Наша робота присвячена дослідженню власної ферментної активності імуноглобулінів у осіб з хірургічної інфекцією, а також вивчення залежності активності від виду мікроорганізму, що викликав патологічний процес. Очищення імуноглобулінів проводилася риванол-сульфатним методом з використанням афинной хроматографії на стафіллакокковом протеїні А. Були досліджені БАПНА-амідазная і ДНК-азная активність імуноглобулінів. В результаті дослідження було виявлено достовірне підвищення рівня власної ферментної активності імуноглобулінів у хірургічних хворих з гнійними процесами в порівнянні з контрольною групою. Не було виявлено залежності рівня абзімной активності від виду мікроорганізму збудника хірургічної інфекції. Таким чином, в результаті нашого дослідження отримані дані, які можуть вносити нове розуміння в патогенез гнійної хірургічної інфекції.

Анотація наукової статті з фундаментальної медицини, автор наукової роботи - Сенькович С. А.


Область наук:
  • фундаментальна медицина
  • Рік видавництва: 2007
    Журнал: Вісник Вітебського державного медичного університету
    Наукова стаття на тему 'Абзімная активність у хворих з хірургічною інфекцією'

    Текст наукової роботи на тему «Абзімная активність у хворих з хірургічною інфекцією»

    ?АБЗІМНАЯ АКТИВНІСТЬ У ХВОРИХ НА ХІРУРГІЧНІЙ

    ІНФЕКЦІЄЮ

    Сенькович С.А.

    Вітебська міська центральна клінічна лікарня

    Резюме. Наша робота присвячена дослідженню власної ферментної активності імуноглобулінів у осіб з хірургічною інфекцією. а також вивчення залежності активності від виду мікроорганізму. викликав патологічний процес. Очищення імуноглобулінів проводилася риванол-сульфатним методом з використанням афинной хроматографії на стафіллакокковом протеїні А. Були досліджені БАПНА-амідазная і ДНК-азная активність імуноглобулінів. В результаті дослідження було виявлено достовірне підвищення рівня власної ферментної активності імуноглобулінів у хірургічних хворих з гнійними процесами в порівнянні з контрольною групою. Не було виявлено залежності рівня абзімной активності від виду мікроорганізму - збудника хірургічної інфекції. Таким чином. в результаті нашого дослідження отримані дані. які можуть вносити нове розуміння в патогенез гнійної хірургічної інфекції.

    Ключові слова: абзімная активність. хірургічна інфекція.

    Abstract. Our research is devoted to the investigation of inner enzyme activity of immunoglobulins in patients with surgical infection and dependence of this activity on the type of microorganism that causes the pathological process. The purification of immunoglobulins was made by rivanol sulphate including affinity chromatography on staphylococcal protein А. In our research we also examined BAPNA-amidase and DNA-se activities of immunoglobulins. As the result of the investigations we revealed the increase of the level of immunoglobulin abzyme activity in surgical patients with suppurative processes in comparison with control group. We did not reveal any dependence of inner enzyme activity on the type of microorganism - causative agent of surgical infection. Thus it can be concluded that the result of our investigations may invest new understanding into pathogenesis of suppurative surgical infection.

    Адреса для кореспонденції: Республіка Білорусь. м Вітебськ. вул. Берестень 40. кв.8 Тел. 24-71-84. 8-0295-19-30-78

    Вивчення механізмів реакції макроорганізму на інвазію інфекційного агента не втрачає актуальності. тому знання цих механізмів необхідно для розуміння патогенезу різних захворювань і розробки ефективних схем їх лікування. Імунна система сприймає мікроорганізм як набір антигенів і відповідає виробленням відповідних імуноглобулінів та імунних Т-клітин. На ферменти. віднайдені мікроорганізмами. виробляються антитіла. активний центр яких є як би дзеркальним відображенням активного центру ферменту. Далі за рахунок реалізації ідіотипів-антіідіотіпіческіх механізму (відповідно до теорії імунної мережі Ерне) [1. 2] утворюються антитіла другого порядку. активний центр яких подібний до активного центру ферменту. Такі антитіла можуть мати властивість каталізувати хімічні реакції. Крім описаного варіанта. утворення антитіл з власної ферментної активністю (абзимів) може відбуватися при імунізації організму стабільними аналогами перехідних станів хімічних реакцій. при ковалентном приєднання одиничних молекул ферментів до шарнірних ділянок молекул імуноглобулінів. а також за рахунок модифікації активного центру імуноглобуліну при взаємодії з катіонами різних металів (магнію. кальцію. цинку. міді). є ко-ферментами різних реакцій [3. 4. 5].

    Вперше антитіла до власних ферментними властивостями були описані на початку 80-х років XX століття [4. 6]. На сьогоднішній день доведено виникнення високооктівних абзимів у осіб з системними захворюваннями сполучної тканини (системний червоний вовчак. Склеродермія. Ревматоїдний артрит і т.п.). гелікобактерним гастродуоденітах [4. 6. 7. 8]. доведено

    участь абзимів в патогенезі системних захворювань сполучної тканини [4]. В той же час. існує думка. що каталітична інактивація антигенів представляється набагато більш ефективною. ніж звичайне освіту імунного комплексу. в результаті чого абзими можуть надавати позитивний або негативний вплив на розвиток інфекційного процесу [9].

    При виникненні гнійного процесу відбувається масивний викид різних ферментів в кровоносне русло. що відповідно до теорії імунної мережі може призвести до виникнення антитіл з власної ферментативної активністю.

    Таким чином. метою нашого дослідження було вивчення абзімной активність у осіб з хірургічною інфекцією і її зв'язок з видом мікроорганізму. викликав гнійний процес.

    методи

    Виділення (імуноглобулінів) проводилося в кілька етапів. пер-

    вий етап - осадження сироватки крові 0.75% розчином риванолу з подальшою обробкою надосадка активованим вугіллям [10]. Далі проводилася аффинная хроматографія отриманого матеріалу на агарозе. кон'югованої з протеїном А золотистого стафілокока. Цей білок селективно сорбує на собі імуноглобуліни Про підкласів 1. 2. 4. Хроматографічні колонку послідовно відмивали 0.01 М фосфатним буферним розчином рН 7.4. що містить 1% розчин твін 20 і 0.01 М фосфатним буферним розчином з рН

    7.4 без детергента до зникнення білка в елюенті. що контролювали методом Бредфорда. Елюція зв'язалися c коньюгированной протеїном А IgG вели 0.1 М гліцин-НО буфером. рН 2.8. Елюція контролювалася по виходу білка з використанням методу Бредфорда [11]. Отримані Ig концентрували і додатково очищали переосажденіем в 40% розчині сульфату амонію. розчиняли в 2 мл дистильованої води і проводили діаліз проти 2.5 л 0.9% NaCl чотири рази.

    Перевірку чистоти Ig проводили за допомогою електрофорезу в 10% і градиентном від 4 до 20% поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію в відновлюють і невідновних умовах. а гель фарбували Кумассі R250 або нітратом срібла. Контроль стерильності матеріалу здійснювалася посівом проб імуноглобулінів на кров'яний агар.

    Визначення бензоіларгінін-р-нітроаніліда (БАПНА) - амідазной активності імуноглобулінів проводили за методом Ерлангера в нашій модифікації [12]. Як субстрат протеолізу використовували бензоіларгінін-р-нітроаніліда. Розпад цього субстрату відбувається тільки в результаті розщеплення амидной (аналога пептидного) зв'язку по амінокислотам аргінін-лізин. Реакційна суміш містила Ig G в концентрації 0.75 мг / мл і БАПНА в концентрації 0.4 мг / мл. Концентрацію імуноглобулінів визначали спектрофотометрично за ступенем поглинання при довжині хвилі 280 мкм. Облік результатів реакції здійснювався після 20-ти годинної інкубації при температурі 37.6 ° С на иммуноферментном аналізаторі при довжині хвилі 410 нм. В якості негативного контролю замість Ig використовувався стерильний фізіологічний розчин.

    Для перерахунку отриманого результату в пікокатали використовувалася формула У = 0.028 + 11хБоп. де Y - шуканий результат. Еоп - оптична щільність проби мінус оптична щільність контролю. Формула була виведена на основі визначення залежності оптичної щільності від молярної концентрації р-нітроаніліда в розчині (при розпаді 1 молекули БАПНА утворюється 1 молекула р-нітроаніліда). Т. о. був отриманий калібрувальний графік представляє собою лінійну залежність з коефіцієнтом кореляції 0.998.

    Для визначення ДНК-азной активності IgG сироватки крові в якості субстрату використовували дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК. Sigma). Активність імуноглобулінів визначали в умовних одиницях по зменшенню утворення згустку ДНК [13]. Досвід проводили наступним чином: після добової інкубації при температурі 37.6 ° С реакційної суміші. містить ДНК в концентрації 0.166 мг / мл. IgG в концентрації 0.25 мг / мл. 0.001 М Mg (Cl) 2 на трис-HCI буфері. рН 7.4. 0.02 М в пробірки додавали по 0.02 мл

    0.75% розчину риванолу і струшували їх. Згусток, що утворився відмивали дистильованою водою і розчиняли в 0,5 мл 1 N HCl (підігріваючи на спиртівці до повного розчинення). Обсяг проби доводили до 2 мл дистильованою водою і вимірювали її оптичну щільність на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм. В якості негативного контролю замість розчину імуноглобулінів використовувався стерильний фізіологічний розчин.

    Статистична обробка отриманих результатів проводилася з використанням t-критерію Стьюдента.

    Результати та обговорення

    При дослідженні БАПНА-амідазной і ДНК-азной активності імуноглобулінів всі обстежені були розділені на п'ять груп: хворі на хронічний остеомієліт. хворі з різними гострими хірургічними гнійно-запальними процесами (панариції. абсцеси. флегмони різної локалізації і т. п.). особи з інфекцією щелепно-лицьової області. хворі з різними захворюваннями щитовидної залози (тиреоїдит. токсичний зоб) і контрольна група - особи прооперовані з приводу хірургічної патології без гнійно-запальних процесів. В результаті дослідження виявлено. що у осіб з гнійно-запальними процесами рівень БАПНА-амідазной активності імуноглобулінів був достовірно вище. ніж у контрольній (табл.1). Виділення групи осіб із захворюваннями щитовидної залози пов'язано з тим. що в літературі є дані про підвищений рівень БАП-НА-амідазной і ДНК-азной активності у таких хворих [4].

    Таблиця 1

    БАПНА-амідазная активність імуноглобулінів

    N Група п Активність середня

    1 Хронічний остеомієліт 39 0.316 + 0.063

    2 Гострі гнійні захворювання 52 0.379 + 0.075

    3 Інфекція щелепно-лицьової області 28 0.278 + 0.036

    4 Захворювання щитовидної залози 15 0.176 + 0.042

    5 Контроль 32 0.199 + 0.029

    Достовірність відмінності

    Р1-5<0.05

    Р2-5<0.05

    Р3-5<0.05

    Р4-5>0.05

    * Між іншими групами достовірних відмінностей не виявлено (р>0.05).

    При дослідженні залежності БАПНА-амідазной активності від виду мікроорганізму. викликав гнійний процес. достовірних відмінностей не отримано (табл.2). Розподіл на групи було пов'язане з рівнем БАПНА-амаідазной активності мікроорганізмів: в першій групі активність висока. в другій середня. в третій відсутня [12].

    Таблиця 2

    БАПНА-амідазная активність імуноглобулінів в залежності від етіологічного фактора гнійно-запального процесу

    N Група п Активність середня Достовірність відмінності

    1 Синегнойная паличка 11 0.210 + 0.058 Р>0.05

    2 Грам палички 11 0.210 + 0.104

    3 стафіллококком 11 0.227 + 0.046

    При дослідженні ДНК-азной активності імуноглобулінів було встановлено. що у осіб з остеомієлітом середній рівень ДНК-азной активності був достовірно вище. ніж у осіб контрольної групи і осіб з інфекцією щелепно-лицьової області. Між іншими групами достовірних відмінностей не виявлено (табл.3).

    Таблиця 3

    ДНК-азная активність імуноглобулінів

    N Група n Активність середня

    1 Хронічний остеомієліт 30 33.76 + 6.23

    2 Гострі гнійні захворювання 25 22.28 + 4.33

    3 Інфекція щелепно-лицьової області 27 13.29 + 2.54

    4 Захворювання щитовидної залози 17 18.64 + 3.88

    5 Контроль 19 12.36 + 3.31

    Достовірність відмінності

    P1-5<0.01

    P1-3<0.01

    * Між іншими групами достовірних відмінностей не виявлено (p>0.05).

    При аналізі частоти народження осіб з достовірно позитивної ДНК-азной активністю. т. е. такою активністю. рівень якої достовірно перевищує рівень спонтанного розпаду субстрату в контрольних пробах були отримані наступні результати. У групах хворих з гнійними процесами (за винятком групи хворих з інфекцією щелепно-лицевої ділянки) і захворюваннями щитовидної залози вона виявилася достовірно вище. ніж у контрольній (табл. 4).

    Таблиця 4

    Частота осіб з достовірно позитивної ДНК-азной активністю

    N Група Достовірно позитивна активність Достовірність відмінності

    1 Хронічний остеомієліт 17 (56.666%) P1-5<0.001 P1-3<0.05 P2-5<0.05 P4-5<0.01

    2 Гострі гнійні захворювання 9 (36%)

    3 Інфекція щелепно-лицьової області 7 (25.925%)

    4 Захворювання щитовидної залози 9 (52.941%)

    5 Контроль 2 (10.5%)

    * Між іншими групами достовірних відмінностей не виявлено (p>0.05).

    При вивченні залежності рівня ДНК-азной активності імуноглобулінів від виду мікроорганізму. викликав патологічний процес. достовірних відмінностей виявлено не було (табл. 5).

    Таблиця 5

    ДНК-азная активність імуноглобулінів в залежності від виду мікро-

    організмів

    Група n Активність середня Достовірність відмінності Достовірно позитивні

    S. aureus 17 38.71 + 7.61 P>0.05 10 (58.82%) P>0.05

    Всі інші 11 27.27 + 7.34 5 (45.45%)

    Вибір груп для порівняння був обумовлений тим. що найбільш частим збудником хірургічної інфекції залишається золотистий стафілокок. який має найвищу ДНК-азной активністю з поширених етіологічних факторів гнійно-запальних захворювань.

    висновки

    1. БАПНА-амідазная активність імуноглобулінів у осіб з хірургічною інфекцією (у всіх досліджених групах) достовірно вище. ніж у контрольній групі.

    2. Середній рівень ДНК-азной активності імуноглобулінів. а також частота народження осіб з достовірно позитивної ДНК-азной активністю в групі хворих з хронічним остеомієлітом була достовірно вище. ніж у контрольній групі і в групі осіб з інфекцією щелепно-лицьової області. У групах хворих з гострою хірургічною інфекцією і захворюваннями щитовидної залози частота осіб з достовірно позитивної ДНК-азной активністю виявилася достовірно вище. ніж у контрольній групі.

    3. В даний час не виявлено достовірних відмінностей абзімной активності від виду мікроорганізму. викликав патологічний процес.

    література

    1. Імунологія: в 3 т. / У. Пол [и др.]; під ред У. Пола. - Москва. -Мир. 1988. - Т. 2. - C. 456.

    2. Monroe. J. G. Anti-idiotypic antibodyes and disease / J. G. Monroe.

    M. I. Green // Green Immunol. Invest. - 1986. - Vol. 15. N 3. - P. 263-286.

    3. Посилення абзімной активності поліклональних IgG при взаємодії з катіонами металів / І. І. Генералів [и др.] // Імунопатологія. алергологія. Інфектологія. - 2000. - № 1. - С. 40-43.

    4. Генералів. І. І. Абзімная активність імуноглобулінів /

    І. І. Генералів. - Вітебськ: видавництво ВГМУ. 2000. - С.151.

    5. Щуров. Д. В. Каталітичні антитіла / Д. В. Щуров // Молекулярна біологія. - 1997. - № 1. - С. 5-15.

    6. DNA hydrolyzing autoantibodies / A. M. Shuster [et al.] // Sciense. - 1992.

    - Vol. 256. N 5057. - P. 665-667.

    7. ДНК - і РНК-гідролізуючі антитіла з крові пацієнтів з різними формами вірусних гепатитів / А. Г. Барановський [и др.] // Біохімія. -1997. - Т.62. № 12. - С. 1358-1366.

    8. Ферментативний спектр IgG антитіл до Helicobacter pylori / М. Р. Конорєв [и др.] // Імунопатологія. алергологія. Інфектологія. - тисяча дев'ятсот дев'яносто дев'ять.

    - № 1. - С. 119-125.

    9. Proteolytic activity of an antibody light chain / M. Sun [et al.] // J. Immunol. - 1994. - Vol.153. N 11. - P. 5121-5126.

    10. Імунологічні методи: пров. з нім. / Під ред. Г. Фримель. - Москва. Мир. - 1987. - C. 472.

    11. Шишкін. С. С. Використання зв'язування барвників для кількісного визначення вмісту білка в розчинах / С. С. Шишкін // Питання медхіміі. - 1982. - № 5. - С. 134-141.

    12. Визначення БАПНА-амідазной активності мікроорганізмів. сироваток крові і імуноглобулінів класу G: інструкція на метод. Реєстр. № 60101 / В. К. Окуліч [и др.]. - 2002.

    13. Спосіб визначено ДНК-азной активності: пат. Тисяча шістьдесят шість Респ. Білорусь. МИ 02Q 1/34. C12N 9/22. / М. Р. Конорєв. К. С. Азаренка. І. І. Генералів. А. Г. Голубєва (РБ); заявник Віт. держ. мед. ун-т. - № 243 А; заявл. 06.04.93; опубл. 14.08.96.


    Ключові слова: АБЗІМНАЯ АКТИВНІСТЬ / ХІРУРГІЧНА ІНФЕКЦІЯ

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити