Cellular Therapy and Transplantation
Наукова стаття на тему 'A novel method of dimethyl sulfoxide introduction improves preservation of cryopreserved hematopoietic stem cells'

Текст наукової роботи на тему «A novel method of dimethyl sulfoxide introduction improves preservation of cryopreserved hematopoietic stem cells»

?A novel method of dimethyl sulfoxide introduction improves preservation of cryopreserved hematopoietic stem cells

Evgeniy V. Korotaev, Sergey V. Andrunkin, Andrey A. Stepanov, Sergey S. Ponomarev, Aleksey N. Kosarev, Svetlana S. Karakalcheva

Yugra Research Institute of Cellular Technologies with Stem Cell Bank, Khanty-Mansiysk, Russia

Contact: Dr. Evgeniy V. Korotaev E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Introduction

Ensuring high and predictable safety of stored hematopoietic stem cells (HSC) after their thawing and performing autol-ogous transplantation is one of the main conditions for the further successful recovery of hemopoiesis after high-dose chemotherapy in patients with hemoblastosis. It is believed that the method of cryopreservation HSC has long been worked out and leads to the expected results, therefore usually used harvested HSC dose only. However, with the use of modern and reliable quality control, universally applied cryopreservation methods of HSC can not always warrant sufficient integrity of these cells (Table 1).

It is well known that the safety of stored HSC is provided by a cryoprotectant, which prevents the cells from osmotic shock when they are frozen and thawed. A cryoprotectant with dimethyl sulfoxide (DMSO) is generally introduced via a syringe into the HSC suspension. At the same time, the final DMSO concentration in 5-10% is reached already in the cryopacket with the graft. However, a cryoprotectant with concentrated DMSO (more than 50%) upon contact with the cell, in view of its physicochemical properties, can lead to its partial destruction before freezing. Thus, increasing safety for HSC can be reduced by destructive effects, which may be due to the initially high concentration of DMSO in the cryoprotectant. To this end, we developed and tested a new method for introducing DMSO into the HSC transplant using a specially designed apparatus, i.e., an automated DMSO introduction system (patent pending). The principle of op-

eration of this system excludes prolonged contact of concentrated DMSO with HSC transplant.

Aim

The aim of our study was to compare the safety of HSCs using an automated and manual method of DMSO introduction.

Materials and methods

Peripheral blood stem cell samples (n = 25) were obtained by apheresis from the patients with oncohematological diseases. For the control series (group I), DMSO introduction into a cryopacket with HSC graft was performed manually. In experimental series (group II), DMSO was introduced into the HSC transplant by a new automated method. A standard cryoprotectant (55% DMSO Dex 40) was used, the final DMSO concentration was 7.5%. Freezing (at the same time groups I and II) was performed in a software-assisted freezer with a validated 6-step program. Storage was carried out in liquid nitrogen. The cryopackets were thawed in a water bath at +40 for 1 min. Evaluation of viable HSCs numbers and their total colony-forming activity (CFU) was performed before and after the cryoprotection, as well as after thawing. To get more reliable results, the defrosted samples were taken from the cryopackets. The amounts of HSC was estimated by flow cytometric assay (CD34 + / CD45dim / 7AAD pheno-type), according to the ISHAGE protocol. The colony-forming activity of HSC was evaluated by culturing them for 14 days (Methocult H4435) followed by counting total colonies (CFU).

Table 1. Role of quality control at various stages of graft handling

STAGE Quality control (QC) Aims of the QC

Commonly Required

Harvesting HSK Yes Yes Determining the dose of HSK

DMSO introduction and freezing No Yes Predict probable losses

Defrosting and transplantation No Yes Determine the transplanted dose

TOTAL Not predictable Yes predictable Evaluate the duration of hematopoiesis recovery

DMSO introduction method Recovery

HSC,% 7AAD,% CFU (total),%

I Manual mode 88,2 93,1 97,8

II Automated method 88,3 94,2 99,2

Table 2. Quality control results after different procedures of DMSO introduction

Results

Similar viability indexes were revealed when testing the samples from the treatment series I and II. This fact may be due to the same incubation effect of DMSO on HSC, related to the duration of the analysis by flow cytometry. Thus, the exposure effect of DMSO on HSC is modelled. Hence, in absence of immediate freezing of HSC after DMSO introduction, the damaging effects are associated with the destructive physico-chemical effects of DMSO to cells, regardless of the manner of DMSO introduction.

It is generally accepted to freeze the transplant immediately after DMSO introduction. During this short time interval, only those cell lesions that are manifested immediately after the initial exposure to DMSO are conserved. Therefore, the dependence of the quality control of HSC safety after introducing the cryoprotectant by the method 2 could be more reliably estimated after defrosting.

a? 100

g 80

і (U cc

60 40 20 0

92,5

94

802 ш ш 87,6

80,2 58 64,6

MANUAL AUTOMATED

HSC 7AAD | CFU

Figure 1. Recovery of total HSCs, viable cells and colony-forming units in cryopreserved HSCs treated with DMSO at different regimens

According to the results shown in the figure 1, the safety of HSC after defrosting is significantly higher by 14% (p<0.05) when using the automated system in comparison with manual mode. Given all other equal conditions, the total losses of HSC after defrosting with the manual method averaged 20%, with an automated technique, 6%. At the same time, 6% include both HSC losses when DMSO is introduced, and HSC losses during the freezing procedure. Therefore, the losses caused by freezing can be assumed to be the same when using different methods of introducing DMSO. Therefore, in the manual process, the losses are associated with the step of DMSO introduction. We are thinking that the average preservation rate of 94% is due to the method of introducing DMSO using an automated system. The principle of operation of the automated system allows one to reduce the momentary damaging effect of the initial concentrated DMSO solution on HSC and to ensure its smoother dilution to the required final DMSO concentration of 7.5%. The results presented in the table and in the figure also show that DMSO at the stage of introduction at exposure may have a greater negative impact on HSC than the procedure for freezing the graft.

Conclusion

The safety of HSC when using an automated system is significantly higher by 14% compared to manual mode.

Keywords

Hematopoietic stem cells, cryopreservation, dimethyl sul-foxide, autologous transplantation.

Новий спосіб введення ДМСО підвищує збереження КРІОКОН-сервірованих гемопоетичних стовбурових клітин

Євген В. Коротаєв, Сергій В. Андрюнькін, Андрій А. Степанов, Сергій А. Пономарьов, Олексій Н. Косарєв, Світлана С. Каракальчева

АУ «Югорський НДІ клітинних технологій», Ханти-Мансійськ, Російська Федерація

Вступ

Забезпечення високої і прогнозованою збереження гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) після їх розморожування і проведення аутологічної трансплантації - одна з ключових умов для подальшого успішного відновлення гемопоезу після високодозової хіміотерапії у пацієнтів з гемобластозами. Вважається, що методика кріоконсервування ГСК давно відпрацьована і призводить до очікуваних результатів, тому зазвичай враховується тільки заготовлена ​​доза ГСК. Однак, при використанні сучасного і достовірного контролю якості, повсюдно застосовуються методи кріоконсервації ГСК не завжди можуть гарантувати достатню збереження даних клітин (Табл. 1).

Загальновідомо, що національна безпека ГСК при зберіганні забезпечує кріопротектор, що захищає клітини від осмотичного шоку при їх заморожуванні. Кріопротектор з ДМСО загальноприйнято вводити за допомогою шприца в трансплантат ГСК. При цьому кінцева концентрація ДМСО в 5-10% досягається вже в кріопакетов з трансплантатом. Однак кріопротектор з концентрованим ДМСО (більше 50%) при контакті з кліткою, зважаючи на свої фізико-хімічних властивостей, може привести до її часткової деструкції ще до заморожування. Таким чином, підвищити безпеку ГСК можна знизивши деструктивний вплив, яке може бути пов'язане з вихідною високою концентрацією ДМСО в кріопрово-Тектор. Для цього нами розроблено та апробовано новий спосіб введення ДМСО в трансплантат ГСК при

не відрізняється. Ідентичні результати, ймовірно, обумовлені однаковим інкубаційним впливом ДМСО на ГСК, пов'язаних з тривалістю проведення аналізу методом проточної цитометрії. Тим самим моделюється експозиційне вплив ДМСО на ГСК. З цього випливає, що при відсутності негайного заморожування ГСК після введення ДМСО, що ушкоджують ефекти пов'язані з деструктивними фізико-хімічними властивостями ДМСО по відношенню до клітин, причому не залежно від способу введення ДМСО.

Загальноприйнято негайно заморожувати трансплантат відразу після введення ДМСО. У цей короткий часовий проміжок будуть законсервовані тільки ті пошкодження клітин, які проявилися одразу після первинного впливу ДМСО. Тому залежність контролю якості збереження ГСК після введення кріопротектори за методом 2 може бути оцінена з більшою вірогідністю після розморожування. Контроль якості після розморожування відображений на рис. 1.

Згідно з представленими на малюнку результатами, збереження ГСК після розморожування достовірно вище на 14% (p<0.05) при використанні автоматизованої системи в порівнянні з ручним способом.

За інших рівних умов дослідження, сумарні втрати ГСК після розморожування при ручному способі склали в середньому 20%, при автоматизованому - 6%. Вони включають втрати ГСК при введенні ДМСО, а також втрату ГСК в процесі заморожування. Тому втрати, викликані заморожуванням, можна прийняти як однакові при використанні різних способів введення ДМСО. Отже, при ручному способі втрати пов'язані з етапом введення ДМСО. Ми вважаємо, що середня збереження в 94% зумовлена ​​способом введення ДМСО з використанням автоматизованої системи. Принцип роботи автоматизованої системи дозволяє знизити одномоментне шкідливу вплив вихідного концентрованого розчину ДМСО на ГСК і забезпечити його більш плавне

Таблиця 1. Роль контролю якості на різних етапах роботи з трансплантатом

ЕТАП Контроль якості Завдання контролю

загальноприйнято Необхідний

Заготівля ГСК Так Так Визначити дозу ГСК

Введення ДМСО і заморожування Ні Так Спрогнозувати ймовірні втрати

Розморожування і трансплантація Ні Так Визначити трансплантовану дозу ГСК

ПІДСУМОК Чи не передбачувано Так передбачувано Оцінити термін відновлення кровотворення

Таблиця 2. Контроль якості гемопоетичних стовбурових клітин безпосередньо після введення ДМСО

Спосіб введення ДМСО Збереження

ГСК,% 7AAD,% КУО (сум),%

I Ручний спосіб 88,2 93,1 97,8

II Автоматизований спосіб 88,3 94,2 99,2

допомогою спеціального сконструйованого апарата -автоматизоване системи введення ДМСО (на стадії патентування). Принцип дії даної системи виключає тривалий контакт концентрованого ДМСО з трансплантатом ГСК.

мета

Мета роботи полягала в порівнянні збереження ГСК при використанні автоматизованого і ручного способу введення ДМСО.

матеріали та методи

Лейкоконцентрате ГСК периферичної крові (n = 25), отриманий шляхом аферезу у пацієнтів з онкогематоло-ня захворюваннями. Контрольна група I - введення ДМСО в кріопакет з трансплантатом ГСК виконували ручним способом. Досвідчена група II - введення ДМСО в трансплантат ГСК виконували новим автоматизованим способом. Використовували стандартний кріопротектор (55% DMSO Dex 40), кінцева концентрація ДМСО - 7,5%. Заморожування (одночасно групи I і II) проводили на програмному заморожуванню-тілі по валідованого 6-ти ступінчастою програмі. Зберігання здійснювали в рідкому азоті. Розморожування кріопакетов проводили на водяній бані при +40 протягом 1 хв. Аналіз кількості життєздатних ГСК і їх сумарної колонієутворюючих активності (КУО) виконувався до і після введення кріопротекто-ра, а також після розморожування. Після розморожування для достовірності проби відбиралися з кріопаке-тов. Кількість ГСК оцінювалося за фенотипом CD34 + / CD45dim / 7AAD проточної цитометрії по протоколу ISHAGE. Колонієутворюючих активність ГСК оцінювалася шляхом їх культивування протягом 14 діб (Methocult H4435) з подальшим підрахунком сумарних колоній (КУО).

результати

Згідно з представленими в таблиці 2 результатами, збереження ГСК в групах I і II після введення ДМСО

100 80 60 40 20 0

92,5

94

80,2

ll

87,6

64,6

РУЧНЕ АВТО

ГСК 7AAD KOE

Малюнок 1. Вихід гемопоетичних клітин після ручного або автоматизованого введення ДМСО і кріоконсервування за різними критеріями

розбавлення до необхідної кінцевої концентрації ДМСО в 7,5%. Результати, представлені в таблиці і на рисунку, також показують, що ДМСО на етапі його введення при експозиції може чинити більший негативний вплив на ГСК, ніж процедура заморожування трансплантата.

висновок

Збереження ГСК при використанні автоматизованої системи введення ДМСО достовірно (на 14%) вище в порівнянні з ручним способом.

Ключові слова

Гемопоетичні стовбурові клітини, кріоконсервація, дімітілсульфоксід, аутологічної трансплантація.

Autologous hematopoietic stem cell transplantation in children and teenagers with Hodgkin's lymphoma

Andrey V. Kozlov, Ilya V. Kazantsev, Elena V. Morozova, Tatiana V. Iuchta, Polina S. Tolkunova, Asmik G. Gevorgian, Mihail M. Kanunnikov, Kirill V. Lepik, Yuri R. Zalyalov, Elena V. Babenko, Maria A. Estrina, Natalia B. Mikhailova, Ludmila S. Zubarovskaya, Boris V. Afanasyev

Raisa Gorbacheva Memorial Institute for Children Oncology, Hematology and Transplantation at the First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University, St. Petersburg, Russia

Contact: Dr. Andrey V. Kozlov E-mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. Вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її.

Introduction

Standard therapy cures 70-90% of patients with Hodgkin's lymphoma (HL). Autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) is an effective treatment option in chemosensitive relapsed or refractory disease. Despite long-term experience the data on the role of auto-HSCT in children are limited.

Materials and methods

Between 1993-2017, sixty-six HL patients at the median age of 16 (4-18) received auto-HSCT. Nodular sclerosis was diagnosed in 59 patients (89%), mixed cellularity type, in 6 (9%), lymphocyte depletion form, in 1 (2%). Clinical stage IV was assessed in 29 patients (44%), stage III, in 18 (27%), stage II, in 17 (26%), stage I, in 2 cases (3%); B symptoms were documented in 43 cases (65%). Relapsing course of the disease was revealed in 45 children and teenagers (68%), and refractory disease was confirmed in 21cases (32%). First-line therapy was carried out according to GPOH-HD protocol in 37 patients (56%); BEACOPP was applied in 21 cases (32%); ABVD, in 8 cases (12%). Second-line therapy included IEP / ABVD in GPOH-HD group, and DHAP or ICE in BEA-COPP or ABVD groups. Early HL relapses (<12 months) were diagnosed in 26 children and teenagers (58%), and late relapse was stated in 19 patients (42%). Median number of therapy lines prior to auto-HSCT was 2 (1 to 6). Complete remission at the moment of auto-HSCT was achieved in 25

patients (38%), partial remission, in 25 (38%), stabilization, in 6 (9%), and progression of the disease was observed in 10 (15%). The conditioning regimens included BEAM (n = 24, 36%), BeEAM (n = 22, 33%), CBV (n = 13, 20%), others (n = 7, 11%).

Results

Long-term overall survival (OS) was 48%, and progression free survival was 41%. The OS values ​​in cases of chemosen-sitive disease were 64%, and in chemoresistant disease, 33%, (p = 0.005). BeEAM and BEAM conditioning regimens have shown comparable effectiveness (OS, 62% and 51%, respectively, p = 0.6). Transplant-related mortality was 4.5%. Lethal complications were associated with infections in 2 patients and high-dose chemotherapy toxicity in 1 patient (lung fi-brosis).

Gonclusion

Auto-HSCT cures approximately half of children and teenagers with relapsed or refractory HL. Chemosensitivity of the disease is an essential factor for the success of auto-HSCT. BEAM and BeEAM conditioning regimens are equally effective in children.

Keywords

Hodgkin's lymphoma, pediatric, hematopoietic stem cell transplantation, autologous, survival rates.


Ключові слова: Hematopoietic stem cells / cryopreservation / dimethyl sulfoxide / autologous transplantation. / Гемопоетичні стовбурові клітини / криоконсервация / дімітілсульфоксід / аутологічної трансплантація.

Завантажити оригінал статті:

Завантажити