Описано цітобіохіміческіе особливості клітин актинобактерий роду Rhodococcus в умовах переходу з вуглеводного на вуглеводневу харчування. Виявлено різноманітні способи кооперації клітин родококков в колоніальної популяції: злипання пептидоглікановому шарів клітинної стінки, формування одиночних пілевідних поверхневих тяжів і множинних шишковидних виростів на зовнішній поверхні клітинної стінки, що забезпечують закріплення родококков і збереження їх в гетерофазних природних середовищах. Виявлено найбільш типові реакції родококков на присутність газоподібних і рідких налканов. Встановлено надсинтез позаклітинних амінокислот в умовах індукції оксігеназного ферментного комплексу родококков і висловлено припущення щодо фі фізіологічних ролі даного процесу. Виявлені пристосування алка- нотрофного родококков розглядаються в якості адаптаційних механізмів їх виживання в специфічних умовах зовнішнього середовища.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Івшина І. Б., Каменських Т. Н., Анохін Б. А.


Adaptive mechanisms of alkanotrophic rhodococci survival under unfavorable conditions

Cytobiochemical features of cells of the genus Rhodococcus actinobacteria under the nutritional shift from carbohydrate type to hydrocarbon one were characterized. Rhodococci cells were found to use different grouping strategies in colony populations, i.e. adhesion of cell wall peptidoglycane layers and formation of multiple cone-shaped offshoots on the cell wall surface. These allow rhodococci cells to "attach" to and survive in heterophasic natural habitats. Most typical reactions of rhodococci to gaseous and liquid n-alkanes were detected. Induction of rhodococci oxygenase complex resulted in overexpression of extracellular amino acids, thus the physiological role of this process was assumed. The alkanotrophic rhodococci adaptations observed in the study are considered as adaptive mechanisms of their survival under specific environmental conditions.


Область наук:
  • Біотехнології в медицині
  • Рік видавництва: 2007
    Журнал: Вісник Пермського університету. Серія: Біологія

    Наукова стаття на тему 'Адаптаційні механізми виживання алка- нотрофного родококков, реалізовані в несприятливих умовах середовища'

    Текст наукової роботи на тему «Адаптаційні механізми виживання алка- нотрофного родококков, реалізовані в несприятливих умовах середовища»

    ?ВІСНИК Пермського УНІВЕРСИТЕТУ

    2007 Біологія Вип. 5 (10)

    УДК 579.22: 579.23

    АДАПТАЦІЙНІ МЕХАНІЗМИ ВИЖИВАННЯ алка- нотрофного РОДОКОККОВ, Реалізовані В НЕСПРИЯТЛИВИХ УМОВАХ СЕРЕДОВИЩА

    І. Б. Івшінаа, ь, Т. Н. Каменскіха, Б. А. Анохін

    а Інститут екології та генетики мікроорганізмів УрО РАН, 614081, Перм, вул. Голєва, 13 ь Пермський державний університет, 614990, Перм, вул. Букірева, 15

    Описано цітобіохіміческіе особливості клітин актинобактерий роду Rhodococcus в умовах переходу з вуглеводного на вуглеводневу харчування. Виявлено різноманітні способи кооперації клітин родококков в колоніальної популяції: злипання пептидоглікановому шарів клітинної стінки, формування одиночних пілевідних поверхневих тяжів і множинних шишковидних виростів на зовнішній поверхні клітинної стінки, що забезпечують закріплення родококков і збереження їх в гетерофазних природних середовищах. Виявлено найбільш типові реакції родококков на присутність газоподібних і рідких н-алканів. Встановлено надсинтез позаклітинних амінокислот в умовах індукції оксиге-приз ферментного комплексу родококков і висловлено припущення щодо фізіологічної ролі даного процесу. Виявлені пристосування алка- нотрофного родо-коків розглядаються в якості адаптаційних механізмів їх виживання в специфічних умовах зовнішнього середовища.

    Вступ

    У зв'язку зі зростаючим техногенним забрудненням навколишнього середовища збільшується число місць існування, в яких організми знаходяться в екстремальних умовах. Незважаючи на те, що проблема адаптації мікроорганізмів до несприятливих умов середовища традиційно розглядається біохімією і загальної мікробіологією, для сучасної біології прокаріотів великий інтерес представляють мікроорганізми, здатні метаболизировать в екстремальних місцях проживання. У біотопах з підвищеним вмістом мінеральних солей або нафтовим забрудненням домінуюче становище займають актинобактерии роду Rhodococcus. Основна біологічна особливість родококков - їх здатність до окислювальному трансформації і деструкції природних і антропогенних вуглеводнів, синтезу за рахунок їх всіх компонентів клітин. Одне вже це властивість робить їх найменш залежними від зовнішнього середовища і дозволяє існувати в умовах, несприятливих для інших мікроорганізмів. Однак без належної уваги залишаються питання адаптації родококков до постійно змінюваних

    умов середовища, перемикання з використання одних джерел вуглецю та енергії на інші.

    У зв'язку з цим детального вивчення заслуговує своєрідність структурної та метаболічної організації алка- нотрофного родококков, поява їх якісно нових клітинних структур і фізіологічних властивостей в умовах переходу бактеріальних клітин з вуглеводного на вуглеводневу харчування.

    Морфогенез та особливості тонкої структури клітин родококков

    Родококкі характеризуються наявністю складного морфогенетичного циклу розвитку. Клітини родококков в молодої (6-15 год) культурі паличкоподібні, ниткоподібні або розгалужені (рис. 1а, б). При цьому довжина клітин коливається від 7 до 12 мкм, ширина 0.7-0.9 мкм. У перші години зростання утворюється нестабільний міцелій, що не має перегородок і представляє собою одну клітку (рис. 1в). Через 16 год інкубації родококков первинний міцелій розпадається на паличкоподібні фрагменти різної довжини. У віці 2-5 діб помітна перевага коккоподібних (0.5-0.8 мкм) клітин (рис. 1г).

    © І. Б. Івшина, Т. Н. Каменських, Б. А. Анохін, 2007

    107

    На підставі даних про морфологічному різноманітності родококкі можна розподілити по зростаючій складності диференціації клітин в життєвому циклі в такий ряд: R. erythropolis - R. fascians - R. rhodochrous - R. "longus" - R. opacus - R. ruber. Так, представники R. ruber з найбільш вираженим життєвим циклом і міцеліальних стадією розвитку клітин (в морфоцікле R. ruber виявляється чотири форми клітин: проростає, гілляста, паличкоподібна і переживає) характеризуються здатністю асимілюються-

    вать, поряд з рідкими, важкі газоподібні н-алкани (пропан, н-бутан). Не позбавлене підстав припущення (Калакуцький, Агре, 1977), що фрагментація міцелію збільшує відношення клітинної поверхні до об'єму і тим самим підвищує здатність родококков до поглинання трудноусваиваемой субстрату. Мабуть, завдяки здатності утворювати первинний міцелій родококкі пристосувалися до життя не тільки у водному середовищі, а й у твердофазном субстраті.

    . л а t > * * ^ Г .1,1 ^. '- v >йс

    в \ V » '1 | Г >, 4? +, V. Щ Ч *'рь * у1 г Ч ' >\ 'Ч; "v, - * >

    Мал. 1. Морфологія клітин R. орасш 'ІЕГМ 716 при зростанні на мясопептонном агарі. Час культивування: а - 6 год; б - 9 год; в - 15 год; г - 48 год (забарвлення генціановий фіолетовим)

    Додаткова інформація про морфологічні особливості родококков отримана за допомогою скануючої електронної мікроскопії при вивченні архітектоніки формованих ними колоній. Так, колонії R. ruber диференційовані на субстратную і надсубстратную зони росту. При цьому спостерігаються різноманітні способи кооперації клітин в колоніальної популяції - від злипання пептидоглікановому шарів клітинних стінок до формування одиночних пілевідних поверхневих тяжів і множинних шишковидних виростів на зовнішній поверхні клітинної стінки (рис. 2а, б). Очевидно, освіту морфо-

    функціональних міжклітинних контактів в колоніях, що сприяють виникненню комунікацій між контактуючими клітинами і ефективної генерації відповіді «кооперативної клітинної системи» на можливі екологічні ситуації, - пристосувальний ознака родокок-ков, що забезпечує виживання в гетерофазних природних середовищах. Можна припускати, що в природних умовах закріплення родококков на субстраті йде або за рахунок адгезії клітин на його поверхні, або за рахунок вростання клітин в субстрат, освіти в ньому гіллястих особин і формування міцеліоподобних структур (рис. 2в).

    Мал. 2. Клітини R. ruber ІЕГМ 333, вирощені на мінеральному середовищі в атмосфері пропану (а, б) і мясопептонном агарі (в), в скануючому мікроскопі:

    а - х 36 000; б - х 45 000; в - х 25 000. КВ - кільцеподібний виступ; стрілками показані шишкоподібні вирости.

    Електронограмми виконані к.б.н. В.П. Шеховцовим з використанням скануючого електронного мікроскопа JSM-50A (фірма JEOL, Японія)

    При електронно-мікроскопічному вивченні алка- нотрофного родококков виявлені зміни в структурно-функціональних комплексах клітин, які знаходяться в залежності від довжини вуглецевого ланцюга утилізованого вуглеводневої субстрату. Найбільш типова реакція родококков на присутність газоподібних і рідких н-алканів -наявність капсул полисахаридной природи, що виявляють спорідненість з рутенієвому червоним (рис. 3а); вакуолеподобних утворень, що володіють ульт-раструктурнимі характеристиками, властивими гранулам полі-р-оксибутирата (рис. 3-є); підвищення вмісту осміофільние включень, відповідних за результатами цитохимического фарбування гранулам поліфосфатів (рис. 3 а, б) і збільшення їх розмірів (до 100 нм). Відмітна особливість клітин, вирощених на пропан або н-

    бутані, - фрагментація цитоплазми (рис. 3в), наявність жирових включень (рис. 3а, б), формування оксісомоподобних структур (рис. 3а), що представляють собою спеціалізовані ділянки локалізації окислюють ферментів, які необхідні для трансформації вуглеводневої субстрату, утворення розвиненою внутрішньоклітинної мембранної системи (рис. 3а), представленої різними конфігураціями і розташованої нерідко по периферії цитоплазми. Переважна локалізація виявлених складних внутрішньоклітинних мембранних утворень близько клітинної стінки свідчить про їх ймовірної ролі в збільшенні поверхні цитоплазматичної мембрани і метаболізмі пропан і бутанокісляющіх ро-дококков. Так, в газоокісляющіх клітинах виявляється активний синтез матеріалу клітинної

    Мал. З. Ультратонкі зрізи клітин R. ruber, вирощених на мінеральному середовищі в атмосфері пропану:

    а - штам ІЕГМ ЗЗЗ, х 80 ТОВ; б - штам ІЕГМ 580, х 82 ТОВ; в - ІЕГМ 565, х 70 ТОВ; г, д -ІЕГМ З42, х 82 ТОВ; е - ІЕГМ 7З, х 70 000.

    КС - клітинна стінка; РКС - розростання клітинної стінки; МК - мікрокапсула; Н - нуклеоїд; П - поперечна перегородка; ВМС - внутрішньоцитоплазматична мембранна система; В - волютин; Ж - жирові включення; ФЦ - фрагментація цитоплазми; СТ - поли-р-оксибутират; ОС -

    оксісомоподобная структура.

    Електронограмми виконані к.б.н. Л.Є. Глазачевой з використанням електронного мікроскопа JEM-100B (фірма JEOL, Японія) при ускоряющем напрузі 80 кВт і робочому збільшенні 1З 000-З0 000

    стінки (рис. 3г, д). Близько розростань клітинної стінки зазвичай виявляються Мезосома, що мають контакт з прикордонної цитоплазматичної мембраною, і електронно-щільні включення, так звані оксісоми. Надмірний ріст клітинної стінки, що збільшує її поверхню, очевидно, пов'язаний зі створенням своєрідного депо, що забезпечує фіксацію надходить гидрофобного ростового субстрату.

    Таким чином, дані електронно-цитохимического аналізу алка- нотрофного родококков роблять очевидною корелятивну зв'язок їх поверхневих і мембранних ультраструктур з деструктивними процесами н-алканів. Зникнення спостережуваних змін в ультратонкому будові клітин у міру багаторазових серійних пересівань останніх і інкубації їх на стандартних органічних середовищах - переконливий доказ функціональної пристосованості родококков, інкубованих у присутності газоподібних і рідких н-алканів.

    Надсинтез екстрацелюлярний амінокислот

    В умовах індукованого алка- нотрофного метаболізму родококков виявлено зміна

    якісного і кількісного складу синтезованих ними позаклітинних амінокислот. Як видно з рис. 4, родококкі при вирощуванні їх в глюкозо-мінеральному середовищі і в мінеральному середовищі в атмосфері пропану здатні в процесі росту синтезувати і виділяти в середу, як правило, кілька амінокислот. При цьому слід зазначити збільшення кількості екстрацелюлярний амінокислот при зростанні в мінеральному середовищі з газоподібними вуглеводнями в порівнянні з такими при зростанні їх в середовищі з глюкозою. Представники R. ruber накопичують при культивуванні в присутності пропану аргінін, валін, гістидин, глутамінової кислоти, ізолейцин, лізин, метіонін, тирозин, фенілаланін. При цьому склад продукуються амінокислот залежить від індивідуальних особливостей конкретних штамів родококков. Родококкі - активні продуценти амінокислот - можуть бути використані в якості вихідного матеріалу для селекції перспективних форм, що синтезують переважно одну амінокислоту в кількості, достатній для виробництва.

    0,7

    0,6

    н-0,5 про

    Ц

    0

    1 0,4

    0,3

    *

    а

    ф

    ч

    про

    про

    0,2

    0,1

    ?

    и

    и

    гь

    ?

    ? а

    ? б

    *

    ?

    rf

    ?

    Ала

    ара *

    Вал * Гіс * Гли Гли Ілі * Лей * Ліз * Мет * Тир Тре * Сер Фен *

    0

    Мал. 4. Синтез екстрацелюлярний амінокислот родококкамі при зростанні на середовищі з глюкозою (а) і

    в присутності пропану (б):

    Ала - аланін, Арг - аргінін, Вал - валін, Гіс - гістидин, Гли - гліцин, Гли - глутамінова кислота, Ілі - ізолейцин, Лей - лейцин, Ліз - лізин, Мет - метіонін, Тир - тирозин, Тре Сер - треонін + серин, Фен - фенілаланін; * - незамінні амінокислоти.

    Амінокислотний склад культуральної рідини родококков вивчали методом іонообмінної хроматографії з використанням пластинок «Фіксіон 50х8». Рухома фаза - цитратний буфер рН 3.3. Кількісний вміст амінокислот визначали після денситометрии пластин на Мікрофотометр G-П, розраховуючи

    площі піків кожної амінокислоти

    Здатність алка- нотрофного родококков накопичувати позаклітинні амінокислоти, крім практичного значення може мати і екологічний сенс. Відомо, що в обміні речовин між організмами біоценозів важливу роль відіграють вільні амінокислоти, що впливають на розвиток комплексів мікробних асоціацій. Не виключено сенсу припущення, що екстрацелюлярний амінокислоти, синтезовані пропан і бутано-Кісляй родококкамі в природних субстратах з мінімальним вмістом органічних речовин, можуть бути використані в процесі життєдіяльності іншими групами гетеротрофних мікроорганізмів ценоза.

    Слід зазначити, що питання про фізіологічну роль процесу надсинтезу родококкамі екс-трацеллюлярних амінокислот залишається відкритим. Очевидно, цей процес слід розглядати як футільний скидання надлишку відновлювальних еквівалентів (надлишкової енергії), що дозволяє родококкам виживати в несприятливих умовах середовища (Акименко, 1989).

    висновок

    Виявлено, що родококкі в умовах індукованого алка- нотрофного метаболізму володіють різноманітними способами кооперації клітин в колоніальної популяції: злипання пептідоглі-Канова шарів клітинної стінки, формування одиночних пілевідних поверхневих тяжів, про-

    разование множинних шишковидних виростів на зовнішній поверхні клітинної стінки. Характерною особливістю клітин родококков, вирощених в присутності газоподібних і рідких н-алканів, є наявність фібрилярних капсул полисахаридной природи, підвищення вмісту і розмірів гранул поліфосфатів та по-лі-р-оксибутирата, фрагментація цитоплазми, формування оксісомоподобних структур, гіперсінтез мембранного апарату, переважна локалізація складних мембранних структур близько клітинної стінки, активний синтез нових ділянок клітинної стінки, а також надсинтез таких енергоємних сполук, як екстрацеллю-лярні амінокислоти. Все це значно розширює адаптивні можливості родококков, свідчить про їх біологічної пластичності і може розглядатися в якості адаптаційних механізмів виживання їх в специфічних умовах зовнішнього середовища проживання.

    Список літератури

    Акименко В.К. Альтернативні оксидази мікроорганізмів. М .: Наука, 1989. 263 с.

    Калакуцький Л.В., Агре Н.С. розвиток актиноміцетів.

    М .: Наука, 1977. 285 с.

    Нестеренко ОА., Квасніков Є.І., Ногіна Т.М. Но-кардіоподобние і корінеподобние бактерії. Київ: Наукова думка, 1985. 336 с.

    Надійшла до редакції 18.05.2006

    Adaptive mechanisms of alkanotrophic rhodococci survival under unfavorable conditions

    I.B. Ivshina, T.N. Kamenskikh, B.A. Anokhin

    Cytobiochemical features of cells of the genus Rhodococcus actinobacteria under the nutritional shift from carbohydrate type to hydrocarbon one were characterized. Rhodococci cells were found to use different grouping strategies in colony populations, i.e. adhesion of cell wall peptidoglycane layers and formation of multiple cone-shaped offshoots on the cell wall surface. These allow rhodococci cells to "attach" to and survive in hete-rophasic natural habitats. Most typical reactions of rhodococci to gaseous and liquid «-alkanes were detected. Induction of rhodococci oxygenase complex resulted in overexpression of extracellular amino acids, thus the physiological role of this process was assumed. The alkanotrophic rhodococci adaptations observed in the study are considered as adaptive mechanisms of their survival under specific environmental conditions.


    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити