Проведено вивчення ступеня адгезії, гемолітичної та тріацілгліцеролліпазной активності 4 штамів холерних вібріонів з tcp + ctxгенотіпом, чутливих до бактеріофагу ctx +, виділених на території Ростовської області в 2002 р Отримані результати дають підставу вважати, що на даний момент по параметрам атоксігенності, неадгезівності, наявності гемолітичної і тріацілгліцеролліпазной активності штами tcp + ctxможно віднести до епідемічно безпечним, не заперечуючи того, що наявність гена tcpA може бути потенційно небезпечним і призвести до формування токсигенной вирулентной популяції.

Анотація наукової статті з біологічних наук, автор наукової роботи - Телесманіч Н. Р., Ломов Ю. М., бард І. Д., Винокур М. І.


Adhesion Properties of Vibrio cholerae with tcp + ctx- Genotype Isolated in 2002 from Environmental Objects in the Territory of Rostov Region

The levels of adhesion, hemolytic and triacylglycerol-lipase activities were studied in 4 cholera vibrio strains, isolated in Rostov region in 2002 susceptible to ctx + bacteriophage and expressing tcp + ctxgenotype. The observations suggest that, at the present moment, according to their non-toxinogenic and non-adhesive character and due to the presence of hemolytic and triacylglycerol-lipase activities, strains tcp + ctxcan be regarded as epidemiologically safe bacteria, admitting, however, potential risk of formation of toxinogenic virulent populations due to the presence of gene tcpA.


Область наук:
  • біологічні науки
  • Рік видавництва: 2004
    Журнал: Проблеми особливо небезпечних інфекцій

    Наукова стаття на тему 'Адгезивність холерних вібріонів з tcp + сtx- генотипом, ізольованих з об'єктів зовнішнього середовища на території Ростовської області в 2002 році'

    Текст наукової роботи на тему «Адгезивність холерних вібріонів з tcp + сtx- генотипом, ізольованих з об'єктів зовнішнього середовища на території Ростовської області в 2002 році»

    ?УДК 616.932: 575 (471.61)

    Н.РЛГелесманіч, Ю.МЛомов, І.Д.Бардих, Н.І.Вінокур

    Адгезивність холерний вібріон З ТСР + СТХ "генотип, ІЗОЛЬОВАНИХ З ОБ'ЄКТІВ ЗОВНІШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА НА ТЕРИТОРІЇ РОСТОВСЬКІЙ ОБЛАСТІ У 2002 РОЦІ

    Ростовський-на-Дону науково-дослідний протичумний інститут

    Проведено вивчення ступеня адгезії, гемолітичної та тріацілгліцеролліпазной активності 4 штамів холерних вібріонів з К; р + ах ~ генотипом, чутливих до бактеріофагу с1х +, виділених на території Ростовської області в 2002 р Отримані результати дають підставу вважати, що на даний момент по параметрам атоксігенності , неадгезівності, наявності гемолітичної і тріацілгліцеролліпазной активності штами 1ср + ах ~ можна віднести до епідемічно безпечним, не заперечуючи того, що наявність гена Ц; рА може бути потенційно небезпечним і призвести до формування токсигенной вирулентной популяції.

    Одним з головних питань епіднагляду при холері є оцінка епідемічної небезпеки виділених культур холерних вібріонів, що існують у вигляді токсигенних і нетоксигенних варіантів. Основним генетичним маркером епідеміологічної значущості штамів є гени ах АВ. Разом з тим відомо, що для реалізації інфекційного процесу холерні вібріони повинні мати і ген пілей адгезії [14], токсіген-ні штами без токсінкорегуліруемих пілей адгезії (ТСР) не здатні колонізувати слизову кишечника і викликати інфекційний процес. Тому ген 1срА, контролюючий біосинтез ТСР, визнаний поряд з ах АВ ключовим генетичним фактором, що визначає епідемічний потенціал вібріонів. При дослідженні в ПЛР 93 штамів вібріонів 01 групи, виділених з води і клінічного матеріалу на території ряду республік колишнього СРСР, лише 7,5% з них мали в складі своїх хромосом структурний ген і: РА. При цьому виявлені штами з генотипом ах + 1срА +; ах-1: СРА +; йх- К; РА ", але не було штамів ахЧсрА '[6]. У 2002 р з води р. Дон, а також зі стічних вод Ростова-на-Дону виділили 4 штаму холерних вібріонів ельтор, що містять ген токсінкорегуліруемих пілей адгезії (ЧсрА +), при відсутності гена холерного токсину (ах) і чутливих до ах + бактеріофагу. Ці дані були отримані в 2003 р в Ростовському-на-Дону протичумному інституті при вивченні свежевиделенних штамів холерних вібріонів. Роль ТСР як важливого фактора колонізації кишечника у людини і одночасно рецептора филаментозному фага СТХф, здатного до перенесення ах генів [16], дозволила розглядати ах 'ШРА + штами вібріонів 01 сіро-групи, виділених з води поверхневих водойм, як потенційно небезпечні в зв'язку з їх здатністю сприймати за допомогою трансдукції раніше втрачені або знову придбані гени, що детермінують синтез холерного токсину. Необхідно відзначити, що в роботах останніх років вивчення генотипу значно випереджає дослідження фенотипу холерних вібріонів. Разом з тим основним показником фенотипічного прояву гена 1ср повинна бути здатність штамів холерних вібріонів 1ср + ах "до адгезії, яка до

    теперішнього часу була невивченою.

    Як відомо, одним з найважливіших умов розвитку інфекційного процесу при холері є здатність вібріонів адгезіроваться до поверхні ентероцитів і включатися в їх ферментні системи. В даний час відомі методи визначення адгезивности холерних вібріонів як in vivo, так і in vitro. Методи in vivo включають в себе визначення адгезії на моделі лігувати петель клубової кишки дорослих кроликів, а також модель кроликів-шмаркачів і мишей [1, 2, 7, 8]. Однак, незважаючи на інформативність, ці методи трудомісткі, дорогі, тривалі, непридатні для дослідження великого числа культур і доступні не кожній лабораторії, крім того, клітини кролика лише віддалено схожі на клітини кишечника людини. Для оцінки адгезивних властивостей ентеробактерій були запропоновані і широко апробовані методи вивчення адгезивного процесу in vitro [2, 3, 10, 13]. Як клітин макроорганізму запропоновані еритроцити барана або людини як універсальна модель для вивчення адгезії різних мікроорганізмів. Еритроцити мають на своїй поверхні гликофорин - речовина ідентичне глікокаліксу епітеліальних клітин, на якому розташовані рецептори для адгезінов мікробів. Переваги методики очевидні - повна кореляція результатів з адгезію in vivo [3, 4, 9, 10, 13], простота отримання еритроцитів в необхідних кількостях, менша трудомісткість, експрес-аналіз, а також можливість вивчення адгезії на клітинах людського походження [10].

    В даний час поряд з ПЛР і ДНК-зондуванням, визначенням чутливості до фагів ельтор ctx + і ctx "і холерогену на кролі-ках-сосунки, загальноприйнятим тестом для оцінки епідемічного ризику штамів холерних вібріонів є гемоліз еритроцитів барана в пробі Грейга. При вивченні феномена гемолітичної активності нами був розроблений тест для визначення тріацілгліцеролліпазной активності холерних вібріонів, яка проявляється у гемолітичного атоксігенних штамів і не характерна для токсигенних.

    У зв'язку з вищесказаним метою цього дослідження було вивчення ступеня адгезії,

    гемолітичної і тріацілгліцеролліпазной активності культур 'холерних вібріонів з tcp + ctxTi генотипом, чутливих до бактеріофагу ctx +, ^ виділених на території Ростовської області.

    матеріали та методи

    В роботі використані 4 штаму tcp + ctx ~, чутливих до бактеріофагу ctx +, виділених на території Ростовської області в 2002 р - V. cholerae eltor 18513, 18514, 18507, 18515. В якості контролю використовували токсигенні штами ctx + Н1в "-V. з hole гаї cholerae 569В, V. з hole гаї eltor 5879, 1310; атоксігенние - V. cholerae eltor ctx ~ Н1в + 14959 (tcp +), 15037, 14863, виділені від челрвека; 18235, 18236, 18237, ізольовані з 'води; ctx + Hly "з води - 18210, 18228, 18231; V. cholerae 0139-16131.

    Адгезивні властивості холерних вібріонів вивчали за допомогою експрес-методу in vitro [4]. 18-годинні бульйонні культури холерних вібріонів засівали на лужний агар, через 24 год культивування при 37 ° С готували 1 млрд суспензія. Клітинним субстратом служили формалінізіро-ванні еритроцити людини 0 (1) групи Rh (+). Як буфера використовували 0,1 М розчин фосфату натрію, приготований на ізотоніческом1 розчині хлориду натрію (pH 7,2-7,3) або таблетовані-ний PBS (Serva), на якому готували 10% суспензія еритроцитів. Для досліду використовували 1 млрд суспензія вібріонів (за стандартом мутності ВЗГ ГИСК ім. JT.A, Тарасовича); На предметному склі змішували краплю еритроцитів в буфері і зваж вібріонів. Предметне скло з еритроцитами і мікробами поміщали у вологу камеру на 30 хв при 37 ° С, потім препарат висушували при тій же температурі, фіксували 96 ° спиртом або сумішшю Нікіфорова і фарбували за Романовським-Гімза або метиленовим синім. Вивчення адгезії, вели під світловим мікроскопом. Адгезивні властивості оцінювали за допомогою (СПА) за середній показник адгезії (середня кількість вібріонів прикріпилися до еритроцити). Підрахунок вели на 100 еритроцитах. Адгезивність вважали нульовою при СПА від 0 до 1; середньої - від 1,01 до 2,9; високою - понад 3 [3, 4]; К (коефіцієнт участі еритроцитів в адгезивному процесі) - відсоток, еритроцитів, що мають на своїй поверхні адгезірованних мікроби (визначають візуально, при підрахунку 100 еритроцитів). НАМ (індекс адгезйвності мікроорганізму) - середня кількість мікробних клітин на одному еритроциті, що бере участь в адгезивному процесі, обчислюється за формулою

    ТТАЛ / Г СПА-100

    ИАМ =------------,

    До

    Вібріони вважають неадгезівності при ИАМ = 0-2,4; адгезивними - від 2,51 до 3,9; високоадгезивні - вище 4,0. .

    Гемолітичну активність визначали загально-I прийнятим тестом Грейга на еритроцитах барана. Тріацілгліцеролліпазную активність, характер-I ву для атоксігенних гемолітичного штамів, визначали за запропонованою раніше методикою [12].

    результати

    Після вивчення 4 штамів холерних вібріонів tcp + ctx ~, виділених з р. Дон і стічних вод у 2002 р встановлено, що вони викликали гемоліз еритроцитів барана через 2 ч в пробі Грейга; володіли тріацілгліцеролліпазной активністю. Середній показник адгезії (СПА) tcp + ctx ~ відповідав штамів V. cholerae eltor з генотипом ctx ~ Hly +. За шкалою оцінки адгезивних властивостей мікроорганізмів [3, 4] штами з tcp + ctx ~ генотипом були оцінені як неадгезівності.

    Так, середній показник адгезії (СПА) для штамів V. cholerae eltor tcp + ctx ~ 18513 становив 0,25; 18514 - 0,17; 18507 - 0,21; 18515 - 0,17 (неадгезівності). Для штамів V. cholerae eltor ctx "Н1в + 14959 - 0,15 (tcp +); 15037 - 0,3; 14863 - 0,18; 18237 - 0,2; 18235 - 0,15; 18236 - 0,17 (неадгезівності). СПА підтверджувався низьким коефіцієнтом адгезії, що. знайшло відображення в показнику ИАМ (індексі адгезії) (таблиця). У той же час СПА для штамів вірулентних становив для V. cholerae cholerae 569В - 5; V. cholerae eltor 5879 - 3,5; 1310 - 4,5; 18210 - 2,6; 18228 - 2,9; 18231 - 2,3; ці параметри також підтверджувалися високим коефіцієнтом, що виразилося високим індексом адгезії (таблиця).

    Обговорення

    Раніше в результаті вивчення адгезивних властивостей холерних вібріонів за допомогою, методів і in vitro [2, 3, 13] встановлено, що високоадгезивні штами - ctx +, негемолітічни (СПА = 3 і вище); адгезивні - можуть бути ctx + і ctx ", гемолітичного (СПА = 1,01-2,9); неадгезівності СПА = 0-1 - ctx ", гемолітичного.

    Ці факти підтверджують дані, отримані нами. Чітка залежність адгезивной активності від токсигенности, яка простежується в результатах наших досліджень на 17 штамах холерних вібріонів, потребує підтвердження на більшій кількості штамів..

    Таким чином, наявність гена tcpA в геномі атоксігенних штамів чи не свідчить про здатність останніх до адгезії, аналогічно тому, як токсигенні штами не завжди можуть викликати холерогену ефект. Цілком ймовірно, здатність до адгезії у холерних вібріонів з'являється з придбанням гена ctx. Разом з тим відсутність варіантів ctx + tcp "[6] свідчить, що токсіген-ність, адгезивность й вірулентність пов'язані з геном tcpA. Однак за даними. [14], острівець патогенності VPI, крім tcpA, який кодує основну білкову субодиницю TCP, містить кластер генів - tcp В, С, Q, D, Е, Т; tcp Р, Н беруть участь в координованої регуляції біосинтезу TCP і холерного токсину. Виявлено поліморфізм гена tcpA у різних варіантів холерних вібріонів, відмінності в структурі білка TCP можуть вести до відмінностей в антигенної специфічності і суттєвою специфічності протік-тивного імунітету, а також впливають на його взаємодію з різними фагами, які використовують цей білок як рецептора [14].

    Результати вивчення адгезивних властивостей, гемолітичної та тріацілгліцеролліпазной активності різних штамів холерних вібріонів (М ± ш, п = 6)

    Назва штаму Наявність генів Об'єкт виділення | Параметри адгезивних властивостей Гемоліті- чна активність Тріаціл- гліцерол- ліпазная активність

    tcp ctx Середній показник адгезії Коефіцієнт адгезії,% Індекс адгезії

    V. cholerae eltor 18513 tcp * ctx "Вода 0,25 + 0,03 * 23 + 1,7 1,08 ± 0,08 + +

    18514 tcp * ctx "Вода 0,17 + 0,02 * '13 + 0,5 1,3 ± 0,1 + +

    . 18507 tcp * ctx "Вода 0,21 + 0,03 * 19 ± 0,9. 1,1 ± 0,01 + +

    18515 tcp * ctx "Вода 0,17 ± 0,02 * 14 ± 0,4 1,4 ± 0,02 + +

    18235 ctx 'Вода 0,15 + 0,02 * 13 1,1 + 0,01 + +

    18236 ctx "Вода 0,17+ 0,03 * 13 1,3 ± 0,1 + +

    18237 ctx 'Вода 0,2 ± 0,05 * 19 1.3 + 0,03 + +

    14959 tcp * ctx ". Людина 0,15 ± 0,03 * 13 ± 0,9 1,1 ± 0,01 + +

    15037 tcp "ctx" Людина 0,3 + 0,05 * 19 ± 0,2 1,5 ± 0,03 + +

    14863 tcp "ctx" Людина 0,18 ± 0,01 *. 18 ± 0,8 1 ± 0,01 - +

    5879 tcp * ctx * Людина 3,5 + 0,09 80 + 11 4,4 ± 0,3 - -

    -1310 tcp * ctx * Людина 4,5 + 0,1 70 ± 10 6,4 ± 0,4 - -

    V. cholerae cholerae 569 tcp * ctx * Людина 5,0 + 0,2 70+ 11 7,1 + 0,3 - -

    V. cholerae eltor 18210 ctx * Вода 2,6 ± 0,1 64 ± 10 4,0 ± 0,3 - -

    18228 ctx * Вода 2,9 + 0,2 60 ± 12 4,8 + 0,4 ' - -

    18231 cix * Вода '2,3 + 0,1 55 ± 11 4,6 + 0,4 - -

    V. cholerae 0139 16131 tcp * ctx * Людина 2,9 + 0,1 59 ± 10 4,8 ± 0,3 - -

    * Р - ступінь достовірності < 0,05 щодо V. cholerae cholerae 56.

    Результати наших досліджень дають підставу вважати, що на даний момент по параметрам атоксігенності, неадгезівності, наявності гемолітичної і тріацілгліцеролліпазной активності штами Сср + ах ~ можна віднести до епідемічно безпечним, не заперечуючи того, що наявність гена йрА може бути потенційно небезпечним і призвести до формування токсигенной вирулентной популяції.

    Тому при виділенні штамів 1ср + ах 'і інших можливих атипових варіантів, визначення адгезивної активності за допомогою експрес-методу в сукупності з визначенням запропонованої нами тріацілгліцеролліпазной активності [12] може бути корисно для додаткової оцінки епідемічної значущості холерних вібріонів.

    навч. закладів. Північно-Кавказький регіон. - 1994. - №4. -З. 45. - 9.Король В.В., Алексєєва Л.П., Гофман О.Д .// профилакти. природно-вогнищевих інф. - Ставрополь, 1983. - С. 300-301. - 10. Лінцнер А. А., Бріліс В.І., Брілене Т. А. // Теоретична і прикладна інф. іммунол. -М., 1982.- С. 93. - 11. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Мазрухо Б. Л. та ін. // ЖМЕІ. - 2003. - № 2. - С. 3-7. -12. Телесманіч Н.Р., Мазрухо Б.Л., Винокур Н.І. // Холера і патогенні для людини вібріони: Матер, пробл. комісії Міжвід. науч. ради по сан.-епід. охорони території РФ. - Ростов н / Д, 2002. - Вип. 15. - С. 143-144. - 13. Фрунзе О.В., Андрусенко І.Т., Шепелев А.П. та ін. // Лаб. справа. - 1987. -№3.-14. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Ruves P.R. // Infect. Immun. - 2001. - Vol. 69, N 3. - P. 1947- 1952. - 15.Jones G.W., Rutter J. // J. Gen. Microbiol. -1974, - N84. -P. 135-144. - 16.Trocksis М., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. - Vol. 95, N 24. - P. 14464-14469.

    СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

    1. аврорів В.П., Глянько Є.В., бард І.Д. // епідеміолого., Клин., Диагн. і профіл. антропонозних і зоонозних інф. - Астрахань, 1982. - С. 185-187. - 2. Адамов А.К., Наумшіна М.С. Холерні вібріони // Саратов. -1984. - 328 с. - 3. Андрусенко І.Т. Дослідження факторів, що впливають на вірулентність холерних вібріонів, і розробка нових методів її визначення: Автореф. ... докт. мед. наук. Ростов н / Д, 1991. - 43 с. - 4. Бріліс В.І. // Лаб. справа. -1986.- №4. - С. 210-212. - 5. Водоп'янов С.О., Водоп'янов А.С., Сучков І.Ю. та ін. // Совр. технол. в диагн. особливо небезпечних інф. бол .: Матер. 4-й межгос. наук.-практ. конф. гос.-участ. СНД. - Саратов, 2003. - С. 38. - 6. Водоп'янов С.О., Мішанькін Б.М., Олейников І.П .// Біо-технол. - 1999. - №6. - С. 19-23. - 7. Єфремов В.Є., Полоцький Ю.Є., Самострельскій А.Ю. та ін. // ЖМЕІ. -1981. - № 12. - С. 69-75. - 8. Король В.В .// Изв. вищих

    N.R.Telesmanich, Yu.М.Lomov, I.D.Bardykh, N.I.Vinokur

    Adhesion Properties of Vibrio cholerae with tcp * ctx "Genotype Isolated in 2002 from Environmental Objects in the Territory of Rostov Region

    Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute

    The levels of adhesion, hemolytic and triacylglycerol-lipase activities were studied in 4 cholera vibrio strains, isolated in Rostov region in 2002 susceptible to ctx * bacteriophage and expressing tcp * ctx 'genotype. The observations suggest that, at the present moment, according to their non-toxinogenic and non-adhesive character and due to the presence of hemolytic and triacylglycerol-lipase activities, strains tcp * ctx 'can be regarded as epi-demiologically safe bacteria, admitting , however, potential risk of formation of toxinogenic virulent populations due to the presence of gene tcpA.

    надійшла 16.02.04


    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити