Аберрантное метилювання промоторних ділянок генів основне епігенетичні зміни, що характеризує колоректальні неопластические освіти. У даній роботі було досліджено кількісний рівень метилування 42 CpG-сайтів промоторних ділянок генів MGMT, APC і CDH13 в пухлинах товстої кишки по відношенню до рівня метилування прилеглої умовно нормальної тканини 25 пацієнтів. За допомогою методу піросеквенірованія виявлено підвищення рівня метилування промоторних ділянок генів MGMT, APC і CDH13 в пухлинних зразках від 3 до 5 разів. У цих же зразках пухлин проведено скринінг активують SNP-мутацій в онкогенах KRAS (40%), NRAS (0%) і BRAF (0%). Наявність SNP-мутацій в гені KRAS супроводжувалося гіперметілірованіе одного або більше промоторів досліджених генів. Доведено асоціація цього епігенетичного показника з метастазуванням пухлини. Отримані дані про збільшення метилування промоторних ділянок генів-онкосупрессоров можуть бути використані в якості чутливих прогностичних маркерів прогресування і метастазування колоректального раку.

Анотація наукової статті з біотехнологій в медицині, автор наукової роботи - Кіт Олег Іванович, Водолазький Дмитро Ігорович, Двадненко Костянтин Володимирович, Єфімова Ірина Юріївна, Олейникова Олена Миколаївна


Aberrant methylation of the promoter of APC, CDH13 and MGMT genes in colorectal cancer patients

Aberrant methylation of gene promoter regions is the main epigenetic change characterizing colorectal cancer. Methylation levels of 42 CpG-sites of promoter regions of the MGMT, APC and CDH13 genes in colorectal cancer were studied in comparison with methylation levels of the adjacent normal tissue in 25 patients. Pyrosequencing showed an increase in methylation levels of promoter regions of the MGMT, APC and CDH13 genes in tumor samples by 3 to 5 times. These tumor samples were screened for activating SNP-mutations in the KRAS (40%), NRAS (0%) and BRAF (0%) oncogenes. SNP-mutations in the KRAS gene were accompanied by hypermethylation of one or more promoters of the studied genes. Association of this epigenetic index with tumor metastasis was proved. The data on an increase in methylation of the promoter regions of oncosupressor genes can be used as sensitive prognostic markers of progression and metastasis of colorectal cancer.


Область наук:

  • Біотехнології в медицині

  • Рік видавництва: 2016


    Журнал: Сибірський онкологічний журнал


    Наукова стаття на тему 'Аберрантное метилювання промоторних ділянок генів apc, cdh13 і mgmt у хворих на колоректальний рак'

    Текст наукової роботи на тему «Аберрантное метилювання промоторних ділянок генів apc, cdh13 і mgmt у хворих на колоректальний рак»

    ?DOI: 10.21294 / 1814-4861-2016-15-2-48-55 УДК: 616-006.66: 575.23

    Аберрантное метилювання промоторних ділянок генів apc, cdh13 і mgmtу хворих на колоректальний рак

    О.І. кит, Д.І. Бодолажскій, к.ч. Двадненко, І.І. Єфімова, Е.н. Олейникова, Д.Д. Олейников, н.н. Тимошкина

    ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» Міністерства охорони здоров'я Росії, г Ростов-на-Дону

    344036, г. Ростов-на-Дону, вул. 14-я лінія, 63. E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. Анотація

    Аберрантное метилювання промоторних ділянок генів - основне епігенетичні зміни, що характеризує колоректальні неопластические освіти. У даній роботі було досліджено кількісний рівень метилування 42 CpG-сайтів промоторних ділянок генів MGMT, APC і CDH13 в пухлинах товстої кишки по відношенню до рівня метилування прилеглої умовно нормальної тканини 25 пацієнтів. За допомогою методу піросеквенірованія виявлено підвищення рівня метилування промоторних ділянок генів MGMT, APC і CDH13 в пухлинних зразках від 3 до 5 разів. У цих же зразках пухлин проведено скринінг активують SNP-мутацій в онкогенах KRAS (40%), NRAS (0%) і BRAF (0%). Наявність SNP-мутацій в гені KRAS супроводжувалося гіперметілірованіе одного або більше промоторів досліджених генів. Доведено асоціація цього епігенетичного показника з метастазуванням пухлини. Отримані дані про збільшення метилування промоторних ділянок генів-онкосупрессоров можуть бути використані в якості чутливих прогностичних маркерів прогресування і метастазування колоректального раку.

    Ключові слова: CpG-метилювання, колоректальний рак, гени MGMT, APC, CDH13, CiMP.

    Колоректальний рак (КРР) - гетерогенне злоякісне новоутворення, що займає третє місце в світі в структурі захворюваності і смертності серед інших злоякісних пухлин [2]. У 1988 р B. Vogelstein et al. запропонували першу лінійну модель онкогенеза товстої і прямої кишки [22] на базі історично сформованих уявлень про процес малігнізації тканин як накопиченні в клітці подій хромосомної нестабільності і мутацій в онкогенах і генах-супрессорах. У наступні десятиліття після серйозних успіхів в дослідженні мікрос-теллітной нестабільності (MSI) і метилування генома були описані кілька альтернативних ланцюжків молекулярних подій при розвитку КРР [7]. Основними маркерами запропонованої класифікації КРР, яка об'єднує аберрантние структурні та молекулярні зміни, стали взаємовиключні активують мутації в генах KRAS і BRAF, инактивирующие мутації в гені - онко-супресору АРС, MSI та статус метилювання геному в цілому, і генів MLH1 і MGMT, зокрема [ 10, 17]. Крім визначення клініко-морфологічних особливостей, розуміння ролі генетичних і епігенетичних змін в патогенезі КРР дає інформацію для розробки нових біомаркерів ефективного

    профілактичного скринінгу, вибору таргетной терапії, прогнозування перебігу захворювання та відповіді на лікування.

    Метилирование великих регіонів CpG-острівців (так званий фенотип метилованих CpG острівців або CIMP) - основне епігенетичні зміни, описане в колорек-тальних неопластических утвореннях. Частота виявлення CIMP у випадках спорадичні КРР, за різними оцінками, коливається від 15 до 50% [12].

    APC, CDH13 і MGMT - гени-онкосупрессори, транскрипція яких часто пригнічується в пухлинах людини за допомогою аберантного метилування промоторних ділянок [4, 12, 13], що функціонально еквівалентно інактивуючої мутації [6]. Проте, більшість досліджень з цих та інших генам була отримана за допомогою методу аллель-специфічної PCR (MSP), що володіє рядом методичних обмежень [14]. Наприклад, в разі використання методу MSP важко ідентифікувати фоновий рівень метилування, так як навіть в умовно нормальній тканині може відзначатися негативна епігенетична регуляція активності генів-онкосупресоров, пов'язана, наприклад, з віком [9, 16].

    Мета дослідження - кількісний аналіз CpG-метилування промоторних ділянок

    Тимошкина Наталія Миколаївна, Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. 48 SIBERIAN JOURNAL OF ONCOLOGY. 2016. VOL. 15, № 2. Р. 48-55

    генів-онкосупрессоров APC, CDH13 і MGMT в операційних биоптатах умовно нормальної та пухлинної тканини товстої кишки в поєднанні з ідентифікацією активують SNP-мутацій в генах KRAS, NRAS, BRAF.

    Матеріал і методи

    У дослідження були включені 25 пацієнтів з помірно (G2) і низькодиференційованих (G3) раком товстої кишки (табл. 1), що проходили стаціонарне лікування в ФГБУ РНІОІ в 2013-14 рр. Медіана віку склала 59 років. Кожен пацієнт підписав добровільне інформовану згоду на участь в проведенні дослідження.

    Тотальну ДНК з пухлинних і умовно здорових тканин виділяли методом фенол-хлороформно екстракції [1]. Бісульфітне конвертування ДНК проводили згідно з протоколом, запропонованого K. Patterson et al. [18] у власній модифікації: для видалення бисульфит-іонів використовували набір очищення ДНК з реакційних сумішей (BioSilica, Росія). Кількісне метилювання 42 CpG-сайтів трьох генів (APC, CDH13 іMGMT) оцінювали методом піросеквенірованія з використанням системи генетичного аналізу PyroMark Q24 (Qiagen, Germany). За результатами

    пробних експериментів для напрацювання амплікон і власне піросеквенірованія були обрані праймери (табл. 2). Амплікона, отримані після постановки ПЛР на матриці бисульфит-конвертованій ДНК, піддавали очищенню, денатурації і відмиванні з подальшим відпалом з секвеніруют праймером при 80 ° С і постановкою реакції піросеквенірованія. Постановку піросеквенірованія кожного зразка проводили, як мінімум, в двох повторах. Отримані дані аналізували за допомогою програмного забезпечення PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany). Значення метилування окремого CpG-сайту, розрахованого як відношення змісту нуклео-тідов С / Т (рис. 1), використовували для обчислення усередненого метилування промоторної ділянки кожного гена (Met,%).

    Методом прямого секвенування по Сенгер (АВ3500, LifeTechnologies, USA) ідентифікували мутації в 2, 3 і 4-м екзонах генів KRAS і NRAS. В даний час скринінг наявності мутацій не тільки в гені KRAS, але і NRAS стає обов'язковим для характеристики КРР-пухлин з метою визначення стратегії лікування з використанням таргетних препаратів [20]. Скринінг мутації V600E в гені BRAF здійснювали з

    Мал. 1. Приклад пірограмм промоторной послідовності гена АРС, отриманих за допомогою секвеніруют праймера Ру1 для зразків умовно нормальної (вгорі) і пухлинної (внизу) тканини. Значення співвідношення С / Т вказані у відсотках над

    кожним аналізованих CpG-сайтом

    стадія пухлини

    Гістологічний тип пухлини Диференціація пухлини Пол Вік, років

    використанням набору «Real-Time-PCR-BRAF V600E» ( «Біолінк», Росія).

    Медіана, варіація, U-критерій Манна - Уїтні і статистична достовірність відмінностей були обчислені для кожного CpG-сайту, а також в середньому по безлічі CpG-сайтів кожного гена. Достовірність відмінностей по частотним показниками визначали, використовуючи% 2-тест. Всі розрахунки проведені за допомогою програми Statistica v. 7.0 (Stat Soft Inc, 2004).

    Результати та обговорення

    Типові пірограмми секвенс-аналізу бисульфит-конвертованій ДНК, виділеної з умовно нормальною і пухлинної тканин хворих КРР, продемонстровані на малюнку. Оцінка метилування за окремими CpG-сайтів виявила неефективність цього показника в 10 CpG сайті амплікона APC / Py1 (крайній праворуч на малюнку) і 12 CpG сайті амплікона MGMT / Re2 зважаючи реєстрації низького рівня метилування у всіх пробах (медіана - 19 і 13% відповідно) , що зумовило відсутність достовірних відмінностей між пухлинної і умовно нормальної тканиною.

    Усереднені дані по рівню метилування (Ме ^%) промоторних ділянок кожного гена представлені в табл. 3. У всіх зразках умовно нормальної тканини був зареєстрований «фоновий» рівень Меt промоторних ділянок трьох генів. Порівняльний аналіз зразків пухлинної і умовно нормальної тканин виявив достовірне підвищення тотального показника рівня Меt в тканинах КРР для генів MGMT (p = 0,016) і CDH13 (p<0,001). Однак пухлинні зразки продемонстрували високу гетерогенність за цим показником: по кожному з досліджених генів були зафіксовані випадки як гіпер-, так і гіпо-метилування. Для відображення цього факту ми класифікували вибірку на підгрупи: умовно нормальна тканина (N), колоректальні пухлини в цілому (CRC), пухлини з підвищеним рівнем метилювання в порівнянні з нормою

    5 (20%)

    12 (48%) 8 (32%) 24 (96%)

    1 (4%) 22 (88%) 3 (12%)

    13 (52%) 12 (48%) 10 (40%) 15 (60%)

    (CRC-Met_H), пухлини, що не відрізняються від норми (CRC-Met_L). Метилирование промоторних ділянок генів в підгрупі CRC-Ме ^ Н було статистично достовірно вище, ніж в підгрупах N і CRC-Меt_L по всім генам (p<0,001). Згідно значенням інтерквартільного інтервалу в CRC-Ме ^ Н спостерігали і більш високу варіювання показників рівня Ме1

    Гіперметілірованіе промоторної ділянки гена CDH13 фіксували в 58% випадків, тоді як групи CRC-Меt_Н по двом іншим генам (APC і MGMT) налічували по 40% від обсягу дослідженої вибірки (табл. 3). Двадцять (80%) зразків пухлин КРР з усього проаналізованого нами масиву даних продемонстрували CpG-гіперметілірованіе хоча б по одному гену, з них 4 (16%) були гіперметіліровани по всім трьом генам.

    Статус метилування генів MGMT, APC, CDH13 при КРР був досліджений раніше [12]. Однак всі подібні дослідження були виконані з використанням методу MSP, що виключає пряме порівняння c нашими даними. Можливо, що в силу певних обмежень MSP, що дозволяє провести тільки якісну оцінку CpG-сайтів за принципом високого, середнього та низького рівня метилування, в роботах по дослідженню КРР представлені дуже різнорідні дані частоти гіперметілірованіе генів. Наприклад, по гену APC частота гіперметілірованіе в нашій роботі склала 40% проти 21-28%, визначеної методом MSP; по гену CDH13 - 58% проти 32-65% відповідно [12, 15].

    Ми оцінили кореляцію вікових, тендерних і клінічних показників (табл.1) з рівнем CpG-метилування досліджених промоторних ділянок. Раніше було показано відсутність асоціацій між віковими, гендерними, гістологічними показниками і статусом CpG-метилування гена APC в неопластических утвореннях товстої кишки [5]. За даними інших дослідників, з віком відбувається збільшення рівня метилування

    Таблиця 1

    Клініко-морфологічна характеристика пацієнтів

    Параметри Кількість хворих

    T3N0M0

    Т3-ДМО

    T3-4N1-2M1

    Аденокарцинома Слизистий рак

    G2 G3

    жінки <55 >55

    Таблиця 2

    Послідовність праймерів (5'-3 ') для піросеквенірованія [14]

    ген

    прямий праймер

    зворотний праймер

    секвеніруют праймер

    APC biotin - ttt ttt tgt ttg ttg ggg att

    APC - /-

    CDH13 ttg gga agt tgg ttg gtt g

    MGMT (Fw) gga tat gtt ggg ata gtt

    MGMT (Re) biotin- gga tat gtt ggg ata gtt

    act aca cca ata caa cca cat atc - / biotin - aca acc cct ctt ccc tac ct biotin-aca aca cct aaa aaa cac tta aaa c

    aca ac acct aaa aaa cac tta aaa c

    Py1: aca caa cta ctt ctc tct cc Py2: ccc aca ccc aac caa gga aaa tat gtt tag tgt ag

    gat ttg gtg agt gtt tgg gt

    acc acc aca ctc acc aaa tc

    Таблиця 3

    Метилирование промоторних ділянок генів APC, MGMT і CDH13 в умовно нормальній та пухлинній тканинах

    N 25 6,0%

    APC CRC-Md_H 10 (40%) 31,8%

    CRC-Md_L 15 (60%) 4,5%

    CRC 25 9,0%

    N 24 10,0%

    CDH13 CRC-Md_H 14 (58%) 25,8%

    CRC-Mct_L 10 (42%) 9,5%

    CRC 24 16,5%

    N 25 3,0%

    MGMT CRC-Md_H 10 (40%) 10,5%

    CRC-Mct_L 15 (60%) 2,8%

    CRC 25 4,0%

    Примітки: * - статистично значущі відмінності.

    багатьох інших генів-супресорів пухлин [9, 16], в той же час вік - головний фактор ризику ініціації КРР [2]. У нашому дослідженні не було виявлено кореляції віку та статі пацієнтів з рівнем метилювання досліджених CpG-сайтів в умовно нормальній тканині, а також не виявлено зв'язку цих показників з частотою гіперметілірованіе в пухлинної тканини (табл. 2, 3). Значення достовірності ймовірності відмінностей статусу метилювання гена MGMT в різних вікових групах (р = 0,064), очевидно, відображає тенденцію поступового збільшення CpG-метилування даного промоторної ділянки в нормальному епітелії в міру старіння організму, що узгоджується з встановленим возрастзавісімим метилированием іншого гена mismatch-репарації МЬН1 [16]. Незважаючи на пропозицію ряду дослідників виключати возрастзавісімих маркери метилування з панелей визначення С1МР, відмінності в рівнях метилування таких генів у осіб одного віку припускають наявність і інших невідомих чинників, що провокують КРР-асоційовані епігенетичні зміни [7].

    4,3-7,5%

    11,6-34,5% <0,001 *

    3,0-8,0% 0,212

    3,5-14,0% 0,195

    8,0-11,8%

    20,8-31,4% <0,001 *

    8,0-14,4% 0,814

    12,0-26,4% <0,001 *

    2,0-4,0%

    9,3-16,3% <0,001 *

    2,0-4,0% 0,924

    2,1-10,0% 0,016 *

    Аберрантное метилювання ДНК присутня не тільки на ранніх етапах канцерогенезу, але і є ознакою метастатичного, прогресуючого раку. Так, було показано, що гіперметілірованіе промоторної ділянки гена APC корелює з більш високим ризиком розвитку аденокарциноми з колоректальной аденоми [5] і зустрічається частіше в метастазах в печінку, ніж в первинних пухлинах КРР [4]. Навпаки, метилювання промоторної ділянки гена CDH13 частіше зустрічається в неметастазірующіх пухлинах [8], що, очевидно, пов'язано з багатофункціональністю продукту цього гена - Т-кадгерінов, який, бере участь як в придушенні зростання клітин шляхом контактного гальмування, так і в стимулюванні ангіогенезу в деяких пухлинах. У нашому дослідженні CpG-метилювання промоторної ділянки гена CDH13 було присутнє в 20% випадків КРР без метастазів; в 58% випадків КРР з метастатичними враженнями регіонарних лімфатичних вузлів (T3-4NjMq) і в 50% випадків КРР з віддаленими метастазами (TNMj).

    В цілому порівняння частоти виникнення гіперметілірованіе хоча б по одному гену в

    Таблиця 4

    Асоціація метастазування і метилування промоторних ділянок генів APC, CDH13, MGMT

    в CRC з мутаціями гена KRAS

    Мутація гена KRAS Кількість КРР з мута- Стадія пухлини Медіана Met

    єю ТзК0М0 Т-ДЧ Т3-Д-2М1 APC CDH13 MGMT

    4 + 35,8% * 6,8% 4,2%

    p.G12D + + + 7,7% 43,5% * 9,1% 51,2% * 25.0% * 31.1% * 2,7% 13,4% * 10,7% *

    2 + 14,2% * 33,5% * 5,3%

    p.G12C + 5,4% 20,3% * 10,6% *

    p.G13D 1 + 13,2% * 24,4% * 16,4% *

    p.G12S 1 + 3,8% 59,3% * 11,0% *

    p.G12V 1 + 32,3% * 25,7% * 3,0%

    p.Q61H 1 + 11,6% 14,7% * 35,8% *

    Разом 10 1 8 1 5 10 7

    Примітка: * значення Met пухлинної тканини статистично значимо відрізняються від рівня Met умовно нормальної тканини (p<0,05).

    дослідженою нами вибірці дозволяло статистично достовірно диференціювати групу КРР без метастазування (T3N0M0) від груп тільки з метастазами в регіонарні лімфатичні вузли (T3 4NjM0) (х2 = 6,39, р = 0,019) і з віддаленими метастазами (T3-4N1_2M1) (х2 = 6,52, р = 0,017). Частота випадків з достовірним підвищенням CpG-метилування в цих групах склала 40% (T3N0M0), 83% (T3-4N1M0) і 87% (T ^ N ^).

    Центральне місце в описі молекулярно-генетичного профілю злоякісних новоутворень слизової товстої і прямої кишки відводиться активує мутацій в генах BRAF і KRAS [15, 17, 21], які розглядаються як події, які ініціюють різні сигнальні шляхи канцерогенезу. Незважаючи на встановлену раніше частоту мутації BRAF V600E від 8 до 15% для випадків спорадичного КРР [21], в дослідженої нами вибірці не було виявлено пухлин з позитивним статусом за цією мутацією.

    У 10 (40%) пацієнтів було визначено 6 типів мутацій в гені KRAS (табл. 4) і жодної мутації в гені NRAS. Частота мутацій в гені KRAS і розподіл ідентифікованих типів SNP відповідали частоті їх народження в популяції хворих КРР, за даними COSMIC [3] і нашими власними даними [11]. Проведено ідентифікацію за допомогою методу прямого секвенування по Сенгер досить рідкісної мутації p.Q61H в 3-м екзонів гена KRAS (<1%).

    У всіх 10 випадках при наявності активують SNP-мутацій в гені KRAS також було визначено гіперметілірованіе промоторної ділянки хоча б одного з трьох досліджених генів (табл. 4). Відома асоціація гіперметілірованіе гена mismatch-репарації MGMT з мутаціями в гені KRAS [15, 20] не настільки очевидна в нашому дослідженні, так як статистично значуще підвищення

    рівня метилування в промоторних ділянці гена MGMT зафіксовано в 50% випадків з мутантним геном KRAS.

    Для злоякісних новоутворень в товстій і прямій кишці, що характеризуються наявністю мутацій в гені KRAS і відсутністю або низьким рівнем CIMP, в інших дослідженнях показано більш сприятливий перебіг хвороби з більшою загальною виживання в порівнянні з пухлинами, що несуть мутації в гені BRAF V600 і CIMP-фенотип [ 19]. У нашому дослідженні були виділені групи КРР за ознакою метастазування - основного показника прогресування захворювання. Основна частка активують мутацій в гені KRAS була ідентифікована в зразках КРР з метастазами в регіонарні лімфовузли (80%). За однією SNP було виявлено в інших групах: КРР без метастазів і КРР з віддаленими метастазами (табл. 4). Звертає увагу різний характер розподілу в дослідженої вибірці подій гіперметілірованіе промоторних ділянок і активують мутацій в гені KRAS при відсутності мутацій в гені BRAF. Виявлена ​​тенденція вказує на можливість використання показників рівня метилування досліджених генів як маркерів прогресування КРР в разі пухлин, що несуть мутацію в гені KRAS.

    висновок

    Використання методу піросеквенірованія дозволило продемонструвати статистично достовірне збільшення рівня метилування промоторних ділянок генів-онкосупрессоров APC, CDH13, MGMT в пухлинах КРР в порівнянні із зразками нормальної тканини в 40 56 і 32% випадків відповідно. Рівень CpG-метилування генів в нашому дослідженні не корелював з віком і статтю хворих КРР.

    Статус гіперметілірованіе по одному і більше гену був зафіксований в усіх 10 зразках пухлини з мутаціями в гені KRAS, однак не було виявлено достовірної кореляції між цими показниками. Мутації в гені KRAS переважали в тканинах пухлин КРР з метастазами в регіонарні лімфовузли (67% випадків T3-4NjM0), а CpG-гіперметілірованіе від 1 до 3 досліджених генів було статистично достовірно асоційоване з формуванням як віддалених метастаз (% 2 = 6,52, р = 0,017), так і з метастатичними враженнями регіонарних лімфовузлів (% 2 = 6,39, р = 0,019).

    ЛІТЕРАТУРА

    1. Корнієнко І.В., Водолазький Д.І., Вейко В.П., Щербаков В.В., Іванов П.Л. Підготовка біологічного матеріалу для молекулярно-генетичних ідентифікаційних досліджень при масовому надходженні невпізнаних тіл. Ростов н / Д: ТОВ «Ростіздат», 2001. 256 с.

    2. ОдінцоваІ.Н., Писарєва Л.Ф., Хряпенков А.В. Епідеміологія злоякісних новоутворень в світі // Сибірський онкологічний журнал. 2015. № 5. С. 95-101.

    3. Catalogue of somatic mutations in cancer - COSMIC (http: // cancer. Sanger.ac.uk/cosmic 11.11.2015).

    4. Chen J., Rocken C., Lofton-Day C., Schulz H.U., Muller O., KutznerN., MalfertheinerP., EbertM.P. Molecular analysis of APC promoter methylation and protein expression in colorectal cancer metastasis // Carcinogenesis. 2005. Vol. 26 (1). P. 37-43.

    5. DingZ.Y., Jiang T., Piao Y., Han T., Han Y.L., XieX.D. Meta-analysis of the association between APC promoter methylation and colorectal cancer // Onco Targets Ther. 2015. Vol. 5 (8). P. 211-222. doi: 10.2147 / OTT.S75827.

    6. EstellerM. Molecular origins of cancer: epigenetics in cancer // N. Engl. J. Med. 2008. Vol. 358 (11). P. 1148-1096.

    7. Grady W.M., Carethers J.M. Genomic and epigenetic instability in colorectal cancer pathogenesis // Gastroenterology. 2008. Vol. 135 (4). P. 1079-1099. doi: 10.1053 / j.gastro.2008.07.076.

    8. Hibi K., Nakao A. Lymph node metastasis is infrequent in patients with highly-methylated colorectal cancer // Anticancer Res. 2006. Vol. 26 (1A). P. 55-58.

    9. Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types // Genome Biol. 2013. Vol. 14 (10). R. 115.

    10. Jass J.R. Colorectal cancer: a multipathway disease // Critical Reviews in Oncogenesis. 2006. Vol. 12 (3-4). P. 273-287.

    11. KitO.I., VodolazhskiyD.I., Gevorkyan Y.A., SoldatkinaN.V. KRAS gene mutations and gender differences in colorectal cancer // Int. J. Biomed. 2015. Vol. 5 (1). P. 11-15.

    12. Kim M.S., Lee J., Sidransky D. DNA methylation markers in colorectal cancer // Cancer Metastasis Rev. 2010. Vol. 29 (1). P. 181-206. doi: 10.1007 / s10555-010-9207-6.

    13. KonticM., Stojsic J., JovanovicD., Bunjevacki V., Ognjanovic S., Kuriger J., Puumala S., Nelson H.H. Aberrant promoter methylation of CDH13 and MGMT genes is associated with clinicopathological characteristics of primary non small cell lung carcinoma // Clin. Lung Cancer. 2012. Vol. 13 (4). P. 297-303.c doi: 10.1016 / j.cllc.2011.11.003.

    Таким чином, кількісне визначення рівня метилування промоторів генів APC, CDH13, MGMT представляється перспективним для прогнозування прогресування захворювання як в разі КРР, несучих активують SNP в гені KRAS, так і у випадках пухлин без мутацій в онкогенах KRAS і BRAF. Кількісна оцінка рівня CpG-метилування промоторів генів APC, CDH13, MGMT в тканинах пухлин та умовно здорової тканини пацієнтів з КРР дозволяє розглядати використання цих показників як чутливих і маркерів прогресування і ме-тастазірованія колоректального канцерогенезу.

    14. Lof-Ohlin Z.M., Nilsson T.K. Pyrosequencing assays to study promoter CpG site methylation of the O6-MGMT, hMLH1, p14ARF, p16INK4a, RASSF1A, and APC1A genes // Oncol. Rep. 2009. Vol. 21 (3). P. 721-729.

    15. Nagasaka T., Sasamoto H., Notohara K., Cullings H.M., Takeda M., Kimura K., Kambara T., MacPhee D.G., Young J., LeggettB.A., Jass J. R., TanakaN., MatsubaraN. Colorectal сancer with mutation in BRAF, KRAS, and wild-type with respect to both oncogenes showing different patterns of DNA methylation // Clin. Oncol. 2004. Vol. 22 (22). P. 4584-4594.

    16. Nakagawa H., Nuovo GJ, Zervos EE, Martin EW, Salova-ara Jr.R., Aaltonen LA, de la Chapelle A. Age-related hypermethylation of the 5 'region of MLH1 in normal colonic mucosa is associated with microsatellite -unstable colorectal cancer development // Cancer Res. 2001. Vol. 61 (19). P. 6991-6995.

    17. Ogino S., Goel A. Molecular classification and correlates in colorectal cancer // J. Mol. Diag. 2008. Vol. 10 (1). P. 13-27. doi: 10.2353 / jmoldx.2008.070082.

    18. Patterson K., Molloy L., Qu W., Clark S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis // J. Vis. Exp. 2011. Vol. 56. pii. 3170. doi: 10.3791 / 3170.

    19. Phipps A.I., Limburg P.J., Baron J.A., Burnett-Hartman A.N., WeisenbergerD.J., LairdP.W., SinicropeFA., Rosty C., BuchananD.D., Potter J.D., Newcomb P.A. Association Between Molecular Subtypes of Colorectal Cancer and Patient Survival // Gastroenterology. 2015. Vol. 148 (1). P. 77-87. doi: 10.1053 / j.gastro.2014.09.038.

    20. Taniguchi H., Yamazaki K., Yoshino T., Muro K., Yatabe Y., Wa-tanabe T., Ebi H., Ochiai A., Baba E., Tsuchihara K. Japanese Society of Medical Oncology Clinical Guidelines : RAS (KRAS / NRAS) mutation testing in colorectal cancer patients // Cancer Sci. 2015. Vol. 106 (3). P. 324-327. doi: 10.1111 / cas.12595.

    21. de Vogel S., Weijenberg M.P., Herman J.G., Wouters K.A., de Goeij A.F., van den Brandt P.A., de Bruine A.P., van EngelandM. MGMT and MLH1 promoter methylation versus APC, KRAS and BRAF gene mutations in colorectal cancer: indications for distinct pathways and sequence of events // Ann Oncol. 2009. Vol. 20 (7). P. 1216-1222. doi: 10.1093 / annonc / mdn782.

    22. Vogelstein B., Fearon E.R., Hamilton S.R., Kern S.E., Preisin-gerA.C., LeppertM., Nakamura Y., WhiteR., SmitsA.M., Bos J.L. Genetic alterations during colorectal tumor development // N. Engl. J. Med. 1988. Vol. 319 (9). P. 525-532.

    надійшла 22.12.15.

    Прийнята до друку 10.02.16.

    ВІДОМОСТІ ПРО АВТОРІВ

    Кіт Олег Іванович, доктор медичних наук, заслужений лікар РФ, професор, директор ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). SPIN-код: 1728-0329. Водолазький Дмитро Ігорович, кандидат біологічних наук, керівник лабораторії молекулярної онкології ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-код: 6660-5361.

    Двадненко Костянтин Володимирович, кандидат медичних наук, старший науковий співробітник лабораторії молекулярної онкології ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-код: 4497-1769.

    Олейников Денис Діамідовіч, молодший науковий співробітник лабораторії молекулярної онкології ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її..

    Олейникова Олена Миколаївна, молодший науковий співробітник лабораторії молекулярної онкології ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-код: 5840-4093.

    Єфімова Ірина Юріївна, молодший науковий співробітник лабораторії молекулярної онкології ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-код: 1982-5034.

    Тимошкина Наталія Миколаївна, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник лабораторії молекулярної онкології ФГБУ «Ростовський науково-дослідний онкологічний інститут» МОЗ Росії (м Ростов-на-Дону, Російська Федерація). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-код: 9483-4330

    Автори даної статті підтвердили відсутність фінансової підтримки / конфлікту інтересів, про який необхідно повідомити

    aberrant methylation of the promoter of apc, cdh13 and mgmt genes in colorectal

    cancer patients

    O.I. Kit, D.I. Vodolazhskiy, K.V. Dvadnenko, I.I. Efimova, E.N. Oleynikova, D.D. Oleynikov, N.N. Timoshkina

    Rostov Cancer Research Institute of the Ministry of Health, Rostov-on-Don

    63, 14th line Street, 344037-Rostov-on-Don, Russia. E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

    Abstract

    Aberrant methylation of gene promoter regions is the main epigenetic change characterizing colorectal cancer. Methylation levels of 42 CpG-sites of promoter regions of the MGMT, APC and CDH13 genes in colorectal cancer were studied in comparison with methylation levels of the adjacent normal tissue in 25 patients. Pyrosequencing showed an increase in methylation levels of promoter regions of the MGMT, APC and CDH13 genes in tumor samples by 3 to 5 times. These tumor samples were screened for activating SNP-mutations in the KRAS (40%), NRAS (0%) and BRAF (0%) oncogenes. SNP-mutations in the KRAS gene were accompanied by hypermethylation of one or more promoters of the studied genes. Association of this epigenetic index with tumor metastasis was proved. The data on an increase in methylation of the promoter regions of oncosupressor genes can be used as sensitive prognostic markers of progression and metastasis of colorectal cancer.

    Key words: CpG-methylation, colorectal cancer, MGMT, APC, CDH13, CIMP.

    REFERENCES

    1. Kornienko I.V., Vodolazhskij D.I., Vejko V.P., Shherbakov V.V., IvanovP.L. Preparation of biological material for molecular-genetic identification surveys at mass admission of unidentified bodies. Rostov-on-Don: «Rostizdat», 2001. 256 p. [In Russian]

    2. Odintsova I.N., Pisareva L.F., Hryapenkov A.V. Epidemiology of malignant tumors in the world // Sibirskij onkologicheskij zhurnal. 2015. № 5. P. 95-101. [In Russian]

    3. Catalogue of somatic mutations in cancer - COSMIC (http: // cancer. Sanger.ac.uk/cosmic 11.11.2015).

    4. Chen J., Rocken C, Lofton-Day C., Schulz H. U., Muller O., Kutzner N, Malfertheiner P., Ebert M.P. Molecular analysis of APC promoter methylation and protein expression in colorectal cancer metastasis // Carcinogenesis. 2005. Vol. 26 (1). P. 37-43.

    5. Ding Z.Y., Jiang T., Piao Y., Han T., Han Y.L., XieX.D. Meta-analysis of the association between APC promoter methylation and colorectal cancer // Onco Targets Ther. 2015. Vol. 5 (8). P. 211-222. doi: 10.2147 / OTT.S75827.

    6. Esteller M. Molecular origins of cancer: epigenetics in cancer // N. Engl. J. Med. 2008. Vol. 358 (11). P. 1148-1096.

    7. Grady W.M., Carethers J.M. Genomic and epigenetic instability in colorectal cancer pathogenesis // Gastroenterology. 2008. Vol. 135 (4). P. 1079-1099. doi: 10.1053 / j.gastro.2008.07.076.

    8. Hibi K., Nakao A. Lymph node metastasis is infrequent in patients with highly-methylated colorectal cancer // Anticancer Res. 2006. Vol. 26 (1A). P. 55-58.

    9. Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types // Genome Biol. 2013. Vol. 14 (10). R. 115.

    10. Jass J.R. Colorectal cancer: a multipathway disease // Critical Reviews in Oncogenesis. 2006. Vol. 12 (3-4). P. 273-287.

    11. Kit O.I., Vodolazhskiy D.I., Gevorkyan Y.A., Soldatkina N.V. KRAS gene mutations and gender differences in colorectal cancer // Int. J. Biomed. 2015. Vol. 5 (1). P. 11-15.

    12. Kim M.S., Lee J., Sidransky D. DNA methylation markers in colorectal cancer // Cancer Metastasis Rev. 2010. Vol. 29 (1). P. 181-206. doi: 10.1007 / s10555-010-9207-6.

    13. KonticM., Stojsic J., JovanovicD., Bunjevacki V., Ognjanovic S., Kuriger J., Puumala S., Nelson H.H. Aberrant promoter methylation of CDH13 and MGMT genes is associated with clinicopathological characteristics of primary non small cell lung carcinoma // Clin. Lung Cancer. 2012. Vol. 13 (4). P. 297-303.c doi: 10.1016 / j.cllc.2011.11.003.

    14. Lof-Ohlin Z.M., Nilsson T.K. Pyrosequencing assays to study promoter CpG site methylation of the O6-MGMT, hMLH1, p14ARF, p16INK4a, RASSF1A, and APC1A genes // Oncol. Rep. 2009. Vol. 21 (3). P. 721-729.

    15. Nagasaka T., Sasamoto H., Notohara K., Cullings H.M., Takeda M., Kimura K., Kambara T., MacPhee D.G., Young J., Leggett B.A., Jass J. R., TanakaN., MatsubaraN. Colorectal cancer with mutation in BRAF, KRAS, and wild-type with respect to both oncogenes showing different patterns of DNA methylation // Clin. Oncol. 2004. Vol. 22 (22). P. 4584-4594.

    16. Nakagawa H., Nuovo GJ, Zervos EE, Martin EW, Salova-ara Jr.R., Aaltonen LA, de la Chapelle A. Age-related hypermethylation of the 5 'region of MLH1 in normal colonic mucosa is associated with microsatellite -unstable colorectal cancer development // Cancer Res. 2001. Vol. 61 (19). P. 6991-6995.

    17. Ogino S., GoelA. Molecular classification and correlates in colorectal cancer // J. Mol. Diag. 2008. Vol. 10 (1). P. 13-27. doi: 10.2353 / jmoldx.2008.070082.

    18. Patterson K., Molloy L., Qu W, Clark S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis // J. Vis. Exp. 2011. Vol. 56. pii. 3170. doi: 10.3791 / 3170.

    19. Phipps A.I., Limburg P.J., Baron J.A., Burnett-Hartman A.N., Weisenberger D.J., Laird P.W., Sinicrope FA., Rosty C., Buchanan D.D., Potter J.D., Newcomb P.A. Association Between Molecular Subtypes of Colorectal Cancer and Patient Survival // Gastroenterology. 2015. Vol. 148 (1). P. 77-87. doi: 10.1053 / j.gastro.2014.09.038.

    20. Taniguchi H., Yamazaki K., Yoshino T., Muro K., Yatabe Y., Wa-tanabe T., Ebi H., Ochiai A., Baba E., Tsuchihara K. Japanese Society

    of Medical Oncology Clinical Guidelines: RAS (KRAS / NRAS) mutation testing in colorectal cancer patients // Cancer Sci. 2015. Vol. 106 (3). P. 324-327. doi: 10.1111 / cas.12595.

    21. de Vogel S., Weijenberg MP, Herman JG, Wouters KA, de Goeij AF, van den Brandt PA, de Bruine AP, van Engeland M. MGMT and MLH1 promoter methylation versus APC, KRAS and BRAF gene mutations in colorectal cancer: indications for distinct pathways and sequence of events // Ann Oncol. 2009. Vol. 20 (7). P. 1216-1222. doi: 10.1093 / annonc / mdn782.

    22. Vogelstein B., Fearon E.R., Hamilton S.R., Kern S.E., Preisinger A.C., LeppertM., Nakamura Y., WhiteR., SmitsA.M., Bos J.L. Genetic alterations during colorectal tumor development // N. Engl. J. Med. 1988. Vol. 319 (9). P. 525-532.

    Received 22.12.15. Accepted 10.02.16.

    ABOUT THE AUTHORS

    Kit Oleg I., MD, DSc, Professor, Director of the Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). SPIN-code: 17280329.

    Vodolazhskij Dmitrij I., PhD, Head of Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-code: 6660-5361.

    Dvadnenko Konstantin V., MD, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-code: 4497-1769.

    Olejnikov Denis D., Junior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її..

    Olejnikova Elena N., Junior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-code: 5840-4093.

    Efimova Irina Yu., Junior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-code: 1982-5034.

    Timoshkina Natal'ja N., PhD, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology (Rostov-on-Don, Russia). E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.. SPIN-code: 9483-4330.

    Authors declare lack of the possible conflicts of interests


    Ключові слова: CPG-метилування /колоректальний рак /гени MGMT /APC /CDH13 /CIMP /CPG-METHYLATION /COLORECTAL CANCER /MGMT

    Завантажити оригінал статті:

    Завантажити