Область наук:
  • Агробіотехнології
  • Рік видавництва: 2005
    Журнал: Известия вищих навчальних закладів. Харчова технологія
    Наукова стаття на тему 'Активність протеолітичних ферментів, інгібіторів трипсину і хімотрипсину в вищих грибах'

    Текст наукової роботи на тему «Активність протеолітичних ферментів, інгібіторів трипсину і хімотрипсину в вищих грибах»

    ?577.15.156.001.4

    АКТИВНІСТЬ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТОВ, інгібітора трипсину і хімотрипсину У ВИЩИХ ГРИБАХ

    Л.А. ГЗОГЯН, М.Т. ПРОСКУРЯКОВ

    Кубанський державний університет

    Дефіцит тваринної сировини і недосконалість мікробних препаратів стимулювали інтерес до базидий-альних грибам як можливим продуцентів протея-літичних ферментів [1]. Два обставини оправ -дивают пошук ферментів харчового призначення серед вищих базидіоміцетів: наявність серед них великої кількості їстівних грибів і відсутність спороношення в культурі, що зменшує небезпеку професійних захворювань в умовах виробництва [2]. Протея-літичні ферменти широко застосовуються в харчовій промисловості. Зі збільшенням вироблення сирів зріс інтерес до заміни тваринного химозина ферментами іншого походження. В результаті досліджень 44 штамів базидіоміцетів, здатних синтезувати молокостворажівающіе ферменти, встановлено, що два види базидиомицетов - Irpexlacteus і Fomitopsis pinicola утворюють протеази, які є хорошими замінниками химозина [3].

    Було проведено скринінг 400 природних видів вищих грибів з метою встановлення у них протеолі-ної активності [4]. Близько 1/3 досліджених видів агарикових і болетових грибів містили про-теінази, що розріджують фібрин і казеїн.

    Вперше інгібітори тріпсіноподобних ферментів в вищих грибах виявлено в 1985 р в видах Armillaria mellea, Nematoda fasciculare і Tricholoma populinum [5]. Проведений скринінг 46 видів 10 родин базидиомицетов виявив високу активність інгібітора трипсину в 8 видах 5 сімейств [6]. У 2000 р були отримані дані про наявність інгібітору трипсину в 54 вивчених видах порядку Agaricales і Aphyllophorales [7].

    Мета нашої роботи - детальне дослідження про-теолитическими активності до природних і синтетичним субстратів, а також активності інгібітора трипсину і хімотрипсину в базидіоміцети, найбільш поширених в Краснодарському краї.

    Досліджено 18 видів грибів порядків Boletales, Agaricales, Aphyllophorales, Russulales, що відносяться до різних еколого-трофічних груп. Для експериментів використовували сік плодових тіл базідіомах-цетов, отриманий після подрібнення, заморожування, розморожування і фільтрації. Сік зберігали в замороженому вигляді при температурі -18 ° С.

    Вміст розчинного білка визначали згідно [8], загального білка - по Кьельдалю [9], хімазний (молокозсідальної) активність, виражену в одиницях, - по [10]. Протеолітичну активність лужних протеаз визначали по казеїну методом [11], кислих протеаз - з використанням денатурованого гемоглобіну методом [12]. активність Вира-

    жали в одиницях оптичної щільності Е280. Тріпсіноподобних, хімотріпсіноподобную і еластолітіче-ську активності визначали за синтетичними субстратів М-бензоїл-Д? -Я-нітроаніліда (БАПНА), М-сукцинил ^ фенілаланіну-п-нітроаніліда (СФПНА)

    [13], N-сукцинил-тріаланін-п-нітроаніліда (СТАПНА)

    [14]. Активність виражали в мікромолі розщепленого субстрату в хвилину.

    Активність інгібітору трипсину і хімотрипсину визначали відповідними методами [15, 16].

    При визначенні оптимуму pH активності ферментів використовували розчини субстрату і зразка, приготовані на універсальної буферної суміші [17].

    Вміст білка в досліджених грибах (табл. 1) не мало закономірного характеру розподілу по ідентифікації і і становило від

    1.3 до 7,2 мг / мл. Максимальна кількість виявлено в Suillusflavidus з порядку Boletales, мінімальне

    - в Pleurotus ostreatus з порядку Agaricales. Близькі за змістом білка види порядку Russulales: 1,5-2,2 мг / мл. Зміст загального білка, за нашими даними, становить, г / 100 г продукту: печериця 4,3; підосичники 3,3; лисички 1,6; маслюк 2,0; березовик 5,0; білий гриб 5,5; опеньок 3,3. Виходячи з цього, було розраховано процентний вміст розчинного білка від загального, яке становило від 2,8 до 10%.

    У всіх видах виявлена ​​активність протеїназ до використаним специфічним синтетичним і природним субстратів (табл. 1). Використання синтетичних субстратів дозволило віднести визначається активність до групи тріпсіноподобних, хімотріпсі-ноподобних або еластолітичних ферментів.

    Активність тріпсіноподобних ферментів коливалося в діапозоні від 0,3 до 2,2 мкм. Найбільш високою вона була в порядку Boletales, де максимальна активність у видів Boletus edulis - 2,2 мкМ, мінімальна - в Cantarellus aurantiaca - 1,4 мкМ. В порядку Agaricales найбільша тріпсіноподобних активність у виду Flammulina velutipes сімейства Tricholomataceae -

    1.3 мкМ, найменша - у виду Pleurotus cornucopiae сімейства Pleurotaceae - 0,3 мкМ. В порядку Russulales найбільшу кількість тріпсіноподобних ферментів спостерігалось у виду Lactarius pubescens - 1,6 мкМ, а в порядку Aphyllophorales у виду Herricium erinaceus

    - 0,9 мкМ.

    Активність хімотріпсіноподобних ферментів коливалася від 1,3 до 4,8 мкм. Найбільш високою вона була в порядку Boletales, вид Boletus edulis. В порядку Agaricales високою активністю відзначався вид Flammulina velutipes - 2,4 мкМ, в порядку Russulales - Lacatarius piperatus - 2,7 мкМ. Найменшою активністю володіли гриби порядку Aphyllophorales, вид Hericium erinaceus - 2,1 мкМ.

    Таблиця 1

    Білок, мг / мл Активність по субстратів

    Порядок, вид БАПНА, мкМ СФПНА, мкМ СІАПНА Молоко Казеїн Оптимум pH Г емогло -бін, pH Оптимум pH

    Boletales:

    Boletus edulis 2,4 2,2 4,8 0,24

    Leccinum auranticum 5,2 1,8 3,8 0,11

    Leccinum melanum 5,6 1,5 2,4 0,14

    Boletus castanus 3,5 2,1 1,9 0,12

    Suillus flavidus 7,2 1,9 2,3 0,8

    Cantarellus aurantiaca 1,9 1,4 2,4 0,09

    Agaricales: Flammulina velutipes 4,1 1,3 2,4 0

    Armmilaria mellea 1,9 1,1 2,3 0

    Macrolepiota procera 4,5 1,2 1,9 0

    Agaricus silvaficus 1,8 0,8 2,2 0

    Amanita phaloides 3,6 0,4 1,9 0

    Pleurotus ostreatus 1,3 0,2 2,2 0

    Pleurotus cornucopiae 1,5 0,3 1,4 0

    Russulales: Lactarius pubescens 2,2 1,6 2,7 0

    Russula veska 1,9 1,2 2,5 0

    Lactarius piperatus 1,54 0,9 2,9 0

    Aphylloph orales: Coriolus versicolor 3,2 1,3 1,3 0

    Hericium erinaceus 4,2 2,1 2,1 0

    Між вмістом тріпсіноподобних і хімот-ріпсіноподобних ферментів існує позитивний кореляційний залежність r 0,64.

    Еластолітичних активність виявлена ​​тільки у видів порядку Boletales, де максимальною активністю володів вид Boletus edulis - 0,24 мкМ, мінімальної - Cantarellus aurantiaca - 0,09 мкМ.

    Активність по молоку була в діапазоні 0,2-4,9 од. Найвища молокозсідальної активність спостерігалася у видів порядку Boletales: максимальна -у Boletus edulis - 4,9 од., Мінімальна - у Leccinum melanum - 1,7 од. У порядкеAgaricales цей показник найбільш виражений у виду Flammulina velutipes - 1,7 од., Найменш - у Pleurotus ostreatus - 0,2 од. У порядках Aphyllophorales і Russulales висока активність була у видів Lactariuspubecens і Hericium erinaceus - 1,4 і 1,2 од. відповідно.

    Висока активність лужних протеаз відзначена у видів порядку Boletales: найбільша у вигляді Boletus edulis - 0,78 од., Найменша - в Cantarellus aurantiaca

    - 0,33 од. Далі слідують види в порядках Agaricales, Russulales. Найменш виражена активність лужних протеаз в видах порядку Aphyllophorales. В порядку

    4,9 0,78 8,5 0,26 3,5

    2,8 0,64 8,5 0,41 2,5

    1,7 0,57 8,5 0,38 2,5

    3,4 0,67 9,5 0,33 3,0

    2,2 0,73 8,5 0,22 2,0

    2,2 0,33 8,0 0,35 3,5

    1,7 0,76 8,5 0,22 3,5

    1,2 0,38 8,5 0,11 5,0

    0,6 0,45 8,0 0,24 3,5

    0,8 0,53 9,5 0,25 3,0

    0,4 0,28 8,5 0,12 3,5

    0,2 0,14 9,0 0,38 3,0

    0,3 0,28 9,5 0,12 3,0

    1,4 0,23 8,0 0,13 2,5

    1,2 0,26 8,0 0,17 2,5

    2,4 0,33 8,5 0,19 2,5

    0,8 0,18 8,5 0,12 3,0

    1,2 0,26 9,0 0,16 2,5

    Agaricales найбільша активність по казеїну у Пашшіііпа уеШіреі '- 0,76 од., Найменша - у Ріеігоїш віїгеаїш' - 0,14 од. У порядках Кшзііаіез і Аркуііоркогаіеі 'високою активністю по казеїну володіли види Ьасїагііі' ріЬеі'сет - 1,4 од. і Негісііш егіпасеш - 0,26 од. Оптимум активності цих протеаз був в інтервалі pH від 7,5 до 9,5.

    Активність кислих протеїназ виявлена ​​у всіх видах. В порядку Боіеїаіеі 'вона найбільш виражена у виду Ьессіпіш аігапґісіш - 0,41ед., Найменш - у виду 8ііііш' Jlavidus - 0,22 од. В порядку Agaricales висока активність спостерігалася у Ріеігоі оіігеаі -0,38 од., Низька у Агшшііагіа шеііеа - 0,11 од. Види порядків Аркуііоркогаіеі 'і Кшзііаіез схожі за активністю розщеплення гемоглобіну, що становить від 0,12 до 0,19 од. Оптимум активності кислих протеаз перебував при pH 2,5-3,5.

    Встановлено позитивний кореляційний залежність між молокозсідальної активністю і активностями лужних і кислих протеаз: г 0,68 і 0,36 відповідно, між активностями лужних і кислих протеаз: г 0,37, між вмістом білка і активністю ферментів: г 0,64.

    Таблиця 2

    Порядок, вид Інгібітор, мг / г

    трипс ина химотрипсина

    Boletales:

    Boletus edulis 3,7 5, б

    Leccinum aurantiacum 1,7 0

    Leccinum melanum 5,3 5,9

    Boletus castanus 1,8 0

    Suillus flavidus 2,3 4,2

    Cantarellus aurantiaca 3, б 0

    Agaricales:

    Flammulina velutipes 2,0 0

    Armillaria mellea 2,0 7,8

    Macrolepiota procera 1,1 0

    Agaricus silvaficus 1,0 7,4

    Amanita phaloides 1,2 0

    Pleurotus ostreatus 1,9 0

    Pleurotus cornucopiae 0, б 0

    Russulales:

    Lactarius pubescens 0,4 0

    Rusula veska 0,3 0

    Lactarius piperatus 1,1 0

    Aphyllophorales:

    Coriolus versicolor 0,2 7,2

    Herricium erinaceus 0,4 0

    Інгібітори трипсину виявлені у всіх досліджених видах базидиомицетов (табл. 2). Усередині порядку Boletales максимальною активністю інгібітора трипсину мав вигляд Leccinum melanum - 5,3 мг / г, мінімальної - вид Leccinum auranticum - 1,7 мг / г. В порядку Agaricales цей показник вищий у видів Flammulina velutipes і Armmilaria mellea - 2,0 мг / г. В порядку Russulales висока активність інгібітора трипсину спостерігалася у виду Lactarius piperatus -1,1 мг / г, в порядку Aphyllophorales - у виду Herricium erinaceus - 0,4 мг / г. Mежду вмістом інгібітора трипсину і кількістю розчинного білка встановлена ​​позитивна кореляційна залежність: r 0,78.

    Інгібітор химотрипсина виявлений в б видах ба-зідіоміцетов: Leccinu melanum, Boletus edulis,

    Armillaria mellea, Agaricus slvaficus, Coriolus versicolor (табл. 2). Mаксімальной активністю володів вид Armillaria mellea - 7,8, мінімальний - вид Suillus flavidus - 4,2 мг / г.

    Таким чином, у всіх досліджених видах грибів виявлена ​​протеолітичнаактивність до природних і синтетичним субстратів. Аналіз характеру розподілу протеолітичної активності по ідентифікації і свідчить, що найбільш активними до природних і синтетичним субстратів були види порядку Boletales, далі йдуть Agaricales, Russulales і Aphyllophorales. Найбільш перспективними видами для пошуків замінника химозина є Boletus edulis, Boletus castanus, Leccinum

    auranticum, Cantarellius aurantiaca порядку Boletales і Lactarius piperatus порядку Russulales. Еластолітіче-ська активність виявлена ​​тільки у видів порядку Boletales. Встановлено позитивний кореляційний залежність між тріпсіноподобних, хімот-ріпсіноподобнимі і еластазоподобнимі ферментами. Активність інгібітору трипсину виявлена ​​у всіх видах, а інгібітору химотрипсина в 6 з 18 досліджених видів. На підставі отриманих даних можна припустити, що базидіоміцети можуть служити сировиною для отримання протеолітичних ферментів та їх інгібіторів, що використовуються в харчовій технології і медицині.

    ЛІТЕРАТУРА

    1. Бєлова Н.В. Базидіоміцети - джерела біологічно активних речовин // Раст. ресурси. - 1991. - № 2. - С. 23-27.

    2. Псурцева Н.В., Бєлова Н.В. Біотехнологічні можливості використання колекційних культур базидиомицетов // Біотехнологія. - 1994. - № 7. - С. 35-39.

    3. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymec and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes // J. Agr. Chem. Soc. Japan. - 1973. - 47. - № 8. - P. 467-472.

    4. Денисова Н.П. Природа і біологічна роль протеї-зв базидіальних грибів // Мікологія і фітопатологія. - 1984. -№ 2. - С. 112-116.

    5. Piligrim H., Darwaza M. Untersuchungen zur inhibitorsichen wirkung von wabrigen Entrakten aus basidiomyceten aur trypsin // Pharmazie. - 1985. -3. - P. 655.

    6. Pilgrim H., Haasman S., Schroder K. Trypsin inhibitor activity of Basidiomycetes // Zentralb. Microbiol. - 1992. -147. -P. 400-404.

    7. Vetter J. Eur Food Res Technol. - 2000. -211. - № 3. -P. 346-348.

    8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram quantities of protein utilizing of protein - dye bindig // Anal. Biochim. - 1976. -72. - № 2. - P. 127-129.

    9. Скоупс Р. Методи очищення білків. - М .: Світ, 1985. -С. 315.

    10. П'ятницький Н.П., Проскуряков М.Т. // Матеріали 17-ї наук. конф. фізіологів Півдня РРФСР. - Ставрополь, 1969. -С. 80-82.

    11. Нортроп Д., Кунітц М., Херріот Р. Кристалічні ферменти. - М., 1950. - 346 с.

    12. Anson M. L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with gemoglobin // J. Gen. Physiol. - 1938. -22. - № 1. -

    P. 79-89.

    13. Tuppy H., Winterberger E., Wiessbauer U.

    Amino-soure-p-nitroanilide als substrat fur aminopeptidasen and andere proteolytycs fement // Hoppe Selers. Z. Physiol. Chem. - 1962. -329. -№ 6. - P. 278-288.

    14. Katagiri K., Takeuchi T., Sasaki M. One step purification procedure of elastase frome pancreatic powder by affinity chromatography // Anal. Biochem. - 1978. -86. - P. 159-165.

    15. Erlanger B.F. The action of chymotrypsin on two New Chromogenic Substrates // Arch. Biochem. Biophys. - 1996. -115. -P. 206-210.

    16. Birk Y. Trypsin Inhibitor from Garden Bean (Phaseolus vulgaris) // Methods in Enzymology. -45. - N. Y. - S.F. - L .: Acad. Press, 1976. - P. 710-716.

    17. Джоржеску П., Пуенеску Е. Біохімічні методи діагнозу і дослідження. - Бухарест, 1963. - 611 с.

    Кафедра фізіології та біохімії людини

    Надійшла 07.02.05 р.


    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити