Проведена селекція клонів рекомбінантного штаму Yarrowia lipolytica, продукує інкапсульовану високотермостабільную фітаз Obesumbacterium proteus. Показано, що введення плазміди pUV3-Op не впливало на параметри росту і розвиток трансформантов. Визначено, що максимум фітазной активності досягався через 48 годин культивування та характеризувався широким оптимальним діапазоном значень рН (5,0-7,0). Був досліджений зростання трансформантов на мінімальному середовищі з використанням малоцінних рослинної сировини (макуха соняшникова, пшеничні висівки, подрібнена кукурудза) як єдине джерело фосфатів. В ході експерименту проаналізовано накопичення біомаси, фітазная активність і морфологія трансформантов Y. lipolytica. Зростання на середовищі, що містить макуха соняшнику, супроводжувався високим рівнем фітазной активності і накопиченням біомаси, в той час як культивування на середовищі, що містить дробленую кукурудзу в якості субстрату, зумовлювали значно нижчу концентрацію біомаси та рівень фітазной активності. У клітинах трансформантов, вирощених на рослинних фитат-містять субстратах, спостерігалося 3-4-кратне підвищення вмісту неорганічного фосфату в порівнянні з вихідним штамом Y. lipolityca. Проведені дослідження дозволяють зробити висновок, що протестований в наших дослідженнях трансформований штам Y. lipolityca Po1f (pUV3-Oр) має здатність до синтезу фітазою при культивуванні на фитат-містять середовищах і може бути використаний для отримання кормових добавок.

Анотація наукової статті по промисловим біотехнологій, автор наукової роботи - Сердюк Єлизавета Геннадіївна, Ісакова Олена Павлівна, Гесслер Наталія Миколаївна, Антипов Олексій Миколайович, Дерябіна Юлія Іванівна


Activity phytases in recombinant strains Yarrowia lipolytica under different conditions of cultivation

The selection of some clones of the recombinant Yarrowia lipolytica yeast producing an encapsulated high-temperature phytase of Obesumbacterium proteus has been performed. The introduction of the pUV3-Op plasmid affected on neither growth parameters nor development of transformants. The maximum phytase activity was rached after 48 hours of cultivation and showed a wide optimal pH range (5.0-7.0). The growth of transformants in the poor medium using low-value plant raw materials (sunflower meal, wheat middling, crushed corn) as the sole source of phosphates has been studied. During the experiment, biomass accumulation, phytase activity and morphology of the Y. lipolytica transformants were tested. Growth in the sunflower meal containing medium was accompanied by a high level of phytase activity and biomass yield while the cultivation in crushed corn containing medium led to significantly lower level of biomass yield and phytase activity. In the cells of transformants grown using the plant phytate-containing substrates the 3-4 fold increase in inorganic phosphate content was observed compared to that in the initial Y. lipolityca yeast. This study let us conclude that the transformed Y. lipolityca Po1f (pUV3-Op) yeast tested is capable of synthesizing phytase when cultivated in phytate-containing media and can be used to produce fodder additives.


Область наук:
  • промислові біотехнології
  • Рік видавництва: 2018
    Журнал
    Бюлетень науки і практики
    Наукова стаття на тему 'АКТИВНІСТЬ фітаз В РЕКОМБІНАНТНИХ штамів YARROWIA LIPOLYTICA ПРИ РІЗНИХ УМОВАХ культивування'

    Текст наукової роботи на тему «АКТИВНІСТЬ фітаз В РЕКОМБІНАНТНИХ штамів YARROWIA LIPOLYTICA ПРИ РІЗНИХ УМОВАХ культивування»

    ?БІОЛОГІЧНІ НА УКІ / BIOLOGICAL SCIENCES

    УДК 577.218 AGRIS F30

    АКТИВНІСТЬ фітаз В РЕКОМБІНАНТНИХ штамів YARROWIA LIPOLYTICA ПРИ РІЗНИХ УМОВАХ культивування

    © Сердюк Є. Г., ФІЦБіотехнологіі РАН, Москва, Росія, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Ісакова Е. П., SPIN-код: 1736-8167, канд. біол. наук, Фіц Біотехнології РАН,

    м Москва, Росія, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Гесслер Н. Н., канд. біол. наук, Фіц Біотехнології РАН, Москва, Росія, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Антипов А. Н., SPIN-код: 5565-7074, канд. біол. наук, Фіц Біотехнології РАН,

    м Москва, Росія, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Дерябіна Ю. І., SPIN-код: 8599-0143, канд. біол. наук, Фіц Біотехнології РАН,

    м Москва, Росія, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    ACTIVITY PHYTASES IN RECOMBINANT STRAINS YARROWIA LIPOLYTICA UNDER DIFFERENT CONDITIONS OF CULTIVATION

    © Serdyuk E., Institute of Biochemistry of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Issakova E., SPIN-code: 1736-8167, Ph.D., Institute of Biochemistry of the Russian Academy

    of Sciences, Moscow, Russia, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Gessler N., Ph.D., Institute of Biochemistry of the Russian Academy of Sciences,

    Moscow, Russia, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Antipov A., SPIN-code: 5565-7074, Ph.D., Institute of Biochemistry of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. © Deryabina Yu. , SPIN-код: 8599-0143, Ph.D., Institute of Biochemistry of the Russian Academy

    of Sciences, Moscow, Russia, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Анотація. Проведена селекція клонів рекомбінантного штаму Yarrowia lipolytica, що продукує інкапсульовану високотермостабільную фітаз Obesumbacterium proteus. Показано, що введення плазміди pUV3-Op не впливало на параметри росту і розвиток трансформантов. Визначено, що максимум фітазной активності досягався через 48 годин культивування та характеризувався широким оптимальним діапазоном значень рН (5,07,0). Був досліджений зростання трансформантов на мінімальному середовищі з використанням малоцінних рослинної сировини (макуха соняшникова, пшеничні висівки, подрібнена кукурудза) як єдине джерело фосфатів. В ході експерименту проаналізовано накопичення біомаси, фітазная активність і морфологія трансформантов Y. lipolytica. Зростання на середовищі, що містить макуха соняшнику, супроводжувався високим рівнем фітазной активності і накопиченням біомаси, в той час як культивування на середовищі, що містить дробленую кукурудзу в якості субстрату, зумовлювали значно нижчу концентрацію біомаси та рівень фітазной активності. У клітинах трансформантов, вирощених на рослинних фитат-містять субстратах, спостерігалося 3-4-кратне підвищення вмісту неорганічного фосфату в порівнянні з вихідним штамом Y. lipolityca. Проведені дослідження дозволяють зробити висновок, що протестований в наших дослідженнях трансформований штам Y.

    lipolityca Polf (pUV3-Op) має здатність до синтезу фітазою при культивуванні на фитат-містять середовищах і може бути використаний для отримання кормових добавок.

    Abstract. The selection of some clones of the recombinant Yarrowia lipolytica yeast producing an encapsulated high-temperature phytase of Obesumbacterium proteus has been performed. The introduction of the pUV3-Op plasmid affected on neither growth parameters nor development of transformants. The maximum phytase activity was rached after 48 hours of cultivation and showed a wide optimal pH range (5.0-7.0). The growth of transformants in the poor medium using low-value plant raw materials (sunflower meal, wheat middling, crushed corn) as the sole source of phosphates has been studied. During the experiment, biomass accumulation, phytase activity and morphology of the Y. lipolytica transformants were tested. Growth in the sunflower meal containing medium was accompanied by a high level of phytase activity and biomass yield while the cultivation in crushed corn containing medium led to significantly lower level of biomass yield and phytase activity. In the cells of transformants grown using the plant phytate-containing substrates the 3-4 fold increase in inorganic phosphate content was observed compared to that in the initial Y. lipolityca yeast. This study let us conclude that the transformed Y. lipolityca Po1f (pUV3-Op) yeast tested is capable of synthesizing phytase when cultivated in phytate-containing media and can be used to produce fodder additives.

    Ключові слова: Yarrowia lipolytica, інкапсульована фітаза, Obesumbacterium proteus.

    Keywords: Yarrowia lipolytica, encapsulated phytase, Obesumbacterium proteus.

    Вступ

    Для повноцінного росту і розвитку сільськогосподарських тварин необхідний фосфор, основним джерелом якого є фитат рослин. Вивільнення фосфатів здійснюється за участю ферментів фітаз, але доступність фосфору при дії рослинних фітаз не перевищує 10%. Обробка рослинних кормів фітаз мікробного походження підвищує вихід продукції без витрат на внесення мінеральних фосфатів і зменшує забруднення грунтів і водойм фосфатами [1].

    Однак, збагачення кормів ферментами ускладнюється через обов'язкової термічної обробки препаратів, що обумовлює необхідність отримання фітаз, що зберігають ферментативну активність після нагрівання до +70 ° C і вище. Крім того, ферментний препарат повинен зберігати високу питому активність в умовах шлунково-кишкового тракту тварин (температурний оптимум близько +42 ° C, рН 3,0-5,0). Існуючі в даний час термостабільні ферментні препарати грибного походження активні при кислих значеннях рН, що робить їх неефективними в кишечнику тварин. Зручним підходом для створення ферментних препаратів є метод з використанням репортерного гена інкапсульованою фітазою.

    При розробці нових фітазних препаратів необхідно також враховувати безпеку використовуваних продуцентів. Дріжджі Yarrowia lipolytica є перспективним об'єктом для створення інкапсульованих фітаз, так як мають високу стійкість до змін значень рН середовища культивування, стійкі до окислювального стресу, а також здатні до ферментації різноманітного малоцінного сировини [2]. Використання фітаз бактеріального походження дозволяє отримати препарати з високою активністю в широкому діапазоні значень рН. Однак бактеріальні фітазою не володіють достатньою

    термостабильностью [3]. У зв'язку з цим представляє великий інтерес використання нейтрофильной фітазою з Obesumbacterium proteus, що зберігає ферментативну активність в широкому діапазоні значень рН (від 1,5 до 6,5) і температурі +45 ° C [4]. Створення інкапсульованих рекомбінантних фітаз на основі дріжджових клітин дозволяє підвищити терморезистентность ферментного препарату і захистити його від руйнівної дії шлункових ферментів тварин. При виборі об'єкта-господаря слід враховувати його здатність до ферментації різного роду субстратів, а також стійкість до дії різних стресових чинників.

    У нашій попередній роботі [5] описано отримання нового рекомбінантного штаму Y. lipolytica, що продукує інкапсульовану високотермостабільную фітаз O. proteus. Завдяки видаленню секреторного лідерних пептиду з послідовності гена ОРР, реалізованому при конструюванні плазміди pUV3-Op, продукту додана здатність накопичуватися в цитоплазмі рекомбінантного продуцента, а не секретироваться в середу культивування. Показано, що за рівнем продукції фітазою штам Y. lipolytica POlf (pUV3-Op) в середньому на 30% поступався секреторному продуцента ВКПМ Y-3852. Також показано, що при короткочасному нагріванні дріжджовий біомаси до +70 ° С активність фітазою зменшувалася не більше ніж на 27% від початкового. Отже, термостабільність інкапсульованого ферменту виявилася достатньою для його застосування при виготовлення кормів для сільськогосподарських тварин.

    Метою представленої роботи було вивчення властивостей отриманих трансформантов з внутрішньоклітинної локалізацією фітазою на основі дріжджів Y. lipolytica, в різних умовах культивування.

    Матеріал і методи дослідження

    Об'єкт дослідження. Об'єктом дослідження є штам Y. lipolytica POlf, трансформований генетичної конструкцією pUV3-Op. Клонування гена нейтрофильной фітазою з Obesumbacterium proteus здійснювалося за допомогою ПЛР на матриці геномної ДНК O. proteus ВКПМ-5477 з праймерами OPP-forl (BamHI) і OPP-revl (NotI), як описано в роботі [5].

    Культивування штаму. Культивування трансформованих дріжджів Y. lipolytica проводили в наступних умовах: тверда середовище для культивування містила (г / л): дріжджовий екстракт DIFCO - 2,5; бактопептон - 5; агар - 20; гліцерин - 7,5; мальт-екстракт - 3. рН середовища 5.5; твердого середовища YPD для культивування трансформантов містила (г / л): дріжджовий екстракт - 10; агар - 20; глюкоза - 10; пептони - 20; рідке середовище YPD для культивування трансформантов містила (г / л): дріжджовий екстракт - 10; глюкоза - 10; пептони - 20; мінімальна середовище для росту на рослинних субстратах містила (г / л): MgSO4 7H2O - 0,5; NaCl - 0,1; CaCh - 0,05; (NH4) 2SO4 - 0,3; глюкоза - 10; рослинний субстрат - 2. В якості рослинного субстрату використовувався макуха соняшнику, подрібнена кукурудза, висівки пшеничні. Тверда середовище для чашкового тесту містила: трис-ацетатний буфер (200 мМ) - 25 мл; агар-агар - 0,25 г; хлористий кальцій (5%) - 2,5 мл; фитат натрію Sigma - 0,5 м фітати натрію і розчин хлористого кальцію додавали після стерилізації в готову охолоджену трис-агарове середовище.

    Підготовка гомогенатов для визначення фітазной активності. Клітини дріжджів облягали центрифугуванням при 4000 об / хв протягом 5 хв, двічі промивали холодною дистильованою водою. Потім біомасу руйнували в рідкому азоті. Для отримання ферментного препарату зруйновану біомасу змішували з Na-ацетатним

    буфером (рН 6,2) в співвідношенні 1: 5 і центрифугували при 12000 об / хв протягом 20 хв. Для досліджень використовували супернатант.

    Визначення фітазной активності за змістом вільних фосфатів з утворенням фосфорномолібденовокіслого амонію за методом Грайнера. Реакційна суміш містила 100 мкл фітати натрію (10 мМ), 250 мкл №-ацетатного буфера (100 мМ, рН 4.5), 50 мкл розчину ферменту. Суміш інкубували протягом 30 хв при температурі +37 ° С. Реакцію зупиняли додаванням 1,5 мл свіжоприготованого гептомолібдата амонію (10 мМ), розчином 5N сірчаної кислоти і ацетоном у співвідношенні 1: 1: 2. Вимірювали оптичну щільність отриманих зразків при довжині хвилі ^ = 355 нм проти контролю (1500 мкл реагенту і 500 мкл дистильованої води). За одиницю активності приймали кількість ферменту, що розщеплює фитат натрію з утворенням 1 мкмоль неорганічного фосфату (Р ^ за одну хвилину.

    Визначення фітазной активності чашковим тестом. У застиглої твердому середовищі для чашкового тесту пробивали лунки діаметром 5 мм, в які вносили по 10 мкл гомогенату. Чашки витримували при кімнатній температурі 24 ч. Для появи зон просвітління. Фітазную активність оцінювали по діаметру зон просвітління твердого середовища [6].

    Оцінка фітазной активності методом нашивними електрофорезу в поліакриламідному гелі. Нативний електрофорез проводили на пластинах розміром 11x11см в градієнтному поліакриламідному гелі (5-20% поліакриламіду) в трис-НС1 буфері, рН 8.8, як описано в роботі [7]. Фітазная активність виявлялася наявністю ортофосфатов шляхом інкубації гелів протягом 16 год в 0,1 М ацетатному буфері (рН 5,0), що містить 0,4% (мас / об.) Фітати натрію. Смуги активності візуалізувалися шляхом занурення гелю в водний 2% (мас. / Об.) Розчин хлориду кобальту. Після 5-хвилин інкубації при кімнатній температурі розчин хлориду кобальту замінювали свіжоприготовленим розчином, що містить рівні об'єми 6,25% (мас. / Об.) Водного розчину молібдату амонію і 0,42% (мас. / Об.) Розчину ванадату амонію. Активність фітазою оцінювалася як зони просвітління на непрозорому тлі [8].

    Визначення кількості білка. Визначення кількості білка в екстрактах дріжджів У. Иро1уИса. Для визначення кількості білка використовували метод Бредфорд з Кумассі G-250.

    Результати та обговорення

    Визначення фітазной активності в трансформанта дріжджів У. Іро1уИса. На першому етапі роботи було проведено аналіз фітазной активності отриманих трансформантов різними методами. Все трансформанти були вирощені на рідкому середовищі YPD при рН 5,5 протягом 24 годин при температурі +28 ° С. Визначення фітазной активності за методом Грайнера, який заснований на кількісному вимірі вільних Р ^ утворилися в ході реакції, показало, що найбільша активність спостерігалася у трансформанта №17 (1,11 мкмоль Pixмінx1 г 1 сирої біомаси), найнижча активність - у трансформанта №13 (0,23 мкмоль р ^ мінх1 г 1 сирої біомаси) (Малюнок 1). У трансформанта №1 була дуже низька швидкість росту, тому в подальшому в дослідженнях він не використовувався. Решта трансформанти показали подібні значення активності в діапазоні від 0,37до 0,52 Pixмінx1 г 1 сирої біомаси (Малюнок 1).

    2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

    Малюнок 1. Активність фітазою у трансформантов дріжджів штаму Y. lipolytica PO1f. Все трансформанти культивувалися на середовищі YPD протягом 24 годин. Цифри на осі абсцис (2-22) - номера трансформантов. Фітазная активність розраховувалася в мкмоль Pixмінx1 г 1 сирої біомаси. Представлені дані отримані в результаті обрахунку трьох незалежних визначень. Стандартне відхилення показано для кожного варіанта.

    Для трансформантов, у яких фітазная активність перевищувала 0,6 мкмоль Pixмінx1 г 1 сирої біомаси, був проведений тест на чашках Петрі для первинного визначення фітазной активності. Як негативний контролю виступав вихідний штам У. lipolytica РО1? (Малюнок 2). За результатами цих первинних тестів для подальших досліджень були обрані клони №9; 10; 11; 13; 17.

    Малюнок 2. Оцінка активності фітазою в гомогенатах біомаси трансформантов Y. lipolytica PO1f, несучих інтегровану конструкцію pUV3-Op. Зони просвітління навколо внесених в лунки гомогенатов трансформантов (30 мкл), зроблені в агаризованому середовищі з 1% -ним фітати як джерело фосфатів, свідчили про наявність фітазной активності. Фітазную активність трансформантов оцінювали в чашково тесті по діаметру зон просвітління суспензії фітати кальцію (див. Розділ Матеріал і методи дослідження).

    Для електрофоретичного визначення фітазной активності використовували ферментний препарат, виділений з клітин трансформанта №17. Культуру вирощували на стандартному середовищі YPD протягом 48 годин, ферментний препарат отримували шляхом руйнування клітин трансформантов рідким азотом з наступним центрифугуванням для отримання клітинного екстракту. Спочатку забарвлення гелю для виявлення фітазной активності проводили за методом [8]. Цей метод заснований на реакції звільнився в ході фітазной реакції Pi з хлоридом кобальту з подальшою обробкою сумішшю молибдата і ванадату амонію. Присутність білків, що володіють фітазной активністю, візуалізується при прояві забарвлення отриманого хлориду гексааммінкобальта ([Со (И Н3) 6] С12), водний розчин якого має рожевий відтінок. При цьому локалізацію ферменту визначають за положенням безбарвної зони на тлі непрозорого гелю, яка обумовлена ​​утворенням нерозчинних фосфатів кобальту. Однак, при застосуванні класичного методу зона локалізації фітазою виявлялася погано помітна внаслідок недостатньої контрастності. На рисунку 3. А спостерігається слабовираженная безбарвна зона на блідо-рожевому тлі. Методика була оптимізована за рахунок внесення в реакційну середу солі кобальту. В результаті взаємодії солі кобальту з гідроксидом амонію утворювався гідроксид кобальту, який фарбував гель в синьо-зелений колір (Малюнок 3. Б). Зона, де утворювався фосфат, проявлялася у вигляді безбарвного плями, що було обумовлено утворенням нерозчинного комплексу фосфату кобальту. Варіюючи тривалість обробки, температуру прояви і концентрацію розчину обробки, вдалося посилити контрастність зони фітазной активності і отримати синьо-зелене забарвлення гелю з чітко помітною зоною локалізації фітазою. (Малюнок 3. Б). Найбільш виражений результат був досягнутий під час обробки гелю при кімнатній температурі протягом 2 годин, з візуальним контролем ходу реакції.

    Малюнок 3. Електрофоретичний профіль фітазою в ПААГ. А - прояв забарвлення при обробці суміші молибдата і ванадату амонію. Б - прояв забарвлення при обробці гідроксидом амонію. Ферментний препарат наносили в кількості 40 мкл на один трек, що відповідало 30 мкг білка.

    Раніше при дослідженні залежності фітазной активності від значення рН інкубаційного середовища, було отримано два близьких максимуму значень активності фітазою (при рН 5,0 і 7,0). Наявність однієї зони просвітління на електрофореграмме, дозволяє висловити припущення, що вираженою фітазной активністю в клітинах трансформантов володіє один фермент.

    Дослідження залежності фітазной активності від часу зростання культури. Для відібраних трансформантов була проведена порівняльна оцінка їх зростання на стандартній рідкому середовищі з використанням колб Ерленмейера і побудовані криві зростання з розрахунком питомої швидкості росту (ц), згідно з якою вихід в стаціонарну фазу росту спостерігався через 18 годин культивування (Малюнок 4).

    100

    lg X

    10

    0,1

    0,01

    9

    10 11 13 17

    0

    10

    20

    30

    40

    50

    60

    Час, ч

    Малюнок 4. Криві зростання культур трансформантов Y. lipolytica PO1f в процесі культивування на середовищі YPD. Оптичну щільність суспензії визначали при X = 590 нм. 9; 10; 11; 13 і 17 - номера трансформантов. Представлені результати трьох незалежних визначень.

    З рисунка 4 видно, що зростання всіх відібраних клонів відбувався досить рівномірно з переходом в стаціонарну фазу через 16 годин культивування. Це вказувало на те, що введення плазміди рЦУЗ-Ор не впливало на ріст і розвиток отриманих трансформантов. Для експоненційної фази росту була розрахована питома швидкість росту (ц) і час подвоєння клітинної маси які наведені в Таблиці.

    Таблиця.

    ПАРАМЕТРИ ЗРОСТАННЯ трансформанта Y. LIPOLYTICA PO1F

    Зразок І, ч 1 & ч Час виходу в стаціонарну фазу росту, ч

    Трансформант №9 0,50 ± 0,001 1,45 ± 0,05 16

    Трансформант №10 0,41 ± 0,02 1,74 ± 0,03 17

    Трансформант №11 0,43 ± 0,02 1,68 ± 0,06 16

    Трансформант №13 0,43 ± 0,01 1,69 ± 0,06 16

    Трансформант №17 0,55 ± 0,01 1,31 ± 0,05 18

    Наведені дані підтверджують, що накопичення біомаси у всіх трансформантов відбувалося з близькими за своїми значеннями швидкостями росту. Це свідчило, по-видимому, про подібність основних метаболічних шляхів і відсутності впливу даної плазміди на швидкість росту трансформантов. Далі було проведено дослідження зміни фітазной активності трансформантов на різних стадіях росту. Як випливає з рисунка 4, вихід в стаціонарну стадію у всіх досліджуваних культур спостерігався через 16 годин культивування. Графік залежності активності фітазою від часу і стадії росту,

    1

    показує, що до 24 години росту спостерігалося деяке зниження активності у всіх трансформантов (Малюнок 5). В ході подальшого зростання було відзначене підвищення фітазной активності, максимум якої досягався до 48-54 годинах зростання. Варто відзначити, що активність трансформанта №17 стрімко збільшувалася в стаціонарній фазі росту, в той час як активність інших зразків була істотно нижче. Можливо це пов'язано з активацією промотора "Увас в умовах окисного стресу, викликаного вичерпанням основних субстратів.

    про

    L-

    §

    * До

    до

    л

    ч о

    0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02

    0,01 0,005

    10 11 13 17

    10

    20

    30 40

    Час, ч

    50

    60

    70

    Малюнок 5. Зміна фітазной активності трансформантов в процесі росту культури на середовищі YPD. 9; 10; 11; 13 і 17 - номера трансформантов. Представлені дані отримані в результаті обрахунку трьох незалежних визначень. Стандартне відхилення показано для кожного варіанта.

    Дослідження фітазной активності при зростанні трансформантов на рослинних субстратах. Відомо, що Y. 11ро1уИса здатна рости на самих різних рослинних субстратах, які використовуються в якості кормів для сільськогосподарських тварин. У даній роботі була перевірена здатність отриманих трансформантов рости на низькосортних субстратах: макусі соняшника, подрібнений кукурудзі, висівках пшениці.

    На рисунку 6 представлені мікрофотографії клітин трансформантов і вихідного штаму К. 11ро1уИса, вирощених на різних субстратах. Як видно з отриманих даних, морфологія К. Іро1уіса не змінювалася значних змін. При зростанні трансформантов на рослинних субстратах спостерігалися деякі морфологічні зміни. Зростання на середовищі, що містить макуха соняшнику (2%), викликав освіту псевдомицелия, а при культивуванні на інших рослинних субстратах (подрібнений кукурудзі і висівках пшениці) було зареєстровано поява веретеноподібних клітин. У порівнянні з вихідним штамом К. 11ро1уИса, кількість клітин трансформантов в 1 мл культуральної рідини було в 3-4 рази менше (Малюнок 6).

    9

    0

    0

    Малюнок 6. Мікрофотографії клітин трансформантов і вихідного штаму Y. lipolytica при зростанні на різних рослинних субстратах: 1 - трансформант №10; 2 - трансформант №17; 3 - вихідний штам Y. lipolytica. a - макуха соняшникова; Ь -дробленая кукурудза; з - пшеничні висівки. Біомаса дріжджів була зібрана в стадії глибокого стаціонару (48 год культівіврованія), розлучена в 10 разів і піддана мікроскопірованію при збільшенні х40.

    -Ф-9 -я-10 -17 ^^ У. Про1уйса

    Малюнок 7. Дінамікка накопичення біомаси клітин при зростанні на середовищах з різними рослинними субстратами: А - макуха соняшникова; Б - дроблена кукурудза. 9, 10, 17 - номера трансформантов. В якості контролю використовувався вихідний штаммма До lipolytica.

    Як видно з рисунка 7, всі досліджувані культури на макусі соняшника росли в 23 рази краще, ніж на роздробленої кукурудзі, що може бути пов'язано з важкодоступністю кукурудзи в якості субстрату. Таким чином, зростання на макусі соняшника супроводжувався більш високим рівнем накопичення біомаси клітин і, отже, збагаченням рослинної сировини мікробним білком, а також підвищенням цінності кормів.

    Далі було доцільним оцінити вплив екстрацелюлярний фосфатаз на вміст фосфатів в культуральної рідини при вирощуванні досліджуваних культур на фитат-містять середовищах. Культивування проводили на макусі соняшника, подрібнений кукурудзі і висівках пшениці. Для порівняння наведені дані про накопичення фосфатів в культуральної рідини при зростанні даних культур на стандартному середовищі (Малюнок 8). Як випливає з отриманих результатів, при культивуванні на фитат-містять середовищах вміст фосфатів в культуральної рідини збільшувалася при використанні в якості субстрату макухи соняшнику і висівок пшениці, в порівнянні зі стандартною середовищем (Малюнок 8). Це свідчило про активацію фосфатаз в умовах нестачі фосфатів. Слід зазначити, що при культивуванні на середовищі з макухою соняшника в якості субстрату найбільше накопичення фосфатів відбувалося у трансформанта №17. У той же час при культивуванні на середовищі з висівками пшениці в якості субстрату відзначалося збільшення накопичення фосфатів в культуральної рідини У. Иро1уІса. Низький рівень накопичення фосфатів при зростанні на середовищі з роздробленої кукурудзою узгоджувався з показаним раніше низьким накопиченням біомаси на цьому субстраті (Малюнок 7. Б).

    120,00 100,00 80,00

    60,00

    до

    Д 40,00

    л

    «

    § 20,00

    0,00

    Z. 10? 17

    1 - I Y. lipolytica

    I

    щ I п L ^ ii 1 1 + 1

    Макуха соняшника подрібнене кукурудза Висівки пшениці

    YPD

    Малюнок 8. Зміст Pi в культуральної рідини при зростанні трансформантов і вихідного штаму Y. lipolytica на рослинних субстратах (стадія глибокого стаціонару, час культивування 48 год). 10; 17 - номера трансформантов. В якості контролю використовували оцінку вмісту фосфатів в культуральної рідини при зростанні на стандартному середовищі (час культивування 48 год).

    У цих умовах була проведена порівняльна оцінка активності екстрацеллюлазних фосфатаз трансформантов У. Іро1уИса (Малюнок 9) Високий рівень фітазной активності у трансформантов спостерігався при культивуванні на стандартному середовищі. Дещо менший рівень фітазной активності проявлявся на середовищах з рослинною сировиною в якості субстрату. На всіх випробуваних середовищах рівень фітазной активності у трансформанта №17 був в 2 рази вище. Фітазная активність вихідного штаму У. Іро1уИса була найменшою і практично не змінювалася в залежності від субстрату.

    0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

    10

    17 HY.lipolytica

    Макуха подсолнечнікаДроблёная кукурудза Висівки пшениці

    YPD

    Малюнок 9. Порівняльна активність фітазою в 1 мл культуральної рідини при зростанні трансформантов і вихідного штаму Y.lipolytica на рослинних субстратах. 10; 17 - номера трансформантов. Для контролю наведені дані по фітазной активності при зростанні на стандартному середовищі (стадія глибокого стаціонару, час культивування 48 год).

    Можна припустити, що низький рівень накопичення Pi в культуральної рідини при зростанні на стандартному середовищі обумовлений більш високою швидкістю приросту біомаси і витратою утворився Pi для забезпечення потреби культури. Низький вміст Pi в культуральної рідини трансформантов і дикого штаму Y. lipolytica, вирощуваних на середовищах, що містять дробленую кукурудзу в якості субстрату, спостерігалося незважаючи на наявність вираженої фітазной активності. Це можна пов'язати з наявністю інших факторів, що інгібірує, на зростання культури.

    Представлені дані демонструють наявність екстрацеллюлярной фітазной активності культуральної рідини як у трансформантов, так і у вихідного штаму Y. lipolytica, причому найбільшу фітазную активність виявляв трансформант №17. Таким чином, культивування трансформантов, експресованих плазмидой pUV3-Op, на фитат-містять субстратах супроводжувалося збільшенням внутрішньоклітинного вмісту вільних Pi в порівнянні з вихідним штамом Y. lipolytica. Слід зазначити, що при зростанні на макусі соняшника цей ефект проявлявся у обох трансформантов, тоді як при зростанні на роздробленої кукурудзі - тільки у трансформанта №10. Можливо, це пов'язано з різною локалізацією плазміди в геномі. З огляду на вищенаведені дані, очевидно, що найбільша фітазная активність отримана для трансформанта №17 при його культивуванні на макусі соняшника протягом 48 годин.

    висновок

    Таким чином, в представленій роботі була проведена селекція штамів-трансформантов поліекстромофільних дріжджів Y. lipolytica, модифікованих плазмидой pUV3-Op з геном інкапсульованою фітазою з O. proteus, як промотора в якій був використаний ген мітохондріального порінов VDAC. Отримані трансформанти були перевірені на наявність фітазной активності і клони, які показали найвищий рівень ферментативної активності, були відібрані для подальших досліджень. Культивування трансформантов в різних умовах показало, що введення плазміди pUV3-Op не впливало на параметри росту і розвиток трансформантов. Був досліджений зростання трансформантов на мінімальному середовищі з використанням малоцінних рослинної сировини в якості єдиного джерела фосфатів. В ході експерименту було проаналізовано

    накопичення біомаси, фітазная активність і морфологія трансформантов дріжджів Y. lipolytica. Зростання на середовищі з субстратом у вигляді макухи соняшнику супроводжувався високим рівнем фітазной активності і накопиченням біомаси, в той час як в результаті культивування на середовищі, що містить дробленую кукурудзу в якості субстрату, концентрація біомаси була не такою високою, а рівень активності фітазою значно не відрізнявся від активності при зростанні в середовищі з макухою соняшника. Імовірно це пов'язано з більш високим рівнем важкодоступність роздробленої кукурудзи в якості субстрату.

    Таким чином, результатом даної роботи є створення продуцента рекомбінантної інкапсульованою фітазою з O. proteus на основі дріжджів Y. lipolytica, здатного до ферментації малоцінного рослинної сировини в якості джерела фосфатів, який може успішно застосовуватися для отримання кормових добавок для сільськогосподарських тварин.

    Список літератури:

    1. Гесслер Н. Н., Сердюк, Е. Г., Ісакова, Є. П., Дерябіна, Ю. І. фітаз і перспективи їх застосування (огляд) // Прикладна біохімія та мікробіологія. 2018. Т. 54. №4. С. 347 356.

    2. Madzak C. Engineering Yarrowia lipolytica for Use in Biotechnological Applications: A Review of Major Achievements and Recent Innovations // Molecular Biotechnology. 2018. P. 1-15. doi: 10.1007 / s12033-018-0093-4.

    3. Синіцина О. А., Федорова Е. А., Гусаков А. В., Упоров І. В., Соколова Л. М., Бубнова Т. М., Окунєв О. Н., Чулкин А. М., Винецкая Ю. П., Синіцин А. П. Виділення і властивості позаклітинної фітазою А Penicillium canescens // Біохімія. 2006. Т. 71. №9. С. 12601268.

    4. Zinin N. V. Serkina A. V., Gelfand M. S., Shevelev A. B., Sineoky S. P. Gene Cloning, Expression and Characterization of Novel Phytase from Obesumbacterium proteus // FEMS Microbiol Lett. 2004. V. 236. №2. P. 283-90.

    5. Isakova E. P., Serdyuk E. G., Gessler N. N., Trubnikova E. V., Biryukova, Y. K., Epova E. Y., Deryabina Y. I., Nikolaev A. V. А New Recombinant Strain of Yarrowia lipolytica Producing Encapsulated Phytase from Obesumbacterium proteus // Doklady Biochemistry and Biophysics. 2018. V. 481. Р. 201-204.

    6. Гордєєва Т. Л., Борщевська Л. Н., Калініна А. Н., Синьоокий С. П. та ін. Порівняльний аналіз ефективності експресії генів бактеріальних фітаз в дріжджах Pichiapastoris за допомогою чашкового тесту // Біотехнологія. 2017. Т. 33. №6. С. 83-88.

    7. Davis J. B. Disk electrophoresis II-Method and application to human serum proteins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-427.

    8. Bae H. D., Yanke L. J., Cheng K.-J. Selinger L. B. A novel staining method for detecting phytase activity // Journal of Microbiological Methods. 1999. V. 39. P. 17-22.

    References:

    1. Gessler, N. N., Serdyuk, E. G., Isakova, E. P., & Deryabina, Y. I. (2018). Phytases and their Promising Application. Applied Biochemistry and Microbiology, 54 (4), 347-356.

    2. Madzak, C. (2018). Engineering Yarrowia lipolytica for Use in Biotechnological Applications: A Review of Major Achievements and Recent Innovations. Molecular Biotechnology, 1-15. doi: 10.1007 / s12033-018-0093-4.

    3. Sinitsyna, O. A., Fedorova, E. A., Gusakov, A. V., Uporov, I. V., Sokolova, L. M., Bubnova, T. M., Okunev, O. N., Chulkin, A. M., Vinetsky, Y. P., & Sinitsyn, A. P. (2006). Isolation and Characterization of Extracellular Phytase a from Penicillium canescens. Biochemistry, 71 (9), 12601268.

    4. Zinin, N. V., Serkina, A. V., Gelfand, M. S., Shevelev, A. B. & Sineoky, S. P. (2004) Gene Cloning, Expression and Characterization of Novel Phytase from Obesumbacterium proteus. FEMS Microbiology Letters, 236 (2), 283-290.

    5. Isakova, E. P., Serdyuk, E. G., Gessler, N. N., Trubnikova, E. V., Biryukova, Y. K., Epova, E. Y., Deryabina, Y. I., & Nikolaev, A. V. (2018). A New Recombinant Strain of Yarrowia lipolytica Producing Encapsulated Phytase from Obesumbacterium proteus. Doklady Biochemistry and Biophysics, 481 (1), 201-204.

    6. Gordeeva, T. L., Borshchevskaya, L. N., Kalinina, A. N., Sineoky, S. P., Voronin, S. P., & Kashirskaya, M. D. (2017). Comparative Analysis in Plate Test of Expression Efficiency of Genes for Bacterial Phytases in Pichia pastoris yeast. Biotechnology, 33 (6), 83-88. (In Russian).

    7. Davis, J. B. (1964). Disk electrophoresis II-Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404-427.

    8. Bae, H. D., Yanke, L. J., Cheng, K.-J., & Selinger, L. B. (1999). A novel staining method for detecting phytase activity. Journal of Microbiological Methods, 39, 17-22.

    Робота надійшла Прийнята до публікації

    до редакції 18.09.2018 р 23.09.2018 р.

    Посилання для цитування:

    Сердюк О. Г., Ісакова Е. П., Гесслер Н. Н., Антипов А. Н., Дерябіна Ю. І. Активність фітазою в рекомбінантних штамах Yarrowia lipolytica при різних умовах культивування // Бюлетень науки і практики. 2018. Т. 4. №10. С. 18-30. Режим доступу: http://www.bulletennauki.com/serdyuk (дата звернення 15.10.2018).

    Cite as (APA):

    Serdyuk, E., Issakova, E., Gessler, N., Antipov, A., & Deryabina, Yu. (2018). Activity phytases in recombinant strains Yarrowia lipolytica under different conditions of cultivation. Bulletin of Science and Practice, 4 (10), 18-30. (In Russian).


    Ключові слова: YARROWIA LIPOLYTICA / Інкапсульована фітаз / OBESUMBACTERIUM PROTEUS / ENCAPSULATED PHYTASE

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити