У даній роботі проводиться аналіз літературних і власних результатів досліджень в області клітинної терапії міокарда. Сформульовано основні невирішені питання цієї області регенеративної медицини.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Гольдштейн Дмитро Вадимович, Фатхудинов Тимур Хайсамудіновіч


Actual Problems of Cell Therapy for Cardiac Diseases

This article reviews the literatury and own dates of cell therapy for cardiac diseases. The principal unresolved issues were formulated.


Область наук:
  • Біотехнології в медицині
  • Рік видавництва діє до: 2012
    Журнал: Вісник Російської академії медичних наук

    Наукова стаття на тему «Актуальні питання клітинної терапії міокарда '

    Текст наукової роботи на тему «Актуальні питання клітинної терапії міокарда»

    ?Д.В. Гольдштейн13, Т.Х. Фатхудінов23

    1 ФГБУ "Медико-генетичний науковий центр" РАМН, Москва

    2 ФГБУ "НДІ морфології людини" РАМН, Москва 3 ЗАТ «РеМеТекс», Москва

    Актуальні питання клітинної терапії міокарда

    У даній роботі проводиться аналіз літературних і власних результатів досліджень в галузі клітинної терапії міокарда. Сформульовано основні невирішені питання цієї області регенеративної медицини.

    Ключові слова: клітинна терапія, захворювання серця, репаративна регенерація.

    В кінці XX століття завдяки розвитку молекулярної і клітинної біології були розроблені методики селективного ізолювання і культивування стовбурових / прогеніторних клітин, а в 1998 р Джеймс Томпсон отримав першу лінію ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) з бластоцисти [1]. Все це створило передумови для проведення численних експериментальних робіт з вивчення властивостей отриманих in vitro клітин.

    16 У фундаментальній біології та медицині з'явилися нові напрямки досліджень по вивченню ролі ство-лових / прогеніторних клітин в процесах росту, розвитку, репаративної регенерації і при розвитку пухлин. В даний час технічні можливості дозволяють в лабораторних умовах виділяти, нарощувати і модифікувати стовбурові / прогеніторні клітини з найрізноманітніших джерел. Широкий розвиток досліджень щодо застосування клітин для лікування багатьох захворювань відкрило нову главу в медичній науці, яку називають регенеративної медициною.

    Одним з найбільш активно розвиваються напрямків регенеративної медицини є клітинна терапія міокарда. Актуальність вивчення репарації міокарда і методів, спрямованих на її стимуляцію, обумовлені вкрай високою поширеністю і летальністю від серцево-судинних захворювань [2]. Незважаючи на досягнення в профілактиці і лікуванні серцево-судинних захворювань, можливості терапевтичного та хірургічного лікування такого їх найбільш частого ускладнення, як хронічної серцевої недостатності (ХСН), до теперішнього часу вичерпані [3]. Єдиним ефективним методом лікування важкої ХСН вважають трансплантацію серця, однак внаслідок дефіциту донорських органів цю проблему вирішити неможливо [4]. Як «моста» до трансплантації серця (або навіть альтернативи) багатьма дослідниками була

    запропонована клітинна терапія міокарда [5]. Технології застосування клітинної терапії в кардіології розробляють вже протягом 15 років. Накопичено достатньо експериментальних і клінічних даних, проте в цій галузі регенеративної медицини як і раніше залишаються невирішеними багато питань, які ми спробуємо сформулювати в даній роботі.

    Сучасний стан досліджень

    На сьогоднішній день вже не виникає сумнівів в тому, що відновлювальні процеси в міокарді відбуваються не тільки за рахунок утворення рубця і гіпертрофії збережених кардіоміоцитів (КМЦ), але і за рахунок проліферації резидентних і екзогенних (внесердечних) клітин-попередників [6]. До саморозміщувані клітинам відносять самі КМЦ, які в певних умовах здатні до обмеженою проліферації. Ще П.П. Румянцев показав, що КМЦ не є термінально диференційованими клітинами [7]. Було неодноразово доведено, що після пошкодження міокарда збільшується число дисоційованому КМЦ, виявляються ознаки синтезу ДНК, робочі КМЦ позитивно фарбуються моноклональними антитілами (МАТ) до маркерів проліферації (Ю67), і, можливо, відбувається дедифференцировка КМЦ, після чого вони вступають в мітоз [8 ]. Всі ці дані демонструють можливість робочих КМЦ пролиферировать і брати участь в репарації міокарда.

    Крім того, останнім часом активно обговорюється гіпотеза існування камбіальних (стовбурових) клітин серця. Так, групою вчених під керівництвом Р. Anversa [6] в верхівці і предсердиях серця були виявлені так звані ніші, в яких дослідники виявили скупчення дрібних округлих клітин, що експресують-

    Goldshtein D.V.1,3, Fatkhudinov T.Kh.23

    1 Research Center for Medical Genetics RAMS, Moscow

    2 Institute of Human Morphology RAMS, Moscow

    3 Remetex Close Corporation, Moscow

    Actual Problems of Cell Therapy for Cardiac Diseases

    This article reviews the literatury and own dates of cell therapy for cardiac diseases. The principal unresolved issues were formulated. Key words: cell therapy; cardiac diseases; reparative regeneration.

    чих маркери недиференційованих клітин (c-kit), транскрипційні фактори ранніх кардіоміобла-стов (GATA4, MEF2C) і одночасно білки, характерні для зрілих КМЦ (connexin43, a-sarcomeric actin). Грунтуючись на комбінації дифференцировочного маркерів, вчені припустили, що ці клітини є стовбуровими клітинами серця. Однак після цього не було робіт, прямо демонструють можливість цих стовбурових клітин серця диференціюватися в робочі КМЦ і клітини кровоносних судин в умовах пошкодження міокарда.

    Але, навіть якщо враховувати наявність камбію в серце, система репаративної регенерації серця є неспроможною і не забезпечує органотіпіческой регенерації. Еволюційно склався додатковий механізм репарації міокарда, а саме участь у цьому процесі екзогенних внесердечних клітин-попередників КМЦ. Давно було відмічено, що при різностатевої трансплантації червоного кісткового мозку при гемобла-стозах відбувається хімерізація міокарда [9]. Тоді на аутопсії в серці реципієнта жіночої статі виявлялися КМЦ з Y-хромосомою. Це дозволило припустити, що клітини червоного кісткового мозку після загибелі КМЦ мігрують в область пошкодження, диференціюються в КМЦ і забезпечують заміщення загиблих скорочувальних елементів. Хімерізацію при трансплантації кісткового мозку спостерігали не тільки в тканинах серця, а й печінки, нирок і ін. Органах [10]. Таким чином, концепція клітинної терапії грунтується на припущенні про диференціювання екзогенних клітин-попередників в спеціалізовані клітини пошкодженої тканини.

    Завдяки розвитку цієї концепції стали з'являтися тисячі наукових публікацій, присвячених трансплантації клітин самих різних фенотипів для заміщення загиблих КМЦ. Останнім часом інтенсивність експериментальних і клінічних досліджень в нашій країні і за кордоном в галузі клітинної терапії міокарда не тільки не знизилася, але і продовжує наростати, що свідчить про актуальність і перспективність цього напрямку. Можна виділити дві основні нозологічні форми, щодо яких проводиться більшість експериментальних і клінічних досліджень з клітинної терапії: гострий інфаркт міокарда (ГІМ) і хронічна серцева недостатність (ХСН). При першій-ліпшій нагоді ураження серця метою трансплантації клітин є стимуляція утворення нових кровоносних судин і відновлення скорочувальних елементів серця.

    В даний час в лабораторних умовах отримати КМЦ і клітини кровоносних судин не складно. Їх можна виділити з тканин, вже містять ці клітини, наприклад з фетального серця [11], або предіфферен-царювати з клітин-попередників червоного кісткового мозку. Існують відпрацьовані протоколи, що дозволяють отримувати in vitro КМЦ з гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) і з мультіпотентних стромальних клітин (МСК) [12]. Однак це зовсім не означає, що ці ж клітини in situ також будуть диференціюватися в КМЦ, ендотелій і т.п. під дією місцевого микроокружения.

    Дані, отримані в численних експериментальних дослідженнях на лабораторних тваринах, продемонстрували високу ефективність трансплантації клітин, що виражалося в зменшенні розміру інфаркту або рубця, гіпертрофії перифокального міокарда, зворотному ремоделировании лівого шлуночка (ЛШ), збільшенні кількості і об'ємної щільності кровоносних судин в області пошкодження [13 ]. Все це призводило

    до поліпшення локальної та глобальної скоротливості ЛШ, збільшення фракції викиду і функції серця в цілому.

    У ранніх публікаціях за допомогою різних методів вітального маркування клітин дослідники отримували підтвердження кардіоміогенеза і ангіогенезу за участю трансплантованих клітин [14]. Пізніше стали з'являтися публікації, в яких не виявляли утворення нових КМЦ з трансплантованих клітин, а поліпшення скорочувальної функції міокарда ЛШ виявилося більш ніж помірним [15-17]. Однак при аналізі суперечливих результатів експериментальних досліджень необхідно враховувати, що найчастіше в них не застосовували єдині підходи в отриманні клітин, виборі термінів і способів введення клітин і методів верифікації результатів. Так чи інакше, проведені експериментальні дослідження послужили підставою для початку клінічних випробувань трансплантації клітин.

    Клінічні дослідження дозволили більш об'єктивно оцінити результати клітинної терапії міокарда.

    Головне, що вдалося продемонструвати в результаті численних клінічних досліджень - це безпека технологій. Стало ясно, що трансплантація клітин не приводить до клінічно вираженим імунологічні реакцій, Ектопічні остеогенезу, утворення пухлин, тромбоемболічним і токсичних ускладнень [18]. Однак щодо ефективності 17 клітинної терапії міокарда в літературі можна знайти неоднозначні результати. У переважній більшості досліджень автори стверджують, що трансплантація клітин достовірно ефективна, але при розгляді динаміки конкретних показників серцевої діяльності виявляється, що змінюються вони досить помірковано.

    Так, фракція викиду (ФВ) після введення клітин при ГІМ і ХСН змінюється в межах 5 - 15% [19]. Все ж потрібно враховувати, що динаміка ехокардіографічних показників не завжди корелює з суб'єктивними показниками клінічного стану хворого, таких як толерантність до фізичних навантажень, індекси якості життя (DASI) і ін. [20]. Тому необхідний пошук більш специфічних і чутливих методів обстеження і обов'язкове виключення плацебо-ефекту.

    Зараз стало ясно, що клітинна терапія не є радикальним методом лікування, що призводить до позбавлення від важких захворювань серця, але в складі комплексного лікування може служити мостом до хірургічної операції і трансплантації серця. Це особливо актуально для хворих, у яких медикаментозне лікування неефективне, а хірургічні операції їм не показані в зв'язку з тяжкістю їх стану. Трансплантація клітин у складі комплексного лікування може істотно поліпшити результати терапії та забезпечити підготовку пацієнта до оперативного втручання або поліпшити результати хірургічного лікування [20].

    Проте, залишається невирішеним цілий ряд питань, які ми детально обговоримо нижче.

    Які клітини трансплантувати?

    З метою стимуляції ангіогенезу і репарації міокарда застосовують найрізноманітніші варіанти клітинних трансплантатів. На самому початку розвитку даного напрямку проводили дослідження, в яких вивчали вплив трансплантації навіть шкірних фибро-бластів [21] на відновлювальні процеси в серці. Фетальні КМЦ трансплантували в багатьох експериментальних та клінічних дослідженнях і підлозі-

    чали позитивні результати. Ці клітини добре пролиферируют в культурі і володіють усіма необхідними для КМЦ властивостями, в тому числі електромеханічними. Вони ефективно приживаються, формують щілинні контакти з КМЦ господаря і забезпечують поліпшення скорочувальної функції міокарда [11]. Однак, з огляду на їх алогенних походження, не можна виключити елімінацію цих клітин імунною системою. Крім того, існують етичні обмеження, що перешкоджають використанню фетального матеріалу.

    Пізніше великі надії покладали на скелетні міобласти, які можна виділити і наростити в необхідній кількості з м'язової тканини самого хворого. Але суттєві відмінності між електромеханічними властивостями міобластів і КМЦ призводило до формування аритмій і десинхронизации функціонального синцития серця. Проведені клінічні дослідження не продемонстрували значну ефективність застосування скелетних міобластів [22].

    В даний час в якості основного джерела отримання матеріалу для клітинної терапії міокарда використовують червоний кістковий мозок, який служить джерелом екзогенних стовбурових / прогеніторних клітин, які беруть участь у репарації міокарда 18 і ангіогенез. У більшості проведених клінічних досліджень застосовували нефракціоновані моно-Нуклеар кісткового мозку, так як методика їх отримання давно відпрацьована, є простий, не вимагає спеціальних умов, обладнання та, що найголовніше, часу для експансії [23]. Однак ядерні клітини кісткового мозку, в основному представлені клітинами крові на різних стадіях дозрівання, фібробла-стами, остеобластами, адипоцитами, і лише в незначній кількості присутні ГСК (1-3%) і МСК (0,01-0,05%). Якщо навіть сподіватися на кардіоміогенез при трансплантації нефракціонованих мононуклеарних клітин (МНК), то можна розраховувати тільки на активність популяцій незрілих клітин, які присутні в трансплантаті в зовсім незначних кількостях.

    Більшість клінічних випробувань було проведено з використанням саме мононуклеарних клітин кісткового мозку. Метааналіз проведених клінічних досліджень дозволяє говорити про клінічної безпеки трансплантації МНК кісткового мозку, але фракція викиду як інтегральний показник функції серця при цьому збільшується не більше ніж на 5-10%. Так, найбільш освітлені випробування BOOST [24] і TOPCARE-AMI [25] продемонстрували, що в результаті інтракоронарне трансплантації аутогенних МНК кісткового мозку через 5 днів після ГІМ поліпшується кровопостачання міокарда на мікроциркуляторному рівні і не розвиваються будь-які серйозні ускладнення, однак фракція викиду збільшується незначно.

    На нашу думку, однією з причин виявлення помірної клінічної ефективності трансплантації клітин кісткового мозку є вибір клітинного трансплантата. Застосування МСК для клітинної терапії ми вважаємо більш перспективним, так як ці клітини можна ефективно ізолювати і нарощувати в великій кількості. Їх проліферативні властивості і пластичність повинні забезпечити більш ефективні приживляемость і стимуляцію репарації міокарда. У проведеному нами експериментальному дослідженні при інтракоронарне введенні МСК при постінфарктний кардіосклероз спостерігалася виражена стимуляція ангіогенезу і ріпа-

    ратівних процесів міокарда, що виявлялося в зменшенні розмірів рубця, утолщении і зміцненні його стінки, гіпертрофії перифокального міокарда, зменшення дилатації порожнини ЛШ. При трансплантації нефракціонованих МНК було виявлено збільшення розмірів рубця, дилатація порожнин, але при цьому також збільшувалися товщина стінки рубця і періфокаль-ного міокарда, кількість і об'ємна щільність кровоносних судин (рис. 1) [17]. Таким чином, згідно з нашими даними, більш кращою є трансплантація МСК у порівнянні з МНК кісткового мозку.

    Яким повинен бути спосіб трансплантації клітин?

    Існують два основних способи введення клітин в серці: інтракоронарне і інтраміокардіальний. Крім того, можна знайти роботи, в яких клітини для стимуляції репарації серця вводили внутрішньовенно [26]. Дана методика на сьогоднішній день вважається неефективною, так як при такому способі введення дуже незначна частка клітин заселяє пошкоджений міокард. Безсумнівно, ефективним способом доставки клітин є їх безпосереднє введення в товщу міокарда як трансепікардіально [27] під час операції на відкритому серці, так і трансендокарді-ально за допомогою спеціальних катетерів, наприклад NOGA [28]. В останньому випадку на кінці катетера можна розташувати датчик, який дозволяє проводити електромеханічне картування міокарда і визначати оптимальні області трансплантації клітин. Однак всі варіанти інтраміокардіальной трансплантації є інвазивними, вимагають дорогого устаткування, тривалої госпіталізації і мають істотний ризик різних ускладнень. Зокрема, при введенні навіть невеликого обсягу клітинного трансплантата виникає механічне пошкодження міокарда, що може викликати аритмії. Необхідно також враховувати, що в процесі механічного пошкодження введені клітини можуть гинути.

    В даний час інтракоронарне спосіб введення клітин вважають оптимальним, так як по ефективності доставки він відповідає інтраміокардіальному, але є набагато менш інвазивних [29]. У нашому експериментальному дослідженні на моделі трансвентрікулярного інтракоронарне введення клітин через 30 діб після ГІМ було показано, що навіть при неселективних введенні в праву і ліву коронарні артерії трансплантовані мічені клітини мігрували в область пошкодження міокарда, а не розподілялися рівномірно по всіх тканинах серця [30]. Вже через добу після трансплантації мічені клітини виявляли тільки в області пошкодження серця. При цьому клітини локалізувалися в рубцевої тканини і не були виявлені в збережених ділянках некрозу і перифокальною області, що вказує на їх хомінг в зону пошкодження. Мічені клітини мали фібробластоподібних фенотип і розташовувалися між пучками колагенових волокон.

    З огляду на системний спосіб трансплантації клітин, через 1, 14 і 30 діб після трансплантації ми досліджували гістологічні препарати селезінки, печінки і легенів на наявність мічених клітин. Крім тканин серця, значну частку мічених клітин виявляли в селезінці; в печінці і легенях виявили лише поодинокі флуоресцентно мічені клітини (рис. 2).

    Як випливає з гістограми, трансплантовані МСК більш ефективно приживаються в тканинах серця.

    Розмір рубця

    Індексділатаціі

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    6 тижнів

    8 тижнів

    6 тижнів

    8 тижнів

    товщина рубця

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    6 тижнів

    8 тижнів

    Гіпертрофія перифокального міокарда * #

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    6 тижнів

    8 тижнів

    Мал. 1. Динаміка морфометричних показників ЛШ через 6 і 8 тижнів після ГІМ (через 2 і 4 тижні після інтракоронарне трансплантації у щурів).

    Примітка: * - р<0,05 при порівнянні груп; # - р<0,05 при порівнянні з попереднім терміном спостереження.

    19

    При трансплантації МНК відбувається більш виражений хомінг в селезінку, природну нішу для клітин введеного трансплантата.

    Таким чином, при інтракоронарне трансплантації клітини мігрують в область пошкодження і беруть участь у репарації міокарда. Даний спосіб доставки клітин є більш безпечним, менш дорогим, а за своєю ефективністю наближається до інтраміокардіальной трансплантації.

    На якій стадії захворювання слід трансплантувати клітини?

    З точки зору підвищення ефективності клітинної терапії важливим є питання, на якій стадії захворювання трансплантувати клітини. Вводити клітини під час ГІМ або через кілька годин після нього, на нашу думку, є недоцільним, оскільки трансплантовані клітини, опинившись в області некрозу та ішемії, будуть пошкоджені, як і КМЦ. І все ж існує думка, що така трансплантація в гостру фазу ГІМ може бути ефективна за рахунок протівоспалі-ного і імуномодулюючої ефектів стовбурових / прогеніторних клітин і забезпечить зменшення розміру інфаркту [31]. На наш погляд, обгрунтовано вводити клітини після стихання альтеративних фази запалення, тобто не раніше, ніж через 3 доби після реперфузії. На 7-у добу в області пошкодження починає формуватися грануляційна тканина, яка може забезпе-

    чить оптимальні умови для хомінг і виживання трансплантованих клітин. У тому випадку, якщо метою клітинної терапії є зменшення розміру інфаркту та поліпшення кровопостачання перифокального міокарда, оптимальним терміном трансплантації клітин є проміжок між 3-ми і 14-ми цілодобово після реперфузії.

    З 2-го по 8-й тиждень грануляційна тканина заміщується фіброзною, за цей час відбуваються процеси, що забезпечують дозрівання рубцевої тканини. Вони полягають насамперед у збільшенні щільності і товщини колагенових волокон і зменшення числа клітин

    60,0

    МНК

    МСК

    Серце Селезінка Легкі Печінка

    Мал. 2. Розподіл мічених трансплантованих МНК і МСК по органам через 30 діб після введення.

    Примітка: * - р<0,05 при порівнянні груп.

    Динаміка «клітинної» рубця

    Динаміка кількості реактивних фібробластів

    90

    80

    70

    60

    50

    40

    30

    20

    10

    0

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    6 тижнів

    8 тижнів

    6 тижнів

    8 тижнів

    20

    18

    16

    14

    12

    10

    8

    6

    4

    2

    0

    Динаміка кількості миофибробластов * #

    *

    Динаміка частки товстих пучків колагенових волокон

    #

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    6 тижнів

    8 тижнів

    6 тижнів

    ? контроль

    ? МНК

    ? МСК

    8 тижнів

    Мал. 3. Динаміка морфометричних показників рубцевої тканини через 6 і 8 тижнів після ГІМ (через 2 і 4 тижні після інтракоронарне трансплантації) у щурів.

    Примітка: * - р<0,05 при порівнянні груп; # - р<0,05 при порівнянні з попереднім терміном спостереження.

    в тканини. Отже, мішенню клітинної терапії міокарда може бути зворотне ремоделювання ЛШ. З цією метою клітини вводять через 14 діб після реперфузії і при вже давно сформованої ХСН. В цьому випадку трансплантовані клітини можуть брати участь в дозріванні та перебудові рубцевої тканини. У нашому експерименті клітини кісткового мозку трансплантували через 4 тижні після ГІМ, тобто в самий розпал фибропластическом процесів в місці пошкодження [17]. З огляду на продемонстрований хомінг, навіть на пізніх термінах в зоні пошкодження зберігається висока концентрація хемокинов, що обумовлюють міграцію клітин кісткового мозку в рубцеву тканину. Трансплантовані клітини червоного кісткового мозку (можливо, власне фібробласти або їх попередники) мігрували в рубець і виявлялися тільки там, диференціюючи в фібробласти і міофібрил-бласти. Вони проліферіровать, активно синтезували компоненти міжклітинної речовини рубцевої тканини, що призводило до потовщення і ущільнення рубцевої стінки (рис. 3).

    Раніше вважали, що через 2 місяці після ГІМ рубцева тканина остаточно сформіровивается і надалі не зазнає ніяких змін, і рубець через 10 років нічим не відрізняється від двомісячного [32]. За сучасними уявленнями, рубцева тканина не є інертною структурою, і навіть через 8 тижнів після гострого інфаркту міокарда відбувається її активна перебудова, яка триває в міру

    ремоделювання ЛШ [33]. Так, було показано, що у щурів протягом 3 місяців після інфаркту спостерігали високу концентрацію мРНК проколагену I типу. З огляду на тривалість життя людини, активний синтез колагену повинен спостерігатися у нього протягом багатьох років після ГІМ [34].

    В даний час вважають, що однією з причин патологічного ремоделювання ЛШ і розвитку серцевої недостатності після ГІМ є недостатня освіта або прогресуючі руйнування позаклітинного генового матриксу в рубці [35]. Тому зараз одним з напрямків антіремо-делірій терапії є стимуляція фибропластическом процесів в зоні інфаркту, яка забезпечує потовщення і зміцнення рубця і, таким чином, перешкоджає або уповільнює патологічне ремоделювання. Вважається, що потовщення і зміцнення стінки ЛШ в області рубця призводить до зменшення напруги в стінках всього ЛШ, що, згідно із законом Лапласа, призводить до зменшення систолічної дилатації лівого шлуночка [36].

    Трансплантацію клітин можна розглядати як один з варіантів антіремоделірующей терапії хронічної серцевої недостатності, так як навіть інтра- коронарної введені клітини мігрують тільки в рубець, диференціюються в фібробласти і міофібробласти, активно синтезують компоненти міжклітинної речовини, сприяють його впорядкованої організації і нарощування міцності рубцевої стінки.

    Які механізми стимуляції репарації при трансплантації клітин?

    Як і раніше не вирішеним залишається питання про механізми стимуляції ангіогенезу і репарації міокарда при трансплантації стовбурових / прогеніторних клітин. Активно обговорюються дві основні гіпотези: кардіоміо-генез і ангіогенез шляхом трансдіфференціровка трансплантованих клітин і стимуляція ангіогенезу і репарації за рахунок паракринной індукції [15].

    Феномен трансдіфференціровка незрілих соматичних клітин стали активно вивчати і обговорювати ще 15-20 років тому [14, 37, 38]. Ця ідея захопила уми багатьох видатних вчених перш за все тому, що ставила під сумнів традиційну концепцію походження та розвитку клітин. Вона передбачала можливість застосування стовбурових клітин для відновлення органів і тканин різного походження, утворених з тканин інших зародкових листків. Наприклад, дана концепція припускає використання гемопоетичних клітин для відновлення нервової тканини. Перші повідомлення, присвячені цій проблемі, розбурхали наукову громадськість, після чого послідувало величезне число робіт, в яких мезенхімальні попередники легко перетворювали в клітини ектодермального або ендодермального походження і навпаки. Здавалося, що кістковий мозок розглядають як джерело клітин для регенерації всіх органів. Незважаючи на застереження авторитетних вчених [39], які вказували на недоказові даних висновків і вважали за необхідне виключити феномен злиття клітин, ця концепція дуже популярна і на сьогоднішній день. Вважається, що незрілі клітини кісткового мозку, жирової тканини і взагалі всіх тканин, де є строма, можуть диференціюватися в багато клітинні типи. Все це доказово продемонстровано в умовах in vitro, розроблені протоколи, які дозволяють, наприклад, з МСК отримати різні спеціалізовані клітини [40]. Однак цього не відбувається в умовах in vivo, і з'являється все більше досліджень, в яких показано, що трансплантовані клітини не диференціюються в спеціалізовані клітини серця [15-17]. Можливо, це пов'язано не з відсутністю феномена трансдіфференціровка екзогенних клітин-попередників, а з тим, що в культурі ми отримуємо клітини з обмеженою пластичністю або з тим, що микроокружение в області пошкодження не сприяє їх диференціювання в потрібному напрямку.

    Висновки численних досліджень, в яких продемонстровано перетворення стовбурових / Прогенія-раторних клітин в спеціалізовані клітини серця, засновані на виявленні в цих клітинах дифференцировочного маркерів КМЦ, ендотелію і т.д. [6, 14]. Але при цьому необхідно розуміти, що наявність того чи іншого маркера зроблено не обумовлює факт перетворення проге-ніторной клітини, наприклад в функціонально активний робочий КМЦ. На нашу думку, обов'язковими критеріями трансдіфференціровка клітин кісткового мозку в спеціалізовані клітини повинні бути локалізація і морфологія цих клітин, які дуже часто зовсім не враховують. Крім того, при трансплантації маркованих клітин завжди складно виключити феномен злиття. Злиття клітин часто спостерігають в культурах, in vivo цей феномен достовірно встановити дуже складно, особливо для КМЦ. Крім того, неясно, як змінюється життєдіяльність і функціонування клітини після злиття [41]. Тому злиття клітин не розглядають як основний механізм терапевтичної активності клітинної терапії.

    У нашому експериментальному дослідженні [17, 30] все мічені клітини, незалежно від варіанту трансплантата, виявляли тільки в товщі рубцевої тканини. При цьому клітини розташовувалися між пучками колагенових волокон і мали веретеновидную або полігональну форму. Деякі мічені клітини позитивно забарвлювалися МАТ до маркерів реактивних фібробластів ^ ара) (рис. 4) і миофибробластов (аSMA) (рис. 5). Не було отримано даних, що демонструють можливість трансплантованих клітин диференціюватися в кардіоміоцити або в клітини судинної стінки. Відсутність флуоресцентної мітки в кардіоміо-цітах, ендотеліальних і гладком'язових клітинах кровоносних судин свідчить про те, що трансплантовані клітини не зливаються і не диференціюються в кардіоміоцити і клітини кровоносних судин.

    Диференціація трансплантованих клітин в фібробласти і міофібробласти приводила до зміцнення рубцевої стінки і зворотному ремоделированию ЛШ, особливо в разі трансплантації аутогенних МСК.

    Стимуляція ангіогенезу і гіпертрофія перифокального міокарда, мабуть, відбувалася за рахунок паракринной індукції, яку в нашому дослідженні не вивчали.

    Багато дослідників вважають індукцію репаративних процесів за рахунок паракрінних факторів, що виділяються трансплантованими клітинами, основним механізмом регуляції регенерації [15]. У культурі клітин і після транс- 21

    плантації показано, що стовбурові / прогеніторні клітини з різних джерел продукують цитокіни та фактори росту, які регулюють процеси загоєння. Одні пара-Крін чинники стимулюють ангіогенез (VEGF, АЩ I,

    FGF, PDFR і ін.), Інші пригнічують апоптоз (HGF IGF-I), треті стимулюють хомінг ^ yo1-1) і іммобілізацію клітин кісткового мозку (GM-CSF), четверті регулюють ремоделирование рубця (ММР-3 і -6), п'яті індукують гіпертрофію перифокального міокарда, а шості надають протизапальну та імуномодулюючу дію [15, 42]. При цьому трансплантовані клітини самі регулюють локалізацію, кількість і тривалість продукції паракрінних факторів в залежності від стадії відновного процесу, тобто являють собою саморегулюючу систему зі зворотним зв'язком. Можливо, що при виборі типу клітин для трансплантації необхідно враховувати, які паракрінние чинники вони виробляють, а не ґрунтуватися на теоретичну можливість їх трансдіфференціровка.

    Як верифікувати результати клінічних досліджень?

    Величезна кількість клінічних досліджень присвячено клітинної терапії міокарда, багато з яких знаходяться вже на завершальній III фазі випробувань. Однак всі вони можуть бути піддані критиці щодо розміру та репрезентативності вибірки, однорідності клінічного матеріалу, рандомізації, вибору типу клітинного трансплантата, що не дозволяє провести метааналіз отриманих даних [43]. Короткі терміни і обмежений обсяг вибірок в цих дослідженнях не дозволяють зробити висновок про ефективність будь-якої технології клітинної терапії міокарда з точки зору доказової медицини, так як в них не можна отримати дані кінцевих точок клінічної ефективності (смертність, виживаність, тривалість життя). Тому для обмежених клінічних випробувань, що носять характер пілотних досліджень, дуже важливо ретельно вибрати сурогатну точку клінічної

    22

    Г

    Мал. 4. Імуногістохімічне забарвлення МАТ до Fapa, А - рубцева тканина через 14 діб після введення МСК; Б - рубцева тканина через 14 діб в контрольній групі, чорні стрілки - реактивні фібробласти; В і Г - контроль без первинних МАТ; світлова мікроскопія, об. 40.

    А

    Мал. 5. Імуногістохімічне забарвлення МАТ до а ^ МА. А - рубцева тканина через 14 діб після введення МСК, чорні стрілки - міофібробласти; Б - контроль без первинних МАТ, світлова мікроскопія, об. 40.

    ефективності, яка повинна найбільш сильно корелювати з реальними кінцевими точками [44].

    У переважній більшості клінічних досліджень клітинної терапії міокарда в якості таких сурогатних точок використовують ехокардіографічні показники

    стану і роботи серця (фракція викиду, кінцевий діастолічний і систолічний об'єми) [22, 23, 24]. Однак дані показники в результаті клітинної терапії змінюються несуттєво [22], іноді їх зміни можна вважати методичною похибкою, що може свідок-

    відати або про неефективність лікування, або про неправильний вибір сурогатних точок.

    У клінічному дослідженні ефективності інтра- коронарної трансплантації алогенних МСК, проведеному нами на базі Російського наукового центру хірургії ім. акад. Б.В. Петровського, у 27 хворих з дила-ційної кардіоміопатією фракція викиду зросла з 20,5 ± 1,6 до 26,4 + 5,9% (p>0,05). Разом з тим інші діагностичні методи, до яких відносяться рівень мозкового натрійуретичного пептиду (BNP) в плазмі крові, 6-хвилинний тест, пікове споживання кисню, показники якості життя, мали позитивну динаміку і в більшій мірі корелювали з клінічним станом і прогнозом при ХСН [ 19]. Так, вже через 2 тижні після трансплантації клітин рівень BNP істотно знижувався і досягав вихідного рівня тільки через 6 місяців (рис. 6). Це свідчить про високу чутливість і специфічність даного показника для пацієнтів з ХСН. Тому рівень BNP часто використовують в якості сурогатної точки при клінічних випробуваннях ефективності лікарських засобів у відношенні ХСН. BNP виробляється при ХСН переважно в шлуночках серця, і інтенсивність його синтезу залежить від розтягування порожнин шлуночків серця [45]. ФВ є розрахунковим ехокардіографічні параметром, на який впливає велика кількість як інтракарді-альних, так і екстракардіальних факторів. Крім того, діагностична цінність таких показників, як ударний обсяг, серцевий викид і фракція викиду, обмежена їхньою залежністю від перед- і післянавантаження. Процедура ж визначення BNP гранично автоматизована, і його рівень не залежить від суб'єктивної оцінки лікаря. Виходячи з цього, ми вважаємо, що рівень BNP в крові є більш об'єктивним критерієм як стану міокарда, так і функціонального стану серцево-судинної системи пацієнта.

    Останнім часом в клінічних дослідженнях, в основному за кордоном, для верифікації результату застосовують магнітно-резонансну, однофотонну емісійну і позитронно-емісійну томографії [46]. Ці методи дозволяють поряд з глобальної сократимостью оцінювати локальну скоротність, перфузію міокарда, метаболічні процеси в тканинах, тобто результати технології

    1800,0

    1600,0

    1200,0

    1000,0

    800,0

    600,0

    400.0

    200.0 0,0

    т- +-

    т т

    д / о 1 тиждень 1 міс 3 міс 6 міс 12 міс п / о п / о п / о п / о п / о

    термін спостереження

    «Основна група * Контрольна група

    Мал. 6. Динаміка середньої концентрації мозкового натрійуретичного пептиду в крові після трансплантації алогенних МСК.

    лікування. Їх застосування, однак, обмежується високою вартістю.

    Напрямки подальших досліджень

    Незважаючи на існуючі невирішені питання і навіть в деякій мірі настало розчарування щодо клітинної терапії, даний напрямок є вкрай перспективним, так як в ньому все ще залишається велике поле діяльності і наукових розробок, які дозволять підвищити ефективність існуючих технологій стимуляції регенерації. Можна виділити кілька основних напрямків подальших досліджень, які дозволять зробити суттєвий прорив у розвитку технології регенеративної медицини: тканинна інженерія кровоносних судин, клапанів, фрагмента і цілого серця; генетична модифікація стовбурових / прогеніторних клітин з метою підвищення експресії потрібного гена; отримання КМЦ з ембріональних і індукованих плюрипотентних клітин; розробка способів селективної трансплантації та ін. При цьому ці напрямки перебувають вже на експериментальній стадії досліджень і, можливо, скоро увійдуть в клінічну практику.

    23

    ЛІТЕРАТУРА

    1. Thomson J., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 1998; 6 November: 1145-1147.

    2. Харченко В.І., Какорін Е.П., Корякін М.В. та ін. Смертність від серцево-судинних захворювань в Росії і в економічно розвинених країнах. Необхідність посилення кардіологічної служби і модернізації медичної статистики в Російській Федерації (аналітичний огляд офіційних даних Держкомстату, МОЗ Росії, ВООЗ та експертних оцінок щодо проблеми). Російський кардіологічний журнал. 2005; 1 (51): 5-15.

    3. Коротєєв А.В., білявки І.Е. Хірургічне лікування серцевої недостатності. В кн .: Терещенко С.Н. Деякі невирішені питання хронічної серцевої недостатності. Москва. 2007: Додати 204-223.

    4. Беленко Ю.Н., Оганов Р.Г. Кардіологія. Національне керівництво. Москва: ГЕОТАР-медіа. 2007.

    5. Шумаков В.І., Хубутія М.Ш. Дилатаційна кардіоміопа-ку. Москва. 2003.

    6. Annarosa L., Kajstura J., Anversa P. Cardiac Stem Cells and Mechanisms of Myocardial Regeneration. Physiol. Rev. 2005; 85: 1373-1416.

    7. Румянцев П.П. Кардіоміоцити в процесах репродукції, диференціювання і регенерації. Л .: Наука. 1982: 288 с.

    8. van Amerongen M.J., Engel F.B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. J. Cell Mol. Med. 2008 Dec; 12 (6A): 2233-44.

    9. Thielel J., Varus E., Wickenhauser C. et al. Regeneration of heart muscle tissue: quantification of chimeric cardiomyocytes and endothelial cells following transplantation. Histol. Histopathol. 2004; 19: 201-209.

    10. Hove W.R., Verspaget H.W., Barge R. et al. Liver chimerism after allogeneic blood stem cell transplantation. Transplant. Proc. 2007 Jan-Feb; 39 (1): 231-236.

    11. Zhang M., Methot D., Poppa V. et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. J. Mol. Cell. Cardiol. 2001; 33 (5): 907-921.

    12. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest. 1999; 103 (5): 697-705.

    13. Passier R., van Laake L., Mummery C. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 2008; 453 (15): 322-329.

    14. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infarctedmyocardium. Nature. 2001; 410 (5): 701-705.

    15. Dail W., Hale S., Kloner R. Role of a paracrine action of mesenchymal stem cells in the improvement of left ventricular function after coronary artery occlusion in rats. Regenerative Med. 2007; 2 (1): 63-68.

    16. Stamm C., Nasseri B., Choi Y.H. et al. Cell therapy for heart disease: great expectations, as yet unmet. Heart Lung Circ. 2009 Aug; 18 (4): 245-56.

    17. Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х., Большакова ГБ. та ін. Репарація міокарда при трансплантації мононуклеарних клітин кісткового мозку. Клітинні технології в біології та медицині. 2010 року; 4: 203-211.

    18. Бочков Н.П., Нікітіна В.А. Цитогенетика стовбурових клітин людини. Молекулярна медицина. 2008; 3: 40-47.

    19. Wollert K., Drexler H. Cell therapy for the treatment of coronary heart disease: a critical appraisal. Nat. Rev. Cardiol. 2010 року; 7: 204-215.

    20. Фатхудинов Т.Х., Дьячков А.В., Коротєєв А.В. та ін. Безпека і ефективність трансплантації алогенних мультіпотентних стромальних клітин при хірургічному лікуванні дилатаційноюкардіоміопатії. Клітинні технології в біології та медицині. 2010 року; 1: 10-17.

    21. Kellar R., Landeen L., Shepherd B. et al. Scaffold-Based ThreeDimensional Human Fibroblast Culture Provides a Structural Matrix That Supports Angiogenesis in Infarcted Heart Tissue. Circulation. 2001; 104: 2063-2068.

    24 22. Reinecke H., MacDonald G., Hauschka S. et al. Electromechanical

    coupling between skeletal and cardiac muscle. Implications for infarct repair. J. Cell Biol. 2000, 149 (3): 731-740.

    23. Menasche P. Cell-based Therapy for Heart Disease: A Clinically Oriented Perspective. Molecular Therapy. 2009 року; 17 (5): 758-766.

    24. Meyer G., Wollert K., Steffens L. et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months 'follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrow transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 2002; 113: 1287-1294.

    25. Schachinger V, Assmus B., Honold J. et al. Normalization of coronary blood flow in the infarct-related artery after intracoronary progenitor cell therapy: intracoronary Doppler substudy of the TOPCARE-AMI trial. Clin. Res. Cardiol. 2006 Jan; 95 (1): 13-22.

    26. Hofmann M., Wollert K., Meyer G. et al. Monitoring of bone marrow cell homing into the infarcted human myocardium. Circulation. 2005; 111 (17): 2198-2202.

    27. Patel A., Geffner L., Vina R. Surgical treatment for congestive heart failure with autologous adult stem cell transplantation: a prospective randomized study. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005; 130 (6): 1631-1638.

    28. Charwat S., Lang I., Dettke M. et al. Effect of intramyocardial delivery of autologous bone marrow mononuclear stem cells on the regional myocardial perfusion. NOGA-guided subanalysis of the MYSTAR prospective randomised study. Thromb Haemost. 2010 Mar; 103 (3): 564-71.

    29. Freyman T., Polin G., Osman H. et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. European Heart Journal. 2006; 27: 1114-1122.

    30. Фатхудинов Т.Х., Слащев Г.А., Большакова Г.Б. і ін. Напрями міграції мононуклеарів кісткового мозку при інтракоронарне трансвентрікулярном введенні. Клітинні технології в біології та медицині. 2009 року; 4: 222-228.

    31. Bartunek J., Wijns W., Heyndrickx G. et al. Timing of intracoronary bone-marrow-derived stem cell transplantation after ST-elevation myocardial infarction. Nature clinical practice cardiovascular medicine. 2006; 3: 52-56.

    32. Kumar V., Abbas A. et al. 7 ed. Pathologic Basis of Disease. Elsevier Inc. 2004: Додати 1525.

    33. Souders C., Bowers S., Baudino T. Cardiac Fibroblast. The Renaissance Cell. Circ. Res. 2009 року; 105: 1164-1176.

    34. Sun Y, Weber K. Infarct scar: a dynamic tissue. Cardiovascular Research. 2000; 46: 250-256.

    35. Jugdutt B. Ventricular Remodeling After Infarction and the Extracellular Collagen Matrix. Circulation. 2003; 108: 1395-1403.

    36. Landa N., Miller L., Feinberg M. Effect of Injectable Alginate Implant on Cardiac Remodeling and Function After Recent and Old Infarcts in Rat. Circulation. 2008; 117: 1388-1396.

    37. Eglitis M., Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 4080-4085.

    38. Ferrari G., Cusella-DeAngelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science. 1998; 279: 1528-1530.

    39. Weissman I., Anderson D., Gage F. Stem and progenitor cells: Origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiation. Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 2001; 17: 387-403.

    40. Prockop D., Kota D., Bazhanov N. et al. Evolving paradigms for repair of tissues by adult stem / progenitor cells (MSCs). J. Cell. Mol. Med. 2010 року; 14 (9): 2190-2199.

    41. Lucas J., Terada N. Cell fusion and plasticity. Cytotechnology. 2003; 41: 103-109.

    42. Burchfield J., Dimmeler S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis & Tissue Repair. 2008; 1 (4): 1-11.

    43. Бочков Н.П. Клітинна терапія в світлі доказової медицини. Клінічна медицина. 2006; 10: 4-9.

    44. Ягудіна Р. І., Чібіляев В.А. Використання кінцевих і сурогатних точок в фармакоекономічних дослідженнях. Фармакоекономіка. 2010 року; 3 (2): 12-18.

    45. Suzuki E., Hirata Y., Kohmoto O. et al. Cellular Mechanisms for Synthesis and Secretion of Atrial Natriuretic Peptide and Brain Natriuretic Peptide in Cultured Rat Atrial Cells. Circulation Research. 1992; 71: 1039-1048.

    46. ​​Rodriguez-Porcel M. In vivo imaging and monitoring of transplanted stem cells: clinical applications. Curr. Cardiol. Rep. 2010 Jan; 12 (1): 51-8.

    КОНТАКТНА ІНФОРМАЦІЯ

    Гольдштейн Дмитро Вадимович, доктор біологічних наук, професор, керівник лабораторії генетики стовбурових клітин МГНЦ РАМН, генеральний директор ЗАТ «РеМеТекс»

    Адреса: 115478, Москва, Каширське шосе, д. 24, стр. 2 Тел .: (495) 324-20-24 Е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Фатхудинов Тимур Хайсамудіновіч, кандидат медичних наук, в.н.с. лабораторії росту і розвитку НІІМЧ РАМН, в.н.с. ЗАТ «РеМеТекс»

    Адреса: 115478, Москва, Каширське шосе, д. 24, стр. 2

    Тел .: (499) 503-96-38

    Е-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.


    Ключові слова: КЛІТИННА ТЕРАПІЯ / ЗАХВОРЮВАННЯ СЕРЦЯ / репаративної регенерації / CELL THERAPY / CARDIAC DISEASES / REPARATIVE REGENERATION

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити