В даній статті наведені результати досліджень впливу обробки саліцилової і жасмонової кислотами на рівень активності протеолітичних і амілолітичних ферментів, їх інгібіторів в тканинах пшениці і калюсах картоплі при ураженні патогенними мікроорганізмами (Septoria nodorum, Phytophthora infestans). Виявлено, що зараження рослин патогенами і обробка сигнальними молекулами призводить до підвищення рівня активності інгібіторів протеїназ і зниження активності власних амілаз в рослинних тканинах.

Анотація наукової статті по агробіотехнології, автор наукової роботи - Ахатова А. Р., Ярулліна Л. Г., Шпірний І. А., Заїкіна О. О., Суріна О. Б.


ACTIVITY OF HYDROLASES AND THEIR INHIBITORS IN PLANT TISSUES DURING INFECTION OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI UNDER RESISTANCE INDUCTORS

This article presents the results of studying the salicylic and jasmonic acids effect on the level of activity of proteolytic and amylolytic enzymes and their inhibitors in the tissues of wheat and potato calli with the defeat of pathogens (Septorianodorum, Phytophthorainfestans). It is revealed that the infection of plant pathogenns and processing of signaling molecules leads to increasing the activity of proteinase inhibitors and reducing the activity of their own amylases in plant tissues.


Область наук:
  • Агробіотехнології
  • Рік видавництва діє до: 2012
    Журнал: Вісник Башкирського університету

    Наукова стаття на тему 'Активність гідролаз, їх інгібіторів в тканинах рослин при зараженні фітопатогенами і обробці індукторами стійкості'

    Текст наукової роботи на тему «Активність гідролаз, їх інгібіторів в тканинах рослин при зараженні фітопатогенами і обробці індукторами стійкості»

    ?УДК 577.l5 + 63l.524

    АКТИВНІСТЬ гідролазами, ЇХ ІНГІБІТОРІВ У ТКАНИНАХ РОСЛИН ПРИ зараженні фітопатогенів І ОБРОБКИ індуктора

    СТІЙКОСТІ

    © А. Р. Ахатова1, Л. Г. Ярулліна1,2 *, І. А. Шпірная2, Е. А. Заікіна1,

    О. Б. Суріна1, В. О. Цветков2, Р. І. Ібрагімов2

    1 Інститут біохімії і генетики Уфимського наукового центру РАН Росія, Республіка Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Жовтня, 71.

    Тел. / Факс: +7 (347) 235 60 SS.

    E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. 2Башкірскій державний університет Росія, Республіка Башкортостан, 450074 г. Уфа, вул. Заки Валід, 32.

    Тел. / Факс: +7 (347) 273 67 7S.

    E-mail: ibragimov56 @ yandex. ru

    В даній статті наведені результати досліджень впливу обробки саліцилової і жасмонової кислотами на рівень активності протеолітичних і амілолітичних ферментів, їх інгібіторів в тканинах пшениці і калюсах картоплі при ураженні патогенними мікроорганізмами (Septoria nodorum, Phytophthora infestans). Виявлено, що зараження рослин патогенами і обробка сигнальними молекулами призводить до підвищення рівня активності інгібіторів протеїназ і зниження активності власних амілаз в рослинних тканинах.

    Ключові слова: гідролази, інгібітори протеїназ, саліцилова і жасмонової кислоти, S. nodorum, Ph. infestans.

    Вступ

    Одним з факторів агресивності і патогенності у мікробних збудників хвороб рослин є гідролітичні ферменти, які забезпечують ефективне розщеплення рослинних полімерів. Відомо, що важливою складовою захисного відповіді рослин на дію патогенів є утворення сполук, що пригнічують гідролітичну активність мікроорганізмів [1]. Численні дані свідчать про участь інгібіторів гидролаз в захисних реакціях рослин [2, 3], також показана можливість зміни балансу інгібіторів протеїназ в тканинах під впливом стресорів біотичної і абиотической природи [4-6]. Ймовірно, зміна рівня анти-ферментної активності є важливою частиною пристосувальних механізмів рослинного організму, зокрема, при інфікуванні патогенними організмами.

    В індукції і реалізації захисного відповіді в рослинному організмі беруть участь різні сигнальні системи. Виявлено важлива роль саліцилової і жасмонової кислот в якості сигнальних молекул (медіаторів) при розвитку захисних реакцій рослин [7]. В цьому плані дослідження ферментативних процесів, що відбуваються в тканинах, оброблених сигнальними молекулами на тлі зараження рослин патогенними мікроорганізмами, представляє безперечний науковий і практичний інтерес.

    У нашій роботі вимірювали рівень активності амілолітичних і протеолітичних ферментів, інгібіторів протеїназ в листі пшениці при зараженні збудником септоріозу і в калюсах картоплі при зараженні фітофторою на тлі впливу саліцилової (СК) і жасмонової (ЖК) кислот.

    експериментальна частина

    У дослідах використовували листя м'якої пшениці ТтШеіт агяйуиш Ь. сорту Башкирська 24, вирощені з предобработанних (3 ч) 10-6 М розчином СК (чда, «Реахим» (Росія) і 10-7 М розчином ЖК (чда, «Реахим» (Росія). Насіння попередньо пророщували на фільтрувальної папері при кімнатній температурі. Повністю розгорнуті листя 7-й добових проростків зрізали, поміщали у вологу камеру на фільтрувальну папір, зрізи прикривали ватою, змоченою в розчині бензимидазола (40 мг / л). Відрізки листя інокулював 2 мкл суспензії Пікноспори 8. пвйвтіт з розрахунку 106 спор / мл [8]. Інтенсивність розвитку гриба на епідермісі листя оцінювали через 96 годин після інокуляції.

    Як експлантов для отримання каллусов використовували відокремлені зелене листя пробіркових рослин картоплі сорту Рання троянда [9]. Під час експерименту отримані каллусов розкладали в чашки Петрі по поверхні твердої живильного середовища Мурасіге-Скуга (МС), що містить СК в кінцевій концентрації 0.05 мМ і ЖК (10-7 М). Контролем служили каллусов, що ростуть на середовищах МС. На 3 добу після першого пасажу каллусов інфікували 2 мкл суспензії зооспор PH. infestans (105 спор / мл). Інтенсивність розвитку фітофторозу оцінювали на 3-й і 10-у добу після інокуляції.

    Активність протеїназ та їх інгібіторів визначали спектрофотометрично по гідролізу хромогенного синтетичного субстрату БАПНА [10] і по гідролізу желатину, активність амілаз - по гідролізу крохмалю, іммобілізованих в гелі агарози [11].

    Результати та їх обговорення Вплив СК і ЖК на розвиток гриба пойогит на листках пшениці

    Спостереження за ростом гриба 8. пойвтіт на епідермісі листя показало, що ознаки розвитку

    * Автор, відповідальний за листування

    септоріозу в контрольних листках спостерігалися через 24 годин після інфікування у вигляді слабкого знебарвлення листя з подальшим їх побурінням, а через 72 годин після інокуляції симптоми септоріозу проявлялися у вигляді великих бурих плям (рис. 1а).

    На листі рослин, предобработанних СК і ЖК, симптоми хвороби були виражені значно слабше, ніж у листя контрольного варіанту (рис. 1 б, в). Як видно, передпосівна обробка насіння як СК, так і РК затримує розвиток гриба на листках протягом 72 год спостережень, що вказує на індукування стійкості пшениці до септоріозу в цих варіантах досліду.

    При ураженні пшениці патогенним грибом S. nodorum відбувається зміна рівня активності гідролітичних ферментів (табл. 1) та інгібіторів протеїназ в листі (рис. 2).

    Зокрема, при зараженні патогеном знижується рівень активності як гидролитических ферментів (амілаз, протеїназ), так і активність їх інгібіторів. Передобробка насіння пшениці індукторами стійкості істотно не впливає на рівень гидролитической і антіпротеіназном активності в листі незаражених рослин. Тоді як інфікування рослин, вирощених з пре-добработанних індукторами стійкості насіння, призводить до підвищення активності інгібіторів протеїназ в листі.

    Зміни в активності протеїназ, амілаз, і їх інгібіторів мають місце також при зараженні каллусов картоплі фітофторою на тлі обробки індукторами стійкості (табл. 2; рис. 3).

    Причому, активність протеолітичних, ами-лолітіческіх ферментів, а також їх інгібіторів змінюється як при зараженні фітофторою, так і

    під впливом обробки каллусов індукторами стійкості. Так, в інфікованих калюсах вже на початку взаємодії рослинних клітин з патогеном (3-добу після інокуляції) відбувається підвищення протеолітичної активності (табл. 2), і зниження активності інгібіторів протеїназ (рис. 3) Однак на 10-ту добу інфікування активність інгібіторів протеїназ в калюсах картоплі в усіх варіантах досліду ставала вище, ніж в контролі (табл. 2).

    Цікаво відзначити, що зараження каллусов супроводжується повним придушенням амілоліті-чеський активності в тканинах. У всіх варіантах з неінокулірованним матеріалом, в калюсах виявляється активність амілолітичних ферментів. Причому, обробка незаражених каллусов індукторами стійкості істотно підвищує рівень активності амілаз в незаражених тканинах. Навпаки, в заражених фітофторою калюсах, в т.ч. і при обробці СК і ЖК, активність амілаз не виявляється. Як уже зазначалося, гідролітичні ферменти, які продукують патогеном, грають важливу роль в їх вірулентності, забезпечуючи руйнування захисних бар'єрів клітинних стінок.

    Відомо, що амилолитическая активність характерна для представників більшості таксономічних груп грибів і майже завжди ці ферменти представлені конститутивним білками, навіть у дереворуйнівних грибів [12]. Однак амілаза відсутня у оомицетов, зокрема у грибів роду Phytophthora. Представники цього роду використовують для розщеплення крохмалю ферменти картоплі, активуючи їх біосинтез в уражених бульбах [13].

    а Б В

    Мал. 1. Прояв симптомів септоріозу на листках пшениці, оброблених саліцилової і жасмонової кислотами, через 72 годин після інокуляції. а - контроль, б - обробка СК, в - обробка ЖК.

    Таблиця 1

    Активність ферментів в листі пшениці Башкирська 24 при інфікуванні 8. пвйвгіт

    і обробці індукторами стійкості

    1 № | Варіант досліду | Активність протеїназ, ПЕ / мл | Активність амілаз, АЕ / мл |

    1 контроль 2.2 + 0.2 17.З ± 1.8

    2 S. nodorum 1.4 ± 0.1 8.8 ± 0.7

    З обробка СК 1.9 ± 0.1 17.5 ± 1. 8

    4 СК + S. nodorum 1.6 ± 0.07 12.7 ± 0.2

    5 обробка ЖК 1.9 ± 0.08 17.2 ± 1.8

    6 ЖК + S. nodorum 1.4 ± 0.05 8.8 ± 0.6

    варіант досліду

    Мал. 2. Активність інгібіторів протеїназ в листі пшениці при інфікуванні S. nodorum і обробці індукторами стійкості. 1 - контроль; 2 - S. nodorum; З - обробка СК; 4 - СК + S. nodorum; 5 - обробка ЖК; б - ЖК + S. nodorum.

    ? 3-х добові

    ? 10-ти добові

    про

    про

    га

    S

    ГЇ

    S

    S

    З00

    250

    200

    150

    100

    50

    и

    и

    1 2 3 4 5 6

    варіант досліду

    Мал. З. Активність інгібіторів протеїназ в калюсах картоплі, оброблених індукторами стійкості і заражених Ph. infestans. 1 - контроль; 2 - Ph. infestans; З - обробка СК; 4 - СК + Ph. infestans; 5 - обробка ЖК;

    б - ЖК + Ph. Infestans.

    Таблиця 2

    Активність ферментів в калюсах картоплі сорту Рання троянда, оброблених індукторами стійкості і заражених PH. infestans

    № Варіант досвіду Власна протеолітичнаактивність (желатин), ПЕ / мл Власна амилолитическая активність, АЕ / мл

    I 1 II I 1 II

    1 Контроль 1.9 + 0.01 9.75 ± 0.8 4.2 ± 0.0З 6.З ± 0.04

    2 Ph. infestans З.4 ± 0.0З 19.5 ± 1.2 0 0

    З Обробка СК 2.З ± 0.02 9.75 ± 0.7 6.2 ± 0.04 9.6 ± 0.5

    4 СК + Ph. infestans З.6 ± 0.02 18.25 ± 1.З 0 0

    5 Обробка ЖК 1.9 ± 0.01 12.5 ± 0.9 4.2 ± 0.02 19.6 ± 1.З

    б ЖК + Ph. infestans З.6 ± 0.0З 1З.75 ± 1.1 0 0

    Примітка: I - 3-ю добу після інфікування; II - 10-ту добу після інфікування

    0

    Таким чином, придушення активності власних гидролитических ферментів і підвищення рівня активності інгібіторів екзогенних гидролаз в тканинах може бути проявом захисних механізмів рослин при патогенезі.

    Робота проведена за фінансової підтримки гранту ФЦП «Наукові та науково-педагогічні кадри інноваційної Росії» на 2009-2013 роки проект ГК №16.740.11.0061 і РФФІ_поволжье_а № 11-04-97037.

    ЛІТЕРАТУРА

    1. Ярулліна Л. Г., Ібрагімов Р. І. Клітинні механізми формування стійкості рослин до грибних патогенів. Уфа: Гілем, 2006. 232 с.

    2. Мосолов В. В., Валуєва Т. А. Інгібітори протеїназ і їх функції у рослин (огляд) // Прикладна біохімія та мікробіологія. 2005. т.41. №3. С. 261-282.

    3. Ревіна Т. А., Г ерасімова Н. Г., Кладницький Г. В., Чаленко Г. І., Валуєва Т. А. Вплив білкових інгібіторів протеїназ з бульб картоплі на ріст і розвиток фітопатогенних мікроорганізмів // Прикладна біохімія та мікробіологія. 2008. Т. 44. №1. С. 101-105.

    4. Домаш В. І., Шарп Т. П., Забрейко С. А., Сосновська Т. Ф. Протеолітичні ферменти та інгібітори трипсину вищих рослин в умовах стресу // Біоорганічна хімія. 2008. Т. 1. № 3. С. 353-357.

    5. Фролова С. А., Титов А. Ф. Активність протеолітичних ферментів і інгібіторів трипсину в листі пшениці в початковий період дії і в послідуючі низькою закаливающей температури // Фізіологія рослин. 2008. №5. С. 549-552.

    6. Шпірний І. А., Ахатова А. Р., Цвєтков В. О., Ярулліна Л. М., Артем'єва М. А., Ібрагімов Р. І. Імуностимулюючий ефект препаратів-биорегуляторов при обробці бульб картоплі // Известия Самарського наукового центру Російської академії наук. 2011. Т. 13. №5 (3). С. 221-224.

    7. Тарчевский І. А. Сигнальні системи рослин. М .: Наука, 2002. 294 с.

    8. пижикових Г. В., Карасьова Є. В., Методика вивчення збудника септоріозу на ізольованих листі пшениці // З.-х. біологія. 1985. №12. С. 112-114.

    9. Калінін Ф. Л. Методи культури тканин в фізіології і біохімії рослин. К .: Наукова думка, 1980. 488 с.

    10. Erlanger B. F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. 1961. V. 95. №2. P. 271-278.

    11. Шпірний І. А., Умаров І. А., Шевченко Н. Д., Ібрагімов Р. І. Визначення активності гідролаз і їх інгібіторів з використанням субстратів, іммобілізованих в гелі агарози // Прикладна біохімія та мікробіологія. 2009. Т. 45, N 4. С. 497-501.

    12. Семенкова І. Г. Фитопатология. Дереворазрушающие гриби, гнилі і патологічні забарвлення деревини (визначальні таблиці). М .: ГОУВПОМГУЛ, 2008. 72 с.

    13. Беккер З. Е. Фізіологія і біохімія грибів. М .: Изд. МГУ, 1988. 230 с.

    Надійшла до редакції 16.05.2012 р.


    Ключові слова: гідролазами / інгібітори протеїнази / САЛІЦИЛОВА І жасмонової КИСЛОТИ / S. NODORUM / PH. INFESTANS / HYDROLASE / INHIBITORS PROTEINASE / SALICYLIC ACID AND JASMONIC ACID

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити