В результаті проведеного дослідження активності протеасом у хворих на злоякісні пухлини різної локалізації встановлені різноспрямовані їх значення. У тканині пухлини нирки відбувалося зниження активності протеасом в порівнянні з навколишнім незміненій тканиною. при раку сечового міхура активність ферментів в пухлини не відрізнялася від їх активності в навколишньому тканини. У пухлинної тканини ендометрію і в плоскоклітинний карциноми голови та шиї активність протеасом була підвищена в порівнянні з навколишнім незміненій тканиною. збільшення активності протеасом при злоякісних новоутвореннях обумовлено збільшенням активності пулу 20S-протеасом.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Спіріна Людмила Вікторівна, Кондакова Ірина Вікторівна, Усинін Євген Анатолійович, Коломієць Лариса Олександрівна, Чойнзонов Євген Лхамациреновіч


Proteasome activity in cancer tissues

Proteasome activity in cancer tissues was studied. Proteasome activity was decreased in kidney cancer tissue compared with surrounding normal tissue. No difference in proteasome activity was observed between malignant and normal bladder tissue. Proteasome activity was higher in endometrial and head and neck squamous cell cancer tissues than in surrounding normal tissue. The elevated proteasome activity in cancer patients was associated with increased activity of 20S proteasome


Область наук:
  • фундаментальна медицина
  • Рік видавництва: 2009
    Журнал: Сибірський онкологічний журнал

    Наукова стаття на тему 'Активність протеасом в тканинах злоякісних пухлин різних локалізацій'

    Текст наукової роботи на тему «Активність протеасом в тканинах злоякісних пухлин різних локалізацій»

    ?УДК: 616-006.6: 577.156

    АКТИВНІСТЬ протеасому В ТКАНИНАХ ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН різної локалізації

    Л.В. Спіріна1, І.В. Кондакова1, Е.А. Усинін1, Л.А. Коломіец12,

    Е.Л. Чойнзонов12, М.Р Мухамедов1, А.Л. Чернишова1, Н.П. Шарова3

    НДІ онкології СО РАМН, м Томск1 ГОУ ВПО «Сибірський державний медичний університет Росздрава», м Томск2 Інститут біології розвитку ім. Н.К. Кольцова РАН, м Москва3 634050, Томськ, пров. Кооперативний, 5, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    В результаті проведеного дослідження активності протеасом у хворих на злоякісні пухлини різної локалізації встановлені різноспрямовані їх значення. У тканині пухлини нирки відбувалося зниження активності протеасом в порівнянні з навколишнім незміненій тканиною. При раку сечового міхура активність ферментів в пухлини не відрізнялася від їх активності в навколишньому тканини. У пухлинної тканини ендометрію і в плоскоклітинний карциноми голови та шиї активність протеасом була підвищена в порівнянні з навколишнім незміненій тканиною. Збільшення активності протеасом при злоякісних новоутвореннях обумовлено збільшенням активності пулу 20S-протеасом.

    Ключові слова: активність протеасом, 20S протеасоми, 26S протеасоми, рак нирки, рак сечового міхура, рак ендометрія, плоскоклітинний карциноми голови та шиї.

    PROTEASOME ACTIVITY IN CANCER TISSUES L.V Spirina1, I.V Kondakova1, Y.A. Usynin1, L.A. Kolomiets12 E.L. Choinzonov12, M.R. Mukhamedov1, A.L. Chernyshova1, N.P. Sharova3 Cancer Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk1 Siberian State Medical University, Tomsk2 Koltzov Institute of Developmental Biology RAS, Moscow1 5, Kooperativny Street, 634009-Tomsk, e-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Proteasome activity in cancer tissues was studied. Proteasome activity was decreased in kidney cancer tissue compared with surrounding normal tissue. No difference in proteasome activity was observed between malignant and normal bladder tissue. Proteasome activity was higher in endometrial and head and neck squamous cell cancer tissues than in surrounding normal tissue. The elevated proteasome activity in cancer patients was associated with increased activity of 20S proteasome.

    Key words: proteasome activity, 20S and 26S proteasomes, kidney cancer, bladder cancer, endometrial cancer. head and neck squamous cell carcinoma.

    Розвиток злоякісних новоутворень тісно пов'язаний з комплексом протеаз, які отримали назву «раковий деграде», які визначають такі важливі властивості пухлин, як інвазія і метастазування [13]. Крім того, внутрішньоклітинні протеолітичні системи, розщеплюючи регуляторні та сигнальні білки, беруть участь в різних процесах - проліферації, апоптозу та ін. Найбільш важливу роль в деградації білків клітини грає протиасомна система. яка представляє собою внутрішньоклітинний ферментативний комплекс, який відповідає за специфічний протеоліз білків. Протеасома володіє тріпсіноподобних, хімотрипсин-подібної, каспазной активностями. Виділяють 20S і 26S пули протеасом [4, 8, 17]. Повний протеоліз відбувається в 26S Протеасома, однак каталітичної активністю володіє також 20S пул. Впізнавання білків-мішеней, які підлягають розщепленню, здійснюється компонентами,

    що не належать протеолитическому комплексу, а саме, Убіквітин і білками, їх переносять [3, 16]. 26S протеасоми здійснюють убіквітін- і АТФ-залежний протеоліз завдяки наявності в їх складі 19S-субодиниці. здатної розпізнавати убіквітінірованние білки, а також розплітати їх і проштовхувати в протеолитическую камеру [8, 16]. 20S протеасому-ми гидролизуют білки, головним чином, з пошкодженої третинної структурою незалежно від убіквітину [11].

    Протеасоми грають важливу роль в підтримці функціональної активності клітин, зокрема в регуляції роботи сигнальних систем, які активуються при взаємодії ростових факторів з відповідними рецепторами [10, 12]. Порушення у функціонуванні протеасомного комплексу пов'язане з багатьма патологіями і має велике значення в розвитку онкологічних захворювань. В екс-

    періментальних умовах показано зміна активності і складу пулу 26S протеасом в онкогенезе [2]. В даний час активно вивчається роль убіквітінзавісімого протеолізу в патогенезі злоякісних утворень різних локалізацій, зокрема передміхурової залози [14], молочної залози [7], кишечника [18] та ін. Однак в цих дослідженнях велика увага приділяється вивченню убіквітінірова-ня білків, в той час як активність протеасом досліджена недостатньо.

    У зв'язку з цим метою даної роботи було вивчення зміни активності протеасомної системи при раку нирки, сечового міхура, ендометрія і при плоскоклітинному раку голови і шиї.

    Матеріал і методи дослідження

    У дослідження були включені 12 хворих на рак нирки Т2-3К0-1М0-1 (середній вік - 53,4 ± 3,1 року), 13 хворих на рак сечового міхура Т2-3К0М0 (середній вік - 56,0 ± 2,3 року) , 7 хворих на рак ендометрія Т1-2 ^ М0 (середній вік - 66,57 ± 2,1 року) і 12 хворих з пухлинами гортані і гортаноглотки Т1-4К0-2М0 (середній вік - 57,7 ± 2,19 року), що проходили комбіноване лікування в клініках НДІ онкології СО РАМН, Томськ. Матеріалом дослідження були пухлинна тканина нирки, сечового міхура, ендометрія, гортані і гір-таноглоткі і візуально не змінена тканина, що знаходиться на відстані не менше 1 см від кордону пухлин. У 10 випадках пухлини нирки діагностовано світлоклітинний нирковоклітинний рак, в 2 - папілярний нирковоклітинний рак. У групі хворих з світлоклітинним раком нирки регіонарні і віддалені метастази мали 2 хворих. Серед хворих на рак сечового міхура не було хворих з регіонарними метастазами. Хворі на рак ендометрія були розподілені за стадіями захворювання наступним чином: 5 пацієнтів мали 1В стадію, 2 - II стадію. Під час гістологічного дослідження тканини раку ендометрія верифицирован ендометріоїдних рак в 6 зразках і в 1 випадку - неендометріоідний рак. Пухлини голови та шиї представляли собою плоскоклітинний карциному гортані і гортаноглотки. Регіонарні лімфогенні метастази мали 7 хворих пухлинами голови і шиї

    Отримання освітлених гомогенатов. Заморожену тканину (100 мг) гомогенізували в рідкому азоті, потім ресуспендіровалі в 300 мкл 50 мM трис-HCl буфера (pH = 7,5), що містить 2 мM ATФ, 5 мM хлорид магнію, 1 мM дітіотреїтолу, ^ M ЕДTA і 100 мM хлорид натрію. Гомогенат центрифугували 60 хв при 10000g і 4оС. Супернатант (освітлений гомогенат) використовували для визначення активності протеасом.

    Фракціонування протеасом. Всі процедури проводили при 4 ° С. 100 мг тканини гомогенізували в рідкому азоті, потім ресуспендіровалі в 1000 мкл 50 мM трис-HCl буфера (pH = 7,8), що містить 2 мM ATФ, 5 мM хлорид магнію, ^ M ЕДTA і 100 мM хлорид натрію. Гомогенат центрифугували 60 хв при 10000g і 4оС на мікроцентрифузі Eppendorf Centrifuge 5415R (Німеччина). Білки освітлених гомоге-натов фракціонували за допомогою сульфату амонію в два етапи. Фракцію, збагачену 26S-протеaсомaмі, отримували додаванням сульфату амонію до 40% насичення, фракцію 20S-протеaсом - додаванням сульфату амонію до 70% насичення [1]. Сульфат амонію до 40% насичення вносили порціями протягом 20 хв на магнітній мішалці. Після повного розчинення сульфату амонію препарат перемішували протягом 20 хв, потім центрифугували при 12500 об / хв протягом 20 хв, осад розчиняли в 250 мкл 20 мM Tріс- HCl буфера (pH 7,5), що містить 2 мM ATФ, 5 мM хлорид магнію, ^ M ЕДTA і 20% гліцерин. До отриманої треба-садочної рідини додавали сульфат амонію до 70% насичення. Процедуру висолювання проводили так само, як зазначено вище. Осад розчиняли в 250 мкл 20 мM Tріс-HCl буфера (pH 7,5), що містить ^ M ЕДTA і 20% гліцерин.

    Визначення активності протеасом. A ^ m-ність тотального пулу протеасом, що містить форми 26S і 20S, визначали в освітлених гомогенатах пухлинних і незмінених тканин по гідролізу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC, утилізують хімотріп-сінподобнимі центрами протеасом [5]. Aot ™ ність пулів 26S і 20S протеасом визначали у відповідних фракціях, одержаних з пухлинних і незмінених тканин. Реакційна суміш для визначення активності тотального пулу протеасом і пулу 26S протеасом містила

    активність протеасом в тканинах злоякісних пухлин різних локалізацій ------------------------------------------ ------------------------------------- 51

    20 мМ Тих-НС1 (pH 7,5), 1 мМ дітіотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5мМ MgCl2 і 1 мМ АТФ. Реакційна суміш для визначення активності пулу 20S протеасом мала такий же склад за винятком MgCl2 і АТФ. Реакцію проводили при 370С протягом 20 хв. Утворився продукт реєстрували на флуориметрі «НйасИ-850» (Японія) при довжині хвилі збудження 380 нм і емісії 440 нм. За одиницю активності протеасом брали кількість ферменту, при якому гідролізується 1 нмоль Suc-LLVY-AMC протягом 1 хв. Питому активність протеасом висловлювали в одиницях активності на 1 мг білка. Вміст білка визначали за методом Лоурі [15].

    У таблиці все результати представлені як т ± М, де т - середнє вибіркове, М - помилка середнього. Значимість відмінностей досліджували за допомогою непараметричного критерію Манна-Уїтні. Ступінь і значимість кореляційної зв'язку між показниками оцінювали за допомогою коефіцієнта Спірмена. Статистичну обробку результатів проводили із застосуванням пакету статистичних програм Statistica 6.0.

    Результати та обговорення

    В результаті проведеного дослідження виявлено, що протиасомна активність в тканини раку нирки значно вище, ніж в прилеглій тканині (таблиця). Слід зазначити, що на активність протеасом істотний вплив надавав гістологічний тип раку нирки. При виділенні групи з нирково-клітинного світлоклітинним раком протиасомна активність в тканини пухлини була достовірно нижче (в 4,3 рази) в порівнянні з нормальною тканиною (37,5 ± 5,0 * 103 Од / мг білка). При папілярному варіанті раку нирки активність була підвищена до 237,4 * 103 Од / мг, що вимагає

    додаткового дослідження. Зниження активності ферментів в тканини светлоклеточного раку нирки, ймовірно, асоційоване з дефектом Е3 лігази, ферменту внутрішньоклітинної убіквітин-залежної системи [6, 12].

    Протиасомна активність в тканини сечового міхура не відрізнялася від цього показника в незміненій тканини (таблиця).

    У тканині раку ендометрія активність про-ТЕАС була достовірно вище в порівнянні з нормальною тканиною (відповідно 65,11 ± 16,94 * 103 Од / мг білка і 30,48 ± 1,14 * 103 Од / мг білка). У разі неендометріодного раку активність ферментів підвищувалася до 150 * 103 Од / мг білка.

    Активність протеасом в тканини плоскоклітинний карцином голови і шиї була достовірно вище в порівнянні з її активністю в незміненій тканини (таблиця). Для вивчення особливостей високої активності протеасом в пухлинах цієї локалізації було проведено фракціонування протеасом. На рис. 1 представлена ​​активність 26S і 20S пулів про-ТЕАС в незміненій і пухлинної тканини. У пухлинної тканини була відзначена триразова різниця між активностями різних пулів протеасом, в той час як в незміненій тканини активність 26S пулу була незначно нижче 20S пулу. Активність 20S фракції в пухлинної тканини була вищою на 11,85 * 103 Од / мг білка в порівнянні з активністю фракції в незміненій тканини. Однак відмінностей в активності 26S-протеасом в пухлинної і незміненій тканинах не виявлено. Отже, зростання активності протеасом в пухлинної тканини відбувається за рахунок 20S фракції. При вивченні зв'язку показників внутрішньоклітинного протеолізу і протеолізу в окремих фракціях в пухлинної

    Таблиця

    Протиасомна активність при раку нирки, сечового міхура, ендометрія і при плоскоклітинний карциноми голови та шиї

    Вид пухлини п протеасомного активність незміненій тканини, х103 Од / мг білка п протеасомного активність тканини пухлини, х103 Од / мг білка

    Рак нирки 6 117,6 ± 17,3 12 50,7 ± 46,2 *

    Рак сечового міхура 5 43,6 ± 10,5 13 47,2 ± 6,8

    Рак ендометрія 7 30,5 ± 1,1 7 65,1 ± 16,9 *

    Плоскоклітинні карциноми голови та шиї 3 14,4 ± 0,7 12 35,5 ± 4,6 *

    Примітка: * - відмінності статистично значущі (р<0,05).

    Мал. 1. Активність 26S і 20S протеасом в незміненій і пухлинної тканини (плоскоклітинний рак голови та шиї). Примітка: * - значимість відмінностей між активністю 20S протеасом незміненій і пухлинної тканини (р<0,05);

    ** - значимість відмінностей між активністю 26S і 20S протеасом пухлинної тканини (р<0,05)

    тканини показана залежність загальної активності протеасом від активності 20S фракції ^ = 0,86; р = 0,0001). Відомо, що 20S протеасома здатна руйнувати дрібні пептиди [9]. Ймовірно, накопичення ростових факторів, метаболітів та інших біологічно активних речовин призводить до стимуляції внутрішньоклітинного протеолізу і посиленою збірці мультікаталітіческіх субодиниць ферментів. Однак збірка 26S-протеасом вимагає великого тимчасового періоду, тому розщеплення пептидів в пухлинах переважно відбувається в 20S-Протеасома.

    Таким чином, в результаті проведеного дослідження активності протеасом у хворих на злоякісні пухлини різної локалізації встановлені різноспрямовані їх значення. У тканині пухлини нирки спостерігається більш висока активність протеасом в навколишньому тканини, в порівнянні із злоякісною, що, ймовірно, може служити ознакою поширеності процесу. При перехідноклітинний раку сечового міхура не було виявлено відмінностей в активності протеасом пухлини і в незміненій тканини. У пухлинної тканини ендометрію і при плоскоклітинний карциноми голови та шиї відбувається збільшення активності протеасом в пухлини в порівнянні з навколишньою тканиною. Активація внутрішньоклітинного специфічного протеолізу пов'язана зі збільшенням активності пулу 208

    протеасом, який здійснює руйнування пошкоджених білків, метаболітів і біологічно активних пептидів, регулюючи безліч процесів, важливих для розвитку пухлин.

    Робота частково виконана за фінансової підтримки Російського фонду фундаментальних досліджень (грант № 08-04-00616а)

    ЛІТЕРАТУРА

    1. Абрамова Є.Б., Астахова Т. М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. Множинність форм протеасоми і деякі підходи до їх поділу // Известия РАН. Серія «Біологія». 2006. № 2. С. 150-156.

    2. Астахова Т. М., Шарова Н.П. Виняток імунних протеасом з клітин асцитної карциноми Krebs-II миші // Известия РАН. Серія «Біологія». 2006. № 3. С. 275-283.

    3. Ротанова Т.В., Мельников Е.Е. АТР-залежні протеїнази і протеолітичні комплекси внутрішньоклітинної деградації білків // Біомедична хімія. 2008. Т. 54, вип. 5. С. 512-530.

    4. Шарова Н.П., Астахова Т. М., Бондарева Л.А. та ін. Особливості формування пулів протеасом в селезінці і печінці щурів в постнатальному розвитку // Біохімія. 2006. Т. 71, вип. 9. С. 1278-1286.

    5. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. 26S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. (31). P. 21963-21972.

    6. CharleswirthP.J.S., HarrisA.L. Mechanism of disease: angio-genesis in urologic malignancies // Nature Clin. Pract. 2006. Vol. 3. P. 157-169.

    7. Chen C., Seth A.K., Aplin A.E. Genetic and expression aberrations of E3 ubiquitin ligases in human breast cancer // Mol. Cancer Res. 2006. Vol. 4. P. 695-707.

    8. Dahlmann B. Role of proteasomes in disease // BMC Biochemistry. 2007. Vol. 8. P. 2091-3013.

    9. Emmerich N.P.N., Nussbaum A.K., Stevanovic S. et al. The Human 26 S and 20 S Proteasomes Generate Overlapping but Different Sets of Peptide Fragments from a Model Protein Substrate // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 21140-21148.

    10. GirnitaL., GirnitaA., Larson O. Mdm-2-dependent ubiquiti-nation and degradation of the insulin-like growth factor 1 receptor // PNAS. 2003. Vol. 100. P 8247-8252.

    11. Grune T., Reinheckel T., DaviesK.J.A. Degradation of oxidized proteins in K562 human hematopoietic cells by proteasome // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 15504-15509.

    12. Kim W.Y., Kaelin W.G. The role of VHL mutation in human cancer // J. Clin. Oncol. 2004. Vol. 22. P. 4991-5004.

    13. Lah T.T., Duran Alonso M.B., Van Noorden CJ. Antiprotease therapy in cancer: hot or not? // Expert. Opin. Biol. Ther. 2006. Vol. 6 (3). P. 257-279.

    14. Li B., Dou Q.P. Bax degradation by the ubiquitin / proteasomedependent pathway: Involvement in tumor survival and progression // Biochemistry. 2000. Vol. 97 (8). P. 3850-3855.

    15. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

    16. Orlowski M., Wilk S. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome // Arch. Biochem. Biophys. 2003. Vol. 415 (1). P. 1-5.

    17. Sharova N., Zakharova L. Multiple forms of proteasomes and their role in tumor fate // Recent Patents on Endocrine, Metabolic & Immune Drug Discovery. 2008. Vol. 2 (3). P. 152-161.

    18. Voutsadakis I.A. The ubiquitin-proteasome system in colorectal cancer // J. Cell Mol. Med. 2007. Vol. 11 (2). P. 252-337.

    надійшла 9.12.08


    Ключові слова: АКТИВНІСТЬ протеасому / 20S протеасома / 26S протеасома / РАК НИРКИ / РАК сечового міхура / РАК ЕНДОМЕТРІЯ / Плоскоклітинний КАРЦИНОМИ ГОЛОВИ І ШИЇ / ENDOMETRIAL CANCER. HEAD AND NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA / PROTEASOME ACTIVITY / 20S AND 26S PROTEASOMES / KIDNEY CANCER / BLADDER CANCER

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити