%) залишається на колишньому рівні, тобто невисокою, так як основна частина донаций крові береться у кадрових, багаторазово обстежених донорів, і в той же час виявлення семи інфікованих зразків донорської крові запобігло серйозну небезпеку зараження можливих реципієнтів вірусом гепатиту В [5с21,7с.83].

    висновки

    1.На фактичному матеріалі, ми встановили, що методом ПЛР з 59110 зразків донорської плазми, що показали негативний результат в серологічних тестах, виявлено 7 зразків (0,012%), що містять ДНК HBV. Подібна картина може спостерігатися як при ранній інфекції (період серонегативного вікна), так і при хронічному ВГВ у осіб з пригніченою імунною-те [1с.48,6с.159]. Вважається, що негативні результати при детекції HBsAg у хворих на ВГВ можуть бути викликані низьким рівнем HBsAg, утворенням імунних комплексів, а також мутаціями вірусу. [10] Встановлено, що серологічні тести (ІФА) не можуть забезпечити 100% виявлення інфікованих донорів, оскільки в їх крові в період так званого «серонегативного вікна» дані маркери інфекцій відсутність про-обхідних [2с.12,4с.33].

    2.Сократіть серонегативном вікно для гепатиту В в 1,5 рази і значно знизити ризик передачі збудників цих інфекцій через донорську кров та її препарати дозволяє тестування дона-ций з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Таким чином, на підставі отриманих результатів можна зробити висновок, що скринінг зразків донорської крові із застосуванням ПЛР-тестування для виявлення вірусної ДНК ВГВ дозволить знизити ризик посттрансфузійної передачі вірусного гепатиту В, за рахунок виявлення інфікованих донорів, що знаходяться в періоді се-ронегатівного вікна і донорів з мовчить формою інфекції.

    3. Визначено доцільність застосування ПЛР-методів для обстеження всіх категорій до-норов [2с.9]. Показана необхідність обов'язкового застосування ПЛР - тестування зразків крові всіх категорій донорів для підвищення інфекційної безпеки гемокомпонентной тера-ПІІ [5с.22]. Алгоритм апробації донорської крові, при якому скринінг зразків методом ПЛР проводять одночасно з дослідженням їх в серологічних тестах, дозволить підвищити інфекційну безпеку гемопродукціі. Показано, що оптимізація лабораторного процесу підвищує якість аналітичного етапу лабораторних досліджень. Для підвищення продуктивності і поліпшення якості роботи лабораторії необхідно регулярне проведення оптимізації лабораторного процесу за допомогою застосування нових лабораторних технологій, використання нових інформаційних програм [5с22].

    література

    1. Амплеева Н.П. Актуальні аспекти вірусного гепатиту В // Н.П. Амплеева, Ю.Г. Ускова,

    B.Ф. Павелкіна, Д.І. Базаркін, Р.З. Альмяшева // Сучасні проблеми науки та освіти. -2015. - т. 7, № 2. - С 47-53с47-48)

    2. Белякова, В.В. Генотестірованіе донорів на ГЕМОТРАНСМІССИВНИХ інфекції / В.В. Белякова, І.А. Гукасян, К.С. Момотюк, О.А. Майорова, О.Е. Кузнецов, Н.Г. Дашкова, А.А. Рагімов // Вісник служби крові Росії. - 2012. - №1. - С 9-12

    3. ГолосоваТ.В. ГЕМОТРАНСМІССИВНИХ інфекції / Т.В. Голосова, Нікітін І.К. - М.: Медичне інформаційне агентство, 2003.- 191 с

    4. Дуданова, О.П. Діагностика хронічних гепатитів / О.П. Дуданова. - Вид-во ПетрГУ 2010.

    - 128 С

    5. Карякін, А.В. Моніторинг безпеки донорського контингенту Росії / А.В. Карякін, Е.Д. Скоцеляс, Л.А. Терентьєва // Актуальні питання гематології та трансфузіології. - 2007. - №1. - С 21-22

    6. Тетова, В.Б. Ведення вірусного гепатиту В у гематологічних пацієнтів / В.Б. Тетова, Н.М. Бєляєва, М. Ю. Кесаєва М.Ю // Практична медицина. - 2012. - №5. - С 155-159

    7. Allain, J.P. Occult hepatitis В virus infection: implication in transfusion / J.P.Allain. // Vox Sang, 2004. - .№ 2, P 83-91

    8. Busch, M.P A new strategy for estimating risk of transfusion-transmitted viral infections based on rates of detection of resently infected donors / M.P. Busch, S.A. Glynn, S.L. Strainer // Transfusion, 2004.

    - №2, P 254-264

    9. Gutierrez, C .Molecular and serological evaluation of surface antigen negative hepatitis В virus infection in blood from Venezuela / C. Gutierrez, M. Devesa,

    C.L. Loureiro // J.Med.Virol, 2004. - №2. - P 200-207

    10. Herman, S. Performance characteristics of a new multiplex NAT screening test for HBV, HCV and HIV. The Cobas TagScreen MRX Test on the COBAS S 201 system / S .Herman, Y. Ohhashi, E. Kyger // Vox Sang, 2007. - Vol.91. - P 29-48


    Ключові слова: ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА /Вірусний гепатит В /ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ /ПОЛІМЕРАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ /МАРКЕРИ ІНФЕКЦІЇ /донорської крові /LABORATORY DIAGNOSIS OF VIRAL HEPATITIS /ENZYME IMMUNOASSAY /POLYMERASE CHAIN ​​REACTION /MARKERS OF INFECTION /DONOR BLOOD

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити